Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников Мальцева, Елена Львовна

Введение к работе

Актуальность работы. Проблема клеточной регуляции - одна из центральных в биофизике и биохимии клетки. Известно, что в клеточных мембранах существует несколько систем регуляции, изучение взаимосвязи между которыми представляет собой важный аспект данной проблемы. Системы вторичных посредников, такие как циклические нуклеотиды и фосфоинозитидный цикл, получают сигналы через клеточные мембраны, в липидах которых локализуется и система перекисного окисления липидов (ПОЛ). Между данными системами ведутся «переговоры», обеспечивающие их согласованную работу в норме, a возникающие патологические состояния сопровождаются «сбоями» в их работе. Важнейшим ферментом фосфоинозитидного цикла является липидзависимая протеинкиназа С (ПКС), фосфорилирующая целый ряд мембраносвязанных и цитоплазматических белков [Takai, 1979; Nishizuka, 1986; Rosse, 2010]. Действие вторичного посредника в данном цикле и активатора ПКС - 1,2-диацил-глицерола (ДАГ) пролонгировано мимикрируется синтетическим форболовым эфиром - 12-О- тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом (ТФА). Открытый как опухолевый промотор ТФА является универсальным модулятором и других систем вторичных посредников [Castanga, 1982; Fisher, Yanagimoto, 1989], в том числе и ПОЛ [Пальмина, 1998].

Гипотеза о сопряжении сигнала трансдукции, идущего через ПКС, с клеточной пролиферацией и активацией при канцерогенезе и опухолевом росте, высказанная ранее [Nishizuka, 1984], в настоящее время находит свое подтверждение [Mackay, 2003; Koivunen, 2005] и развитие во взаимосвязи с оксидативным стрессом и апоптозом [Gopalakrishna, 2000; Kagan, 2008]. Система ПОЛ играет при этом важную регуляторную роль. Значительно раньше была высказана и гипотеза «о свободно-радикальном механизме регуляции размножения клеток» [Бурлакова, 1967, 1968], в которой гидроперекисям отводилась роль ингибиторов, а природным антиоксидантам (АО) - активаторов клеточной пролиферации.

Среди большого количества эффекторов ПКС и ферментов «запуска» систем циклических нуклеотидов - аденилатциклазы (АЦ) и гуанилатциклазы (ГЦ) и функционально взаимосвязанных с ними, в частности, опиоидных рецепторов (ОПР), наше внимание привлекли ненасыщенные фосфолипиды (ФЛ) и свободные жирные кислоты (СЖК), участвующие в системе ПОЛ в качестве субстратов окисления.

Для функционирования и взаимосвязи систем вторичных посредников важно физико-химическое состояние клеточных мембран и такие свойства как кооперативность и гетерогенность, которые в значительной степени определяются липидным бислоем, в частности, такими его структурными характеристиками как микровязкость и жесткость различных его областей. Современные представления о рафтах и микродоменах в плазматических мембранах (ПМ) подтверждают, что такие структуры могут обладать уникальными свойствами и усиливать действие сигнальных веществ на клеточные мембраны [Quinn, 2004; Muniz, 2001]. Вероятно, что в них локализуются ферменты и рецепторы, в том числе и ПКС [Pike, 2003].

Известно, что липиды клеточных мембран постоянно подвергаются окислению. Изменения параметров ПОЛ могут приводить к модификации активности ферментов и рецепторов in vivo и in vitro. Природные АО, основной из них - а-токоферол (ТФ) и синтетические АО, в частности - калиевая соль фенозана (ФК), регулируют ПОЛ в мембранах [Kagan, 1991; Пальмина, 2003], влияют на структурное состояние липидов путем встраивания ТФ в мембраны [Quinn, 1995] и активность ферментов как эффекторы [Бурлакова, 1982; Azzi, 1992].

С точки зрения клеточной регуляции особое значение приобретают концентрационно-зависимые эффекты сигнальных веществ и модуляторов систем вторичных посредников и ПОЛ в мембранах. Кинетические особенности их действия создают мембранный уровень регуляции.

Одной из «пограничных» проблем современной биологии является

обнаружение эффектов сверхмалых доз (СМД- менее 10^-11-10^-12М) химических веществ различной природы [Бурлакова, 1999, 2001], полученных на разных иерархических уровнях биологических объектов. Развитие этой области открывает новые перспективы в решении фундаментальных вопросов клеточной регуляции, а также имеет практическую направленность для создания лекарственных препаратов в СМД.

Таким образом, исследование действия модуляторов систем вторичных посредников в широком диапазоне концентраций на клеточные мембраны и ферменты является актуальным: во-первых, для понимания механизмов их действия; во-вторых, для установления роли ПОЛ во взаимосвязи систем вторичных посредников; в-третьих, для развития нового научного направления - биологических эффектов СМД химических веществ на мембранном уровне.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении роли кинетических изменений основных параметров ПОЛ - концентрации продуктов окисления и АО, микровязкости липидов клеточных мембран в регуляции активности ключевых ферментов систем вторичных посредников и рецепторов, в особенности - липидзависимой ПКС.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменение активности ПКС при действии ФЛ и СЖК различной степени окисленности in vitro и выявить кинетические закономерности изменения активности фермента от продуктов ПОЛ.

2. Исследовать влияние природного АО - ТФ в широком диапазоне концентраций на активность ПКС in vitro. Описать кинетический механизм действия ТФ на ПКС в больших концентрациях и СМД.

3. Изучить влияние ТФ в широком диапазоне концентраций до СМД на микровязкость и термоиндуцированные структурные переходы (ТСП) клеточных мембран. Выявить роль полярности растворителя. Выяснить взаимосвязь изменений микровязкости липидов мембран и активности ПКС.

4. Исследовать действие синтетического АО из класса экранированных фенолов - Р-(4-гидрокси-3,5-дитретбутилфенил) пропионовой кислоты (фенозана) в его водорастворимой форме - калиевой соли (ФК) в широком диапазоне концентраций на активность ПКС в ПМ мембранах нормальных и опухолевых клеток, растущих в культуре.

5. Изучить влияние ФК и СЖК на активность ферментов - АЦ и ГЦ системы циклических нуклеотидов, а также микровязкость липидов ПМ in vitro.

6. Изучить влияние 4-метил-2,6-ди-трет-бутилфенола (ионола) in vivo на активность АЦ, уровень ПОЛ, микровязкость и ТСП в липидах ПМ. Выявить характер взаимосвязи между этими параметрами.

7. Изучить действие форболового эфира (ТФА) в широком диапазоне концентраций вплоть до СМД in vitro на микровязкость различных областей липидов клеточных мембран в норме, а также опухоли - асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Сравнить действие ТФА и его неактивного аналога - 4-а- форбол-12,13-дидеканоат (ДДФ).

8. Исследовать изменения микровязкости и ТСП в липидах различных фракций мембран эндоплазматического ретикулума (ЭР) при действии ТФА на трансформированную линию клеток, растущих в культуре.

9. Исследовать влияние СЖК разной степени ненасыщенности, жиро- и водорастворимых АО на микровязкость синаптических мембран (СМ) головного мозга in vitro. Выяснить роль микровязкости в инактивации ОПР.

10. Изучить кинетические закономерности действия гормонов различной природы: белковых (инсулина и глюкагона) и стероидного (простагландина E₂), стимуляторов G-белков - гуанииловых нуклеотидов и АО (ионола) на микровязкость липидов ПМ in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту.

10. 1. ПКС - пероксилипидзависимый фермент. Кинетические закономерности действия продуктов ПОЛ - ингибиторов ПКС как новый механизм регуляции активности основного фермента фосфоинозитидного цикла.

    2. Бимодальная зависимость «доза - эффект» при действии АО в широком диапазоне концентраций: ТФ как природного ингибитора активности ПКС и синтетического ФК как суперактиватора фермента в мембранах нормальных и опухолевых клеток. Кинетическая схема действия ТФ на активность ПКС.

    3. Полимодальная зависимость «доза-эффект» действия ТФ на микровязкость и жесткость липидов клеточных мембран in vitro. Роль полярности растворителя в эффектах СМД.

    4. Универсальный модулятор систем вторичных посредников и опухолевый промотор - ТФА как модификатор структурного состояния липидов клеточных мембран нормальных и опухолевых клеток в широком диапазоне концентраций.

    5. Синтетические АО (ФК и ионол) как модуляторы активности ключевых ферментов системы циклических нуклеотидов - АЦ и ГЦ in vitro и in vivo.

    Разнонаправленность изменений активности ферментов в мембранах мозга и печени.

    10. 6. Корреляция изменений микровязкости (или жесткости) поверхностных областей липидов мембран с активностью ферментов систем вторичных посредников (ПКС и АЦ) и инактивацией ОПР при действии АО и СЖК.

        7. Кинетические закономерности действия различных гормонов и стимуляторов G-белков на микровязкость липидов ПМ. Неспецифичекое связывание лигандов на мембране как косвенное доказательство существования «липидных» центров (рафтов).

        Научная новизна. Впервые обнаружено, что ПКС - это пероксилипид- зависимый фермент, для которого продукты ПОЛ по кинетическим критериям являются аллостерическими ингибиторами, обладающими положительной кооперативностью и высоким сродством к ферменту. Обнаружено антагонистическое взаимодействие между окисленными формами эффекторов (ФЛ и АК), которое представляет собой механизм «демпинга».

        Впервые обнаружено бимодальное действие АО (ТФ и ФК) на активность фермента в широком диапазоне концентраций с максимумами при концентрациях эквивалентных физиологическим и СМД. Предложена кинетическая схема, описывающая бимодальную зависимость «доза - эффект» (на примере ТФ). Установлено, что ТФ - аллостерический ингибитор активности ПКС, а ФК - суперактиватор фермента в ПМ нормальных и опухолевых клеток. Показано, что опухолевые клетки обладают дополнительными возможностями для активации мембраносвязанной ПКС.

        Показано противоположное действие синтетических АО (ФК и ионола) на ферменты «запуска» систем циклических нуклеотидов - АЦ и ГЦ, имеющее разнонаправленный характер в мембранах клеток печени и мозга in vivo и in vitro.

        Впервые показано полимодальное действие ТФ и универсального модулятора систем вторичных посредников - ТФА в широком диапазоне концентраций вплоть до СМД на микровязкость и жесткость клеточных мембран in vitro. Установлено, что ТФА является двойным модификатором структурного состояния липидов клеточных мембран, проявляющим свойство опухолевого промотора на мембранном уровне.

        Впервые выявлена роль полярности растворителя (воды) при действии СМД (на примере ТФ) на клеточные мембраны in vitro.

        Установлена корреляция между изменениями активности основных ферментов систем вторичных посредников, а также связанных с ними рецепторов на примере ОПР и жесткости (микровязкости) поверхностных областей липидов липидов клеточных мембран при действии модуляторов системы ПОЛ АО и СЖК in vitro и in vivo.

        Впервые продемонстрированы кинетические закономерности действия различных гормонов: белковых (инсулина и глюкагона) и стероидного - ПГЕ₂,

        а также стимуляторов G-белков на микровязкость липидов ПМ in vitro. Предложена феноменологическая модель и вычислены кинетические параметры связывания гормонов и стимуляторов с мембраной, на основании которых показано наличие их неспецифического связывания с ПМ.

        Сопокупность проведенных исследований позволяет сформулировать создание нового научного направления «взаимосвязь систем вторичных посредников и ПОЛ».

        Научно-практическая значимость работы. В результате проведенных в работе фундаментальных исследований по выяснению физико-химических и кинетических закономерностей в регуляции ключевых ферментов систем вторичных посредников и рецепторов было установлено, что изменения их активности взаимосвязаны с изменениями параметров ПОЛ, такими как продукты ПОЛ, концентрация АО и микровязкость (или жесткость) липидов клеточных мембран.

        Полученные кинетические закономерности действия различных модуляторов на мембраны и ферменты могут быть использованы при разработке новых схем применения лекарственных препаратов, влияющих как на системы вторичных посредников, так и ПОЛ. Установленные в работе дозовые зависимости полимодального типа и эффекты СМД при действии АО на мембраны и ферменты, позволяют разрабатывать комбинированные лекарственные препараты на основе АО в СМД. Это может уменьшать побочное влияние (токсичность, структурные и морфологические повреждения и другие) обычно применяемых для лечения доз препаратов, а также усиливать или ослаблять действие других лекарственных веществ в комбинированной терапии различных патологий. В частности, применение ТФ при лечении сердечно-сосудистых патологий, а также онкологических заболеваний для снятия кардиотоксичности противоопухолевых препаратов может быть не менее эффективным в СМД и более щадящим для организма в целом.

        Результаты, полученные на лабораторных животных, дают основание для дальнейшей разработки комплексной терапии с направленной модификацией мембран различных органов и изменением активности основных ферментов систем вторичных посредников, являющихся мишенью действия ряда препаратов сердечно-сосудистого типа и противоопухолевого действия.

        Обнаруженное в работе ингибирование продуктами ПОЛ и ТФ активности ПКС дает принципиально новое объяснение важной роли данного природного АО в регуляции пролиферации клеток в норме и опухолевом росте, основанное на концентрационно-зависимом эффекте изменения активности данного фермента.

        Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ Отделения химии и наук о материалах РАН. Экспериментальные исследования, вошедшие в состав данной диссертационной работы, были поддержаны на разных этапах:

        Всесоюзной программой «Биоантиоксидант», Программой СЭВ по «Биофизике», двусторонним сотрудничеством с Институтом биофизики Болгарской Академии наук, персональным грантом ЮНЕСКО в области фундаментальных работ по молекулярной и клеточной биологии, Биохимическим Обществом Норвегии, грантами Президиума РАН «Биомолекулярная и медицинская химия».

        Личный вклад соискателя состоял в разработке методологии исследования, определении задач и выборе методов их решения, проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. Основные результаты, изложенные в автореферате, получены при определяющем вкладе автора. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

        Апробация диссертации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 126 печатных работах, из них 64- научные труды, 53 из которых в рецензируемых российских и международных журналах.

        Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 70-ти Международных и Российских симпозиумах, конференциях, съездах и конгрессах: 4, 5^ая Всесоюзн. Конф. «Биология клетки» (Тбилиси, 1985, 1987); Всесоюзн. Симп. по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987); Intern. Symp. "Membrane lipids - metabolism and organization" (Varna, Bulgaria, 1987); 6^th CMEA Symp. ESR spectroscopy in Biochemistry, Mololecular Biology and Medicine" (Smolenia,Slovakia,1988); Conf. on Bioelectronics (Frankfurt, Germany, 1988); 2^nd Soviet-Swiss Symp."Biological Membranes (Riga, Latvia, 1988); 4-^ЬІй Всесоюзн. Симп. «Липиды биологических мембран» (Киев, 1994) 3,4^ая Всесоюзн. Симп. «Биоантиоксиданты в биологии, химии и медицине» (Москва, 1989, 1998); 2^nd Soviet-Spain Symp. "Biological Membranes: structure and function" (Kiev, 1990); 7, 8^ой Всесоюзн. ^мп. «Магнитный резонанс в биологии и медицине» (Звенигород, 1989,1991); Intern.Conf. on Biomembranes (Kaunas, Litva, 1991); Intern. Symp. "Biochemistry of receptor systems" (Tallinn, Estonia, 1991); 8^th, 9^th, 10^th Intern. Congresses on Prostaglаndins and related compounds (Montreal, Canada, 1992; Florence, Italy, 1994; Vienna, Austria, 1996); 20^th, 22^nd FEBS Meeting (Budapest, Hungary, 1990; Stockholm, Sweeden, 1992); 11^th Intern. Biophysics Congress (Budapest, Hungary, 1993); 34^th Intern. Conf. on Biochemistry of Lipids (Nooykerwijkerhout, Netherland,1993); 2^nd Intern. Congress On Ultra Low Doses (Bordeaux, France, 1993); 3^rd Intern. Conf. "Eicosanoids and Bioactive Lipids in Cancer, Inflamation and Radiation Injury" (Washington, USA, 1993); 35^th, 37^th, 38^th Intern. Conf. Biochemistry of Lipids (Aberdeen, Scotland, 1994; Antwerpen, Belgium, 1996; Assisi, Italy, 1997); 5^th Intern. Congress on PAF and Lipid Mediators (Berlin, Germany, 1995); 1^st Eur. Congress of Pharmacology (Milan, Italy, 1995); 4^th Conf. on Essential Fatty Acids (Edinburg, Scotland, 1997); 6-8^ая Междунар. Конф. "Биоантиоксидант" (Москва, 2002, 2006, 2010); G.I.R.I. Meeting (Brussels, Belgium, 2000); Intern.

        Symp. "Anno 2000: Lipid Milestone" (Utrecht, Netherlands, 2000); 11^а* Междунар. Конф. «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Звенигород, 2001); 14^th Intern. Symp. on Drug Affecting Lipid Metabolism (New York, USA,

        5. ; 5, 9^th ISSFAL Congress (Montreal, Canada, 2002; Maastricht, Holland ); 2^nd Intern. Conf. "Non-linear dose-response relations in Biology, Toxicology and Medicine" (Amherst, USA, 2002); 8^th Intern.Congr. on Phospholipids (Vienna, Austria, 2002); Intern. Symp."Lipids and Biomembranes" (Davos, Switzerland,

        6. ; 3, 4^ЬШ Междунар. симп. «Механизмы действия СМД» (Москва, 2002, 2008); 3^ий Съезд Биофизиков России (Воронеж, 2004); 42 - 46^th, 48 - 52^nd Intern. Conf. on Bioscience of Lipids (Bergen, Norway, 2001; Graz, Austria, 2002; Oxford, UK, 2003; Ioannina, Greece, 2004; Ajachi, France, 2005; Turku, Finland, 2007; Maastricht, Holland, 2008; Regensburg, Germany, 2009; Bilbao, Spain; 2010); WCDA Paul Ehrlich's Conf. (Nurenberg, Germany, 2004); 1^st FEBS Workshop of Lipids (Dijon, France, 2005); Intern. Symp. "Lipids, Liposomes and Biomembranes 2005: New Technologies" (Vancouver, Canada, 2005); Workshop "Protein-Lipid Interactions" (Dubrovnik, Croatia, 2005); 8, 9^th Intern. Schools on Biophysics "Supramolecular structure and functions" (Rovinj, Croatia, 2003, 2006); 4^th - 8^th Euro Fed Lipid Congresses (Madrid, Spain, 2006; Gotheburg, Sweden, 2007; Athens, Greece, 2008; Graz, Austria, 2009; Munich, Germany, 2010); Междунар. Конф. «Рецепция и внутриклеточная cигнализация» (Пущино, 2009); 4, 5-м Междунар. Конгрессах «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006, 2009); FEBS Advanced Course "Lipid Signaling and Disease" 9-15 September.2009. Ortona, Italy.

        Похожие диссертации на Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников

        

        Нелинейная динамика границы мишени под действием интенсивных потоков заряженных частицМайер Александр Евгеньевич

        Действие лазерного излучения на мишень при развитии газофазных процессовДорофеев, Илларион Анатольевич

        Анизотропные акустооптические дефлекторы и модуляторы света для систем записи и воспроизведения информацииТрубецкой, Анатолий Васильевич

        Электрооптические модуляторы в волоконно-оптических системах передачиКолодезная, Галина Викторовна

        Моделирование двухкомпонентной автоволновой среды оптическими системами с пространственно-временными модуляторами света на основе структур полупроводник-ЖКРахманов, Андрей Николаевич

        Оптимизация характеристик интегрально-оптического модулятора Маха-Цендера для аналоговых систем обработки информацииТавлыкаев, Роберт Фуатович

        Защитное действие модуляторов эндогенной каннабиноидной системы при экспериментальной церебральной ишемииГенрихс, Елизавета Евгеньевна

        

        Управление инвестиционной деятельностью финансовых посредников в системе российского фондового рынка Медведева Наталья Викторовна

        

        Централизованная библиотечная система как информационный посредник в научных исследованиях (На примере Библиотеки по естественным наукам Российской Академии наук) Солошенко Наталия Сергеевна

        

        Коммерческие банки как финансовые посредники в воспроизводственной системе переходной экономикиМосквитин Владимир Николаевич