Введение к работе
Актуальность исследования
Программируемая смерть клеток (апоптоз) играет важную роль в морфогенезе и в развитии патологических состояний. Центральным событием в развитии апоптоза, как правило, является выход цитохрома с из митохондрий с последующим запуском каскада апоптотических реакций в клетке. Выход цитохрома с (Цит) становится возможным благодаря повреждению внутренней мембраны в результате перекисного окисления липидов (Kagan et al., 2005), при этом пусковым механизмом служит превращение цитохрома в пероксидазу при его взаимодействии с кардиолипином (КЛ). К сожалению, как структура комплекса цитохрома с с кардиолипином, так и механизм его пероксидазного действия на органические молекулы, в том числе на липиды, пока мало изучены. В данной работе проведено исследование структуры и состава комплекса цитохрома с с кардиолипином, изучена пероксидазная функция этого комплекса в разных условиях. Показано, что этот комплекс обладает способностью разлагать липогидропероксиды с образованием пероксильных радикалов и липопероксидазным действием. Исследовано влияние антиоксидантов на реакции, катализируемые комплексом Цит-КЛ. Полученные результаты помогут в будущем разработать методы управления апоптозом, что имеет большое значение для лечения ряда важнейших патологий.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных данных и разработки новых аналитических методик. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить состав и структуру комплекса цитохрома с с кардиолипином.
-
Изучить пероксидазную функцию комплекса цитохрома с с
кардиолипином и жирными кислотами.
-
Исследовать взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами, а так же влияние пероксида водорода на данное взаимодействие.
-
Исследовать влияние антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ и на взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами.
Научная новизна исследования
В данной работе было показано, что цитохром с образует с кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде. Было определено молярное соотношение КЛ:Цит в комплексах, полученных при различных значениях рН, и показано, что могут формироваться два устойчивых комплекса, один в нейтральной, в другой - в кислой среде (при рН меньше 5,5). Оценено значение растворимости. Показана возможность перехода этого комплекса в гидрофобную среду и определен состав комплекса в гидрофобной среде.
Впервые была изучена структура осадка комплекса Цит-КЛ при различных рН среды методами малоуглового рентгеновского рассеяния. Полученные данные подтвердили вывод о существовании двух типов комплексов, имеющих разное соотношение КЛ:Цит и соответственно разный диаметр наносфер, которые в водном растворе образуют микрокристаллы с различными расстояниями между отражающими плоскостями. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ при различных рН среды.
Впервые методом активированной хемилюминесценции показана способность комплекса цитохрома с с липидами разлагать липогидропероксиды с образованием свободных липопероксильных радикалов. Показана способность комплекса окислять жирную кислоту пероксидом водорода с образованием липопероксильного радикала (липопероксидазная функция комплекса).
Изучено влияние водорастворимых антиоксидантов на пероксидазную
активность комплекса цитохрома с с кардиолипином и на образование
липопероксильных радикалов при разложении гидропероксидов липидов комплексом цитохрома с с линолевой кислотой (Цит-ЛК).
Практическое значение работы
Основным результатом работы является углубление фундаментальных знаний о начальной стадии программируемой смерти клетки.
Данные о структуре комплекса цитохрома с с кардиолипином и механизме реакций, которые он катализирует, имеют решающее значение для контроля апоптоза с целью профилактики и лечения болезней человека.
Автором были разработаны или усовершенствованы ряд аналитических хемилюминесцентных методик для определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и количества липидных гидропероксидов в системе. Все эти методы могут найти применение в лабораторной практике.
Полученные данные могут быть использованы при преподавании курсов медицинской биофизики в медицинских вузах и университетах.
Положения, выносимые на защиту
-
Комплекс Цит-КЛ представляет собой соединение определенного состава, малорастворимое в воде и хорошо растворимое в гидрофобной среде, причем состав комплекса и структура осадка зависит от рН среды.
-
Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других пероксидаз; пероксидазная активность комплекса на два порядка величины меньше активности пероксидазы из корней хрена. Пероксидазной функцией также обладает комплекс цитохрома с с линолевой кислотой.
-
Комплексы цитохрома с с кардиолипином или с линолевой кислотой катализируют реакцию разложения липидных гидропероксидов, при этом образуются свободные радикалы и вторичные продукты перекисного окисления. Было показано образование пероксильных радикалов при окислении липидов пероксидом водорода, катализируемое комплексом цитохрома с; таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает
липопероксидазной активностью.
4. Антиоксиданти действуют на пероксидазную функцию Цит-КЛ путем взаимодействия с продуктом реакции свободных радикалов со вторым субстратом (люминолом). Антиоксиданти также действуют на реакции образования липопероксильных радикалов при разложении липидных гидропероксидов.
Внедрение результатов
Разработанные хемилюминесцентные методики определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и определения липидных гидропероксидов в водной среде являются частью практического курса кафедры медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. Полученные данные о структуре и свойствах комплекса Цит-КЛ являются составной частью лекционных курсов указанной кафедры.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личное участие автора
Все данные в диссертации, были получены лично автором; в немногих случаях, когда в работе участвовали также и другие сотрудники, это специально оговорено в тексте диссертации. С этой целью автор освоил все используемые в работе методы. Лично автором проведена также и обработка и статистический анализ результатов.
Апробация работы
Основные результаты диссертации были представлены в устных докладах, а также тезисах трех конференций, среди которых: Пироговская студенческая научная медицинская конференция (Москва, 2011); 9-я Международная специализированная выставка по аналитической химии «Аналитика Экспо» (Москва, 2011); научный Симпозиум с международным участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012).
Диссертационная работа апробирована 17 сентября 2012 г. на совместном заседании кафедры медицинской биофизики Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова и кафедры общей и медицинской биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава РФ.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 главы результатов и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 133 источника. Работа выполнена на 128 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 88 рисунками и 5 таблицами.
