Введение к работе
Актуальность темы. Метионин - незаменимая аминокислота, которая играет исключительно важную роль во внутриклеточном метаболизме. Метионин необходим для инициации трансляции и синтеза белковых молекул, а также является единственным субстратом для синтеза S-аденозилмстионина (AdoMct), универсального донора метальных групп и предшественника в синтезе полиаминов (Рис. 1). AdoMet зависимое метилирование лежит в основе регуляции важнейших внутриклеточных процессов, включая регуляцию экспрессии генов, регуляцию активности ферментов и т.п. Воспроизводство метионина из гомоцистеина в метионинсинтазной реакции сопряжено с превращением 5-метилтетрагидрофолата (циркулирующей формы фолиевой кислоты) в тетрагидрофолат, необходимый для синтеза ДНК (Рис. 1). В ряде клеток и тканей (в том числе в печени) метионин может использоваться для синтеза цистеина, который, в свою очередь, является субстратом для синтеза основного внутриклеточного антиоксиданта - глютатиона. Таким образом, метаболизм метионина тесно связан с окислительно-восстановительным метаболизмом. Независимое функционирование метаболических систем, связанных с метаболизмом метионина, требует эффективной и жесткой регуляции. Неудивительно, что нарушения в метаболизме метионина связаны с целым рядом серьезных патологий, таких как дефекты развития нервной трубки [Beaudin and Stover 2009], онкологические заболевания [Lu and Mato 2008], сердечно-сосудистые заболевания [Yamada et al. 2008] и нейродегенеративные заболевания [Zoccolella et al. 2010]. Многие нарушения в метаболизме метионина приводят к росту концентрации гомоцистеина (промежуточного продукта метаболизма метионина) в плазме крови. Показано, что повышение концентрации гомоцистеина в плазме крови является независимым и достоверным фактором риска возникновения осложнений беременности [Vollset et al. 2000], патологий развития плода, в частности, синдрома Дауна [James et al. 1999] и дефектов развития нервной трубки [Beaudin and Stover 2009], смертности от сердечнососудистых заболеваний [Vollset et al. 2001], развития нейродегенеративных заболеваний, в первую очередь болезни Альцгеймера и Паркинсона [Mattson and Shea 2003]. Однако механизмы, обеспечивающие связь высокого уровня гомоцистеина с патологиями, остаются невыясненными.
Важным источником информации для анализа патологий, связанных с нарушениями в метаболизме метионина, являются дефициты ферментов метаболизма метионина у человека. Правильная интерпретация последствий дефицита ферментов метаболизма метионина также требует понимания нормальной регуляции этого метаболизма.
Большинство раковых клеток демонстрирует метионинсвую зависимость -
-L
-и Methionine ^"
МАТІ*
MGA Methylases
Folate Pool
MTHFRJ- - ""M:
Hey *—*"
MTHF
* _ - - / G,v
A'" ' л
BHMT
Betaine /
' AHC
i. ^/- I J
AdoHcy
Hepatocyte
Рис. 1. Схема метаболизма метионина в печени. Широкими стрелками показаны реакции
ферментов, формирующих уникальный ферментный профиль метаболизма метионина в печени. Широкими черными стрелками показаны реакции ключевых ферментов, функционирующих в режиме необратимого разрушения метионина, более светлыми стрелками - реакции ферментов, функционирующих в режиме сохранения метионина в клетке. Обозначения метаболитов: AdoMet - S-аденозилметионин, MGA - акцептор метальных групп, Gly - глицин, AdoHcy - S-аденозилгомоцистеин, Нсу - гомоцистеин, MTHF - 5-метилтетрагидрофопат, DMG - диметилглицин, Cys - цистеин, GSH -глютатион. Обозначения ферментов: МАТ - метионин аденозилтрансфераза, GNMT -глицин N-метилтрансфераза, Methylases - внутриклеточные метилазы, АНС -аденозилгомоцистеиназа, ВНМТ - бетаин гомоцистеин S-метилтрансфераза, MS -метионин синтаза, MTHFR - метилентетрагидрофолат редуктаза, CBS - цистатионин Р-синтаза, CSE - цистатионаза. Пунктирными стрелками показано аллостерическое регуляторное влияние метаболитов на скорость работы соответствующих ферментов. Открытыми пунктирными стрелками показана активация, закрытыми - ингибирование. Реметилированием называется совокупность реакций, обеспечивающих превращение гомоцистеина в метионин, транссульфурированием - гомоцистеина в цистеин.
гибель или снижение скорости деления при замене метионина его непосредственным предшественником, гомоцистеином (рис. 1) [Hoffman 1982]. Причина такой ауксотрофии не вполне ясна. Разработано несколько терапевтических стратегий, использующих явление метиониновой зависимости для избирательного подавления роста опухолевых клеток [Stankova et al. 2008]. Исследование регуляции метаболизма метионина в нативных и раковых клетках может привести к повышению
эффективности существующих методик, а также к разработке новых стратегий в противоопухолевой терапии, использующих различия в метаболизме метионина между нормальными и опухолевыми клетками.
Актуальность исследования регуляции метаболизма метионина также связана с результатами программы обязательного обогащения (фортификации) продуктов питания фолиевой кислотой, запущенной в 1998 году в США [U.S. Food and Drug Administration, 1996]. По данным рандомизированных исследований, проведенных в начале 90-х годов прошлого века в Европе [Czeizel and Dudas 1992], увеличение потребления фолиевой кислоты женщинами в период зачатия значительно снижает вероятность дефекта нервной трубки у ребенка. Драматическое снижение частоты рождения детей с дефектами нервной трубки, зарегистрированное после начала действия программы фортификации в США [Honein et al. 2001; Ray et al. 2002], является первым примером эффективной профилактики врожденного заболевания. Однако, все большее количество исследований показывает, что повышение потребления фолиевой кислоты могло спровоцировать рост абсолютного числа случаев рака толстой кишки, совпавший с началом действия программы [Cole et al. 2007; Mason et al. 2007]. Несмотря на многочисленные исследования, последствия фортификации и целесообразность обязательного обогащения продуктов питания всего населения фолиевой кислотой до сих пор остаются предметом дискуссии [Lucock and Yates 2009].
Таким образом, изучение метаболизма метионина имеет большое значение для понимания нормальной регуляции внутриклеточного метаболизма, для понимания молекулярных механизмов развития многих патологий, а также для решения целого ряда медицинских проблем.
Ключевая роль в регуляции уровня метионина в крови принадлежит печени [Shinohara et al. 2006; Wilson et al. 2009]. Метаболизм метионина в печени характеризуется уникальным тканеспецифическим ферментным профилем (рис. 1). В клетках печени одновременно экспрессируются две изоформы метионин аденозилтрансферазы (МАТ), МАТІ и МАТЗ, в то время как в других органах и тканях экспрессируется МАТ2. Зависимость скорости реакции МАТЗ от концентрации продукта (AdoMet) противоположна той, которую демонстрируют МАТІ и МАТ2, AdoMet ингибирует МАТІ, МАТ2 и активирует МАТЗ (рис. 1). Для печени также характерно исключительно высокое содержание глицин N-метилтрансферазы (фермента, который катализирует бесполезную, на первый взгляд, реакцию), бетаин гомоцистеин S-метилтрансферазы и цистатионин Р-синтазы. Таким образом, интересной особенностью метаболизма метионина в печени является существование параллельных путей превращения метаболитов на нескольких участках метаболического пути (рис. 1). Физиологическая роль такого дублирования до сих пор оставалась неясной.
В нашей лаборатории была предложена гипотеза, объясняющая все описанные выше особенности метаболизма метионина в печени в рамках довольно простых представлений о регуляции этой системы. Согласно этим представлениям метаболизм метионина в клетках печени функционирует в двух режимах. При низких концентрациях метионина работают, в основном, ферменты, изображенные на рис 1 оттенком черного. Эти ферменты обеспечивают воспроизводство и сохранение метионина в клетке. При концентрациях метионина выше физиологической концентрации метаболитов и скорости метаболических процессов резко меняются, и клетка переключается на превращение избытка метионина в цистеин и глютатион. Было предположено, что такая регуляция обеспечивает гомеостаз метионина -поддержание его концентрации в крови на примерно постоянном уровне. Одной из целей данной работы являлась экспериментальная проверка этой гипотезы.
Цель работы: Экспериментальное исследование зависимости метаболизма метионина в свежевыделенных гепатоцитах мыши и крысы от концентрации метионина в диапазоне наблюдаемых in vivo изменений концентрации метионина в крови.
Задачи исследования:
-
Исследовать распределение метионина между клетками и средой в суспензии свежевыделенных крысиных гепатоцитов в диапазоне наблюдаемых in vivo изменений концентрации метионина в крови.
-
Исследовать зависимость стационарных концентраций S-аденозилметионина, S-аденозилгомоцистеина и скорости потребления метионина от концентрации метионина в суспензии свежевыделенных гепатоцитов мышей и крыс в физиологическом диапазоне концентраций метионина 40-400 мкМ.
-
Сопоставить экспериментальные зависимости стационарной концентрации S-аденозилметионина и скорости потребления метионина от концентрации метионина с результатами анализа математических моделей метаболизма метионина.
Научная новизна. Подтверждено прямыми измерениями концентрации метионина в клетках и инкубационной среде, что транспорт метионина через мембрану свежевыделенных крысиных гепатоцитов является быстрым, пассивным и обратимым. Показано, что транспорт-метионина в гепатоцитах крысы обеспечивает практически равномерное стационарное распределение метионина между клетками и средой в диапазоне концентраций 60-1500 мкМ.
Впервые исследованы экспериментально зависимости стационарных концентраций AdoMet, AdoHcy и скорости потребления метионина от концентрации
метионина в свежсвыделснных мышиных и крысиных гепатоцитах в физиологическом диапазоне концентраций метионина 40-400 мкМ. Обнаружено, что повышение концентрации метионина в узком диапазоне концентраций 50-100 мкМ приводит к резкому 5-10-кратному росту стационарных концентраций AdoMet, AdoHcy и скорости потребления метионина, что соответствует предсказаниям простой математической модели метаболизма метионина в печени [Martinov et al. 2000]. Вне зоны резкой зависимости метаболизма метионина от концентрации метионина стационарные концентрации метаболитов и скорость потребления метионина относительно слабо зависят от его концентрации. Резкий рост скорости потребления метионина в узком диапазоне концентраций (50-100 мкМ) предполагает переключение метаболизма с режима сохранения (рециркуляции) метионина в клетке, на режим необратимого разрушения метионина, т.е. с реметилирования на транссульфурирование (рис. 1). Таким образом, впервые экспериментально показана возможность регуляции метаболической системы за счет триггерного переключения метаболического потока между параллельными метаболическими путями, обусловленного аллостерическими взаимодействиями в системе.
Научно-практическое значение. В настоящей работе экспериментально показана возможность существования двух режимов метаболизма метионина в печени, переключение между которыми регулируется концентрацией метионина. Этот результат подтверждает новые представления о механизмах регуляции метаболизма метионина, которые могут лечь в основу понимания механизмов нарушений, возникающих при дефицитах ферментов метаболизма метионина у человека. Скачкообразная регуляция метаболизма метионина в нормальных гепатоцитах, обнаруженная в нашей работе и отсутствие такой регуляции в клетках гепатомы (показанное в работе [Prudova et al. 2005]) может послужить основой для разработки новых методов избирательного уничтожения клеток опухолей печени.
Положения, выносимые на защиту:
-
Путем прямого измерения концентрации метионина в клетках и среде показано, что транспорт метионина через мембрану свежевыделенных крысиных гепатоцитов является быстрым, пассивным и обратимым.
-
Транспорт метионина в гепатоцитах крысы обеспечивает практически равномерное стационарное распределение метионина между клетками и средой в диапазоне концентраций 60-1500 мкМ.
-
В диапазоне физиологических концентраций метионина 40-400 мкМ обнаружена узкая зона (50-100 мкМ) резкой зависимости метаболизма метионина в гепатоцитах от его концентрации. Повышение концентрации метионина внутри этой зоны приводит к резкому росту стационарной концентрации S-аденозилметионина, S-аденозилгомоцистеина и скорости
потребления метионина в гепатоцитах приблизительно в 10 раз. До и после зоны резкой зависимости метаболизма метионина от его концентрации стационарные концентрации метаболитов и скорость потребления метионина относительно слабо зависят от концентрации метионина. 4. Экспериментально подтверждена гипотеза о существовании двух устойчивых режимов метаболизма метионина в печени, переключение между которыми регулируется концентрацией метионина.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на 31st FEBS Congress: Molecules in Health & Disease (Istanbul, Turkey, June 24-29, 2006), на VIой Ежегодной Международной Молодежной Конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ "Биохимическая физика" (Москва, 24-27 ноября 2006 г.), на Международной Конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино МО, 5-7 июня 2007 г.), на конференции Life Sciences 2007 (Glasgow, UK, July 8-12,2007).
Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в международных рецензируемых журналах - 2; публикаций в трудах конференций и съездов - 4.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов исследования, главы 3 -описания экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 227 источников. Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией д.б.н., проф. Атауллаханов Ф.И.).
