Введение к работе
Актуальность исследования. Альфа-фетопротеин (АФП) - основной сывороточный белок эмбрионального периода развития всех млекопитающих, и, возможно, позвоночных. Он является наиболее известным опухолевым антигеном, специфичным для первичного рака печени и тератокарцином, признанный «золотым стандартом» в применении молекулярных биомаркеров в диагностике опухолей (Debruyne, 2008). Впервые АФП был обнаружен в 1956 году Берстрандом и Кзаром в сыворотке крови плода человека как белковая фракция, обладающая электрофоретической подвижностью а-1-глобулинов (Berstrand and Czar, 1956), и был иммунохимически идентифицирован Мюралем и Руле в 1961 году (Muralt and Roulet, 1961). Открытие явления биосинтеза АФП в организме взрослых особей в процессе канцерогенеза в 1963 году Г.И. Абелевым у мышей с химически индуцированной гепатомой и Ю.С. Татариновым в сыворотке крови больных первичным раком печени положило начало интенсивным исследованиям этого белка (Abelev, 1963; Татаринов, 1963). За полвека, прошедшие с того времени, выделены, очищены разными способами и охарактеризованы физико-химически и иммунохимически альфа-фетопротеины человека, мыши, крысы, кролика, морской свинки.
АФП принадлежит к семейству белков - продуктов альбуминоидных генов, тандемно расположенных у человека в 4-ой хромосоме (4qll-ql3) с характерной организацией экзонов и интронов, образуя совместно регулируемый мультигенный кластер. К белкам этого семейства относятся также сывороточный альбумин (СА), витамин Д-связывающий белок (ВДСБ) и афамин. Они обладают сходными физико-химическими свойствами и способны связывать низкомолекулярные гидрофобные лиганды и ионы металлов. Особый интерес представляет изучение эстрогенсвязывающей способности АФП, так как она определяет уровень циркулирующих в материнской сыворотке гормонов, способных оказывать фетотоксический эффект. Однако экспериментальными методами так и не удалось показать способность АФП человека (в отличие от АФП мыши и крысы) связывать свободные эстрогены. Ранее нами было показано, что АФП человека эффективно связывает иммобилизованные эстрогены. Однако строение эстрогенсвязывающего участка и механизмы их взаимодействия до сих пор оставались не изученными.
Установление пространственной структуры АФП с применением экспериментальных методов (таких как РСА и ЯМР-спектроскопия) также остается трудно разрешимой задачей. В связи с этим, компьютерное моделирование
трехмерной (3D) структуры АФП в комплексе с эстрогенами с изучением структуры лигандсвязывающего участка, механизмов взаимодействия с лигандом и анализа конформационных изменений в молекуле АФП представляет собой актуальную научную проблему.
Конформационные варианты АФП, образующиеся под воздействием различных факторов, изучаются с 1980-х годов. Однако, взаимосвязь между конформационно-динамическими изменениями и биологической активностью АФП и его пептидов, и структурно-функциональные взаимоотношения в молекуле АФП, остаются неизученными.
В многочисленных экспериментальных моделях in vitro и in vivo показано, что АФП обладает несколькими видами биологической активности и, на этом основании сформировано представление о его полифункциональности и мультимодульностью строения, т.е. существованием в его молекуле множества функционально важных участков (Mizejewski, 1997, 2004, 2010; Zaretsky and Wreschner, 2008). В составе многих регуляторных белков обнаружены короткие линейные мотивы (3-10 а.о.), способные опосредовать белок-белковые взаимодействия, участвовать в передаче сигнала внутрь клеток, регуляции клеточного цикла и др. (Hunt, 1990; Liu and Hsu, 2005; Neduva and Russel, 2005; Saito et al., 2007; Diella et al., 2008). В 1997 году A.A. Терентьевым было обнаружено наличие сходства между гептапептидным сегментом LDSYQCT, расположенным в Л^-концевой части полипептидной цепи АФП человека (а.о. 14-20 в зрелой молекуле) и обозначенным АФПі4 2о, и частью рецепторсвязывающего участка эпидермального фактора роста (ЭФР) с последовательностью LDKYACN у человека. Было сделано предположение о том, что этот сегмент представляет собой один из биологически активных участков АФП человека. Однако механизмы его функционирования и, особенно, роль отдельных аминокислотных остатков остаются до сих пор невыясненными.
Методы молекулярной динамики (МД), позволяющие получать детальные данные о структуре и механизмах внутри- и межмолекулярных взаимодействий на атомарном уровне, а также информацию о параметрах, которые трудно измерить с использованием экспериментальных методов, в настоящее время являются наиболее эффективным приемом для решения задач, описанных выше (Шайтан и соавт., 1999, 2002, 2003). Особую ценность представляет использование системного подхода в изучении структуры и функций АФП с применением комбинации как экспериментальных, так и компьютерных и вычислительных методов.
Цель исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структурно-функциональных взаимосвязей в молекуле альфа-фетопротеина человека и его биологически активных пептидов путем изучения их конформационно-динамических свойств и анализа роли отдельных аминокислотных остатков в их биологической активности.
Задачи исследования.
-
Анализ структурно-функциональных и филогенетических взаимоотношений белков семейства альбуминоидных генов;
-
Построение компьютерной 3D модели АФП человека на основании гомологии с СА и ВДСБ, молекулярный докинг эстрогена (ДЭС) в построенную модель с изучением механизмов связывания гормона;
-
Структурно-функциональное картирование АФП, ЭФР и TGF-P человека. Поиск АФПн 2о-подобных мотивов и их фрагментов в других физиологически активных белках, обнаруживаемых в компьютерных базах данных, и анализ аминокислотных замен в них;
-
Изучение методом молекулярной динамики конформапионно-динамических свойств аминокислотных остатков в составе прямых и инвертированных АФПн го-подобных мотивах и их фрагментов;
-
Выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе изменения конформационной подвижности аминокислотных остатков в изученных пептидах;
-
Тестирование биологической активности АФП, его гептапептида АФПі4 2о, его тетра- и пентапептидных фрагментов, а также изучение влияния метода выделения на биологическую активность АФП;
-
Выявление взаимосвязи между биологической активностью изученных пептидов и их конформационно-динамическими свойствами.
Научная новизна. В настоящей работе впервые получена трехмерная модель АФП человека, построенная на основе гомологии сразу с двумя белками -сывороточным альбумином и витамин Д-связывающим белком, с последующей оптимизацией модели с применением метода МД. Валидация модели путем расчетов RMSD (root mean square deviation) и оценки конформапионных и стереохимических параметров аминокислотных остатков продемонстрировала её высокое качество и надежность для осуществления последующего докинга лигандов.
Впервые осуществлен молекулярный докинг эстрогенов (ДЭС) в модель 3D структуры АФП и выявлены аминокислотные остатки, формирующие его
эстрогенсвязывающий участок, а также сделаны предположения о возможных механизмах взаимодействия между АФП и ДЭС.
Впервые использован системный подход к изучению структурно-функциональных взаимосвязей в молекуле АФП, осуществленный путем комбинированного изучения конформационно-динамических свойств его функционально важных пептидов, анализа роли аминокислотных замен в них и тестирования биологической активности полученных аналогов.
Впервые путем множественного глобального выравнивания первичных структур белков семейства альбумина у разных биологических видов выявлены диагностические для всего семейства аминокислотные остатки. В биологически важных участках АФП наблюдается наименьшая гомология с сывороточным альбумином, что может объяснять отсутствие у последнего специфических функций.
Выявлено пять функциональных классов белков, содержащих АФПі4 го-подобные мотивы, как в прямом, так и в инвертированном виде. Функциональная аннотация этих белков свидетельствует об их участии в регуляции пролиферации, апоптоза, миграции клеток, ответа на окислительный стресс во время эмбрио- и канцерогенеза. Прямые и инвертированные гептапептидные мотивы оказались связанными консенсусным октапептидным мотивом CXXGY/FXGX, образуя 22-членный структурный модуль.
Впервые изучены молекулярные механизмы, лежащие в основе конформационной подвижности гептапептида LDSYQCT (АФП14 20), являющегося одним из функционально важных участков АФП человека, а также его аналогов и пента- и тетрапептидных фрагментов, обнаруживаемых в других белках, участвующих в регуляции пролиферации и апоптоза клеток во время эмбрио- и канцерогенеза (ЭФР, TGF-p\ PSG и СЕА). Впервые выявлена взаимосвязь между гибкостью пептидного остова, оценка которой производилась по значениям характерного времени затухания и остаточной корреляции автокорреляционной функции, и биологической активностью изученных пептидов.
Практическая значимость работы. 3D модель пространственной структуры АФП человека, построенная в настоящей работе in silico на основе гомологии, создает возможности для ее использования с целью дизайна и экспериментального тестирования в условиях in vitro и in vivo новых низкомолекулярных лигандов. Подтверждена перспективность использования МД методов для изучения и предсказания гибких (или жестких) участков полипептидной цепи, что может быть использовано для создания искусственных белков и пептидов.
Предложены направления для разработки структурных и конформационно-динамических критериев для отбора коротких пептидов, созданных на основе гептапептида LDSYQCT и пента- и тетрапептидных фрагментов, которые могут иметь важное значение для практической медицины.
Усовершенствован метод выделения и очистки альфа-фетопротеина человека с сочетанием экстракции п-бутанолом, высаливания, аффинной хроматографии и гель-фильтрации для получения высокоочищенного (99% чистоты) препарата АФП, сохраняющего его нативную структуру и биологическую активность.
Новые лекарственные средства на основе изученных пептидов могут обладать потенциалом для коррекции иммунопатологических состояний, лечения инфекционно-аллергических, аутоиммунных заболеваний, а также могут найти применение в терапии эстрогенрезистентных опухолей. Более того, эти критерии могут способствовать созданию препаратов с противоположными биологическими эффектами.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Трехмерная (3D) структура АФП человека имеет U-образную форму, в которой выявляется полость, формируемая доменами I и III и содержащая участок связывания эстрогенов. Механизм образования комплекса АФП-ДЭС может включать водородные и гидрофобные взаимодействия.
-
С использованием системного подхода, комбинацией как экспериментальных, так и вычислительных и биоинформатических подходов изучены структурно-функциональные взаимоотношения и конформапионная динамика АФП человека, его эстрогенсвязывающего участка и ЭФР-подобного пептида АФПі4 2о, а также его аналогов и фрагментов.
-
Биологическая активность изученных тетра-, пента- и гептапептидов из онкофетальных белков зависит не только от физико-химических, но и конформационно-динамических свойств аминокислотных остатков, что, в свою очередь, обусловлено внутримолекулярными взаимодействиями и порядком их чередования в полипептидной цепи.
Внедрение результатов исследования. Полученные результаты и практические рекомендации применяются в учебном процессе и научно-производственной деятельности на кафедре биохимии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава РФ.
Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, доложены и
опубликованы в материалах и тезисах следующих Всероссийских и международных
конференций: VIII Всероссийский научный форум имени академика В.И. Иоффе «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (Санкт-Петербург, 2004); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Съезды общества биотехнологов России имени Ю.В. Овчинникова (Москва, 2005, 2006, 2008); IV Московский международный Биотехнологический конгресс (Москва, 2007); XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2006); конференции Российской Академии Естествознания (2005, 2006); IX международная научно-практическая конференция «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения» (Астрахань, 2013); Annual meetings of International Society of OncoBioMarkers (ISOBM), (Helsinki (Finland), Rhodes (Greece), Pasadena (California, USA), Prague (Czech Republic), Токіо (Japan), Amsterdam (Netherlands), Munchen (Germany), 2004-2011); Moscow conference on computational molecular biology (MCCMB, 2005, 2009, 2011); 38-th Congress of Federation of European Biochemical Societies (FEBS) "Mechanisms in Biology"(Saint Petersburg, Russia, 2013).
Публикации. По результатам, изложенным в диссертации, опубликовано 91 научная работа. Среди них 21 статья в рецензируемых ведущих Российских и международных научных журналах, включенных в перечень ВАК. А также 8 глав в сборниках и монографиях, включая 2 главы в монографиях, изданных в США (NOVA Publishers), и 62 работы в материалах и тезисах научных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 398 страницах и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований и их обсуждение, Заключение, Список литературы, включающий 700 наименований, из них 51 в Российских и 649 в зарубежных изданиях. Диссертация содержит 40 рисунков, 23 таблицы.
