Введение к работе
Актуальность исследования.
Одной из важных задач в области миологии является изучение цитоскелетного белка тайтина (коннектина), гигантские молекулы которого перекрывают расстояние от М-линии до Z-диска саркомера, формируя третью филамептную систему в миофибриллах [Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981]. Сердечный тайтип экспрессируется в двух изоформах: короткой N2B (-3000 кДа) и длинной N2BA (-3200-3400 кДа), для которой известно несколько вариантов альтернативного сплайсинга [Freiburg et al., 2000; Bang et al., 2001]. Исследования тайтина показали, что этот белок является одним из важнейших компонентов саркомера поперечнополосатых мышц позвоночных, выполняя множество различных функций - от участия в сборке саркомера и стабилизации его структуры на ранних этапах мнофибриллогенеза до регуляции процессов внутриклеточной сигнализации в зрелой мышце [Tskhovrebova & Trinick, 2010].
Функциональная важность тайтина в норме определяет интерес к изучению свойств этого белка при адаптационных процессах, развитие которых сопровождается изменениями в изоформном составе тайтина [LeWinter & Granzier, 2010]. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, выявили вклад тайтина в адаптацию сердца и скелетной мускулатуры человека и животных к повышенным физическим нагрузкам [Khramov et al., 2008] и к условиям реальной и моделируемой микрогравитации [Вихлянцев и Подлубная, 2008; Липец и др., 2009].
Удобной природной моделью для изучения изменений в мышцах при адаптации к условиям гипотермии, гипоксии, ишемии и оксидативного стресса является зимняя спячка, или гибернация млекопитающих. Наиболее значительные изменения в период гибернации наблюдаются в работе сердечной мышцы. Во время спячки сердце гибернантов продолжает функционировать даже при температурах, близких к 0С. У суслика Spermophilus undulatus во время торпора частота сердцебиения может составлять 4—5 ударов в минуту при температуре тела 3-5С, при этом кровяное давление падает, а объем сердечного выброса снижается в 65 раз. При пробуждении суслика частота сердечных сокращений может достигать более 400 уд/мин, что в 2-3 раза выше, чем у активного животного [Игнатьев и др., 2001]. Адаптация миокарда к
таким резким перепадам сократительной активности в течение гибернационного сезона сопровождается изменениями активности многих гибернационно-зависимых генов [Andrews et al., 1998; Fahlman et al., 2000; Storey, 2003], в том числе и гена тайтина, гиперэкспрессия которого обнаружена в миокарде сусликов Spermophilus tridecemlineatus при гибернации [Brauch et al., 2005]. В сердечной мышце гиберпиругощего медведя Ursus arctos horribilis было обнаружено увеличение содержания короткой N2B изоформы тайтина в период спячки [Nelson et al., 2008]. Однако в цитируемых работах не были проанализированы изменения в экспрессии тайтина на протяжении всего годового цикла. В литературе также отсутствуют данные по сопоставлению экспрессии тайтина на уровне мРНК с содержанием его белка. Между тем эта сведения могут внести вклад в понимание механизмов сезонной регуляции экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина и выяснение значения изменений изоформного состава тайтина в миокарде гибернантов в разные периоды зимней спячки. Поэтому одной из наших задач стало исследование экспрессии тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в течение годового цикла.
Тайтин играет важную роль не только в адаптационных процессах, но также и в патофизиологии мышц [Tskhovrebova & Trinick, 2010; LeWinter & Granzier, 2010]. В частности, обнаружены количественные изменения N2B и N2BA изоформ тайтина в сердечной мышце человека [Makarenko et al., 2004; Вихлянцев и Подлубная, 2008; Ahmad et al., 2010] и собаки [Wu et al., 2002] при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП), ишемическом поражении сердца человека [Neagoe et al., 2002], а также в гипертрофированном сердце крысы [Warren et al., 2003]. В сердце морской свинки при развитии гипертрофии было зарегистрировано увеличение транскриптов мРНК тайтина на компенсаторной стадии сердечной недостаточности, тогда как по мере прогрессирования заболевания уровень мРНК тайтина снижался [Collins et al., 1996]. Однако исследования изменений экспрессии тайтина на транскрипционном и трансляционном уровнях при гипертрофии сердца не проводились. В этой работе для изучения экспрессии тайтина на разных сроках развития гипертрофии миокарда использовали линию спонтанно-гипертензивных крыс (SHR), у которых в ответ на хроническое повышение давления и нарушение кальциевого гомеостаза формируется гипертрофия сердечной мышцы.
Знание изменений в экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина при развитии гипертрофии сердца и при адаптации миокарда к экстремальным условиям гиберпации может иметь перспективы для применения в медицинской практике.
Цель работы.
Исследование экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в течение годового цикла и крыс линии SHR при развитии гипертрофии.
Задачи:
-
Исследовать изоформный состав тайтина в миокарде зимоспящих сусликов в течение годового цикла.
-
Проанализировать сезонные изменения в экспрессии тайтина на уровне мРНК-транскриптов в сердце зимоспящих сусликов.
-
Исследовать изоформный состав тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс на разных сроках развития сердечной гипертрофии.
-
Провести сравнительное исследование экспрессии гена тайтіша в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс на разных сроках развития гипертрофии сердца.
Научная новизна работы.
В работе впервые проведено исследование изменений экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина как на уровне белка, так и на уровне мРНК в миокарде зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в разные периоды годового цикла: летняя активность, осенняя активность (подготовка к спячке), гибернация, пробуждение, зимняя активность (межбаутная активность), вход в спячку. Обнаружено двукратное увеличение содержания N2BA изоформы тайтина по отношению к его N2B изоформе в предсердиях и желудочках сердца осенних активных сусликов в сравнении с содержанием этих форм тайтина у летних активных животных, что свидетельствует об активной перестройке тайтинового фенотипа в период подготовки животного к спячке. Повышенное соотношение N2BA/N2B в миокарде сусликов сохранялось на протяжении всего гибернационного сезона на фоне незначительного снижения общего содержания тайтина. Впервые при электрофоретическом исследовании образцов
миокарда осенних активных и пробуждающихся сусликов были выявлены два варианта длинной N2BA изоформы тайтина. На уровне мРНК экспрессия тайтина оказалась сниженной па всех фазах гибернационного сезона, а также в прегибернационный период осенней активности по сравнению с контрольным уровнем экспрессии у летних активных животных.
Впервые проведено исследование изменений экспрессии тайтина на уровне белка и мРНК в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс в возрасте 15 недель на ранних сроках развития гипертрофии и в возрасте 26 недель с выраженной гипертрофией сердца. В миокарде 15-недельных крыс линии SHR обнаружено двукратное снижение содержания N2B и N2BA изоформ тайтина, которое сопровождалось гиперэкспрессией гена ttn, что указывает на компенсаторную (адаптационную) стадию заболевания. На более поздних сроках развития гипертрофии сердца у 26-недельньгх SHR наблюдалось снижение содержания как белка, так и мРНК-транскриптов тайтина, что свидетельствует о декомпенсаторной (патологической) стадии болезни.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Настоящее исследование вносит вклад в понимание молекулярных механизмов развития патологии в гипертрофированном сердце крыс линии SHR и адаптации сердечной мышцы сусликов к экстремальным условиям гибернации, выявляя роль эластичного цитоскелетного белка тайтина в этих процессах. Полученные данные о дифференциальной экспрессии N2B и N2BA изоформ тайтина могут быть использованы для разработки методов ранней диагностики гипертрофических изменений при сердечно-сосудистых заболеваниях, а также тест-систем, оценивающих эффективность их лечения.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международном
междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и
интегративной медицине» (Судак, Украина, 2007 г.), XX Съезде Физиологического
общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007 г.), Международных симпозиумах "Biological
Motility" (Пущино, 2008 и 2010 гг.), 4-ом Международном междисциплинарном
конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2008 г.), VII
«Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной Дню
космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ ИМБП РАН (Москва, 2008 г.), V
Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008 г.), XXXVII Европейской мышечной конференции (London, UK, 2008 г.), 7-ом Европейском биофизическом конгрессе (Genoa, Italy, 2009 г.), 34-ом Европейском биохимическом конгрессе (Prague, Czech Republic, 2009 г.), 14-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга, 2010 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 12 тезисов.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит /// страниц машинописного текста, ^таблиц и / рисунке Список литературы включаете 5сЯісточііик
