Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Ретинальсодержащие белки
1.1.1. Общие представления о строении и функционировании ретинальных белков 14
1.1.2. Общие характеристики основных спектральных методов исследования ретинальных белков 17
1.1.2.1.Рентгеноструктурный анализ 18
1.1.2.2. Оптическая спектроскопия 18
1.1.2.2.1.Поглощение УФ-видимой области 19
1.1.2.2.2. Флуоресцентная спектроскопия 19
1.1.2.3. Колебательная спектроскопия 20
1.1.2.3.1. Резонансное комбинационное рассеяние 21
1.1.2.3.2. Инфракрасная спектроскопия 21
1.2. Бактериродопсин 22
1.2.1. Бактериородопсин – биофизическая модель 22
1.2.2. Галобактерии. Физиология и особенности строения 22
1.2.3. Пурпурные мембраны. Особенности строения 23
1.2.4. Структура и состав бактериородопсина 24
1.2.5. Хромофорный центр. Опсиновый сдвиг 26
1.2.6. Фотоцикл бактериородопсина 29
1.2.7. Молекулярные модели первичных реакций 33
1.2.8. Хромофор-белковое взаимодействие 39
1.2.8.1. Контроль реакции со стороны белка 40
1.2.8.2. Реорганизация белка в ответ на изомеризацию ретиналя 41
1.2.9. Проблемы, связанные с первичными событиями фотоцикла 44
1.3. Водородные связи 45
1.3.1. Свойства водородных связей 45
1.3.1.1. Полярность водородной связи 45
1.3.1.2. Направленность водородной связи 45
1.3.1.3. Коопреративность водородной связи 46
1.3.1.4. Подвижность протона 46
1.3.2. Водородные связи и их роль в функционировании бактериородопсина 47
1.3.3. ИК-спектроскопия в изучении роли воды и водородных связей в бактериородопсине 50
1.4. Аминокислоты 52
1.4.1. Строение и спектральные свойства аминокислот в белках 53
1.4.2. Глицин 54
1.4.2.1. Структура и полиморфные формы глицина 55
1.4.2.2. Спектральные свойства глицина 56
1.4.2.3. Влияние внешней среды на свойства глицина 56
1.4.3. Лизин 57
1.4.3.2. Строение и спектральные свойства лизина 57
1.4.3.3. Особенности поведения лизина в водном окружении 58
1 5. Оптическая нелинейность биомолекул 59
1.5.1. Физические основы оптической нелинейности 60
1.5.2. Основные поожения теории 60
1.5.3. Оптический эффект Керра 63
1.5.4. Качественное описание эффекта Керра 63
1.5.5. Нелинейные оптические свойства бактериродопсина 64
1.5.5.1. Происхождение оптической нелинейности бактериородопсина 65
1.5.6. Нелинейные оптические свойства глицина и лизина 67
Глава 2. Материалы и методы исследования 69
2.1. Объект исследования 69
2.2. Выращивание бактерий 69
2.3. Выделение пурпурных мембран 69
2.4. Приготовление пленок 71
2.5. Регистрация электронных спектров в УФ- видимой области 72
2.6. Оптические измерения с помощью видеонаблюдения 72
2.7. Рентгеноструктурный анализ кристаллов 73
2.8 Регистрация дифференциальных ИК-Фурье спектров поглощения 73
2.9. Регистрация ИК-Фурье спектров эмиссии 75
2.10. Анализ результатов 76
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 77
3.1. Разработка инфракрасного эмиссионного подхода на основе техники адсорбцион-ной ИК-Фурье спектроскопии 77
3.2. Исследование ИК-эмиссии в бактериородопсине в условиях освещения низко-интенсивным видимым светом 78
3.2.1. Изучение основны спектральных характеристик бактериородопсина в спектрах ИК-эмиссии 83
3.2.2. Изучение влияния видимого света на спектральное поведение маркерных полос С=С валентных колебаний 85
3.2.3. Изучение спектральных свойств ретинального хромофора ИК-эмиссии бактериородопсина в спектрах ИК-эмиссии в области 1700-700 см-1 88
3.3. Исследование действия видимого и инфракрасного света на спектральное поведение модельного полностью-транс изомера ретиналя в спектрах ИК-эмиссии бактериородопсина 93
3.3.1. Исследование действия инфракрасного света на спектроскопические характеристики ИК-эмиссии модельного соединения полностью-транс ретиналя в области 1700-700 см-1 при селективном возбуждении репортерных групп 93
3.3.2. Исследование возбуждения ИК-эмиссии в полностью-транс ретинале при электронном возбуждении. 97
3.3.2.1. Исследование спектральных характеристик в спектрах ИК-эмиссии полностью-транс ретиналя при электронном возбуждении вне-резонанса с полосой электронного поглощения 99
3.3.2. 2. Исследование спектральных характеристик в спектрах ИК-эмиссии полностью-транс ретиналя при электронном возбуждении в резонансе с полосой электронного поглощения 100
3.4. Исследование спектральных свойств бактериородопсина в области 2200 - 1700 см-1
3.4.1. Исследование влияния видимого света на спектральное поведение в области 2200 - 1700 см-1 в спектрах ИК-эмиссии бактериородопсина 101
3.5. Исследование действия света инфракрасного и оптического диапазона на излучатель-
ные способности аминокислот 105
3.5.1. Исследование действия инфракрасного света на спектральные характерис-тики излучения в ИК-спектрах L-лизина монохлорида при селективном колебательном возбуждении репортерных групп 105
3.5.2. Исследование действия видимого света на возбуждение ИК-эмиссии в образцах L-лизина монохлорида и глицина в условиях умеренной и низкой мощности 109
3.5. 2.1. Изучение спектроскопических характеристик ИК-эмиссии L-лизина монохлорида в растворе при воздействии видимым светом умеренной и низкой мощности 110
3.5.2. 2. Изучение спектроскопических характеристик ИК-эмиссии L-лизина монохлорида в пленке при воздействии видимым светом умеренной и низкой мощности 113
3.5.2.3. Изучение спектроскопических характеристик ИК-эмиссии глицина в растворе при воздействии видимым светом умеренной и низкой мощности 115
3.5.2.4. Изучение спектроскопических характеристик ИК-эмиссии глицина в пленке при воздействии видимым светом умеренной и низкой мощности 116
3.5.2.5. Исследование фотозависимого поведения в спектрах ИК-эмиссии лизина и глицина в области 2100-700 см-1 117
3.6. Исследование спектральных свойств в растворах L-лизина монохлорида и глицина в
электронных спектрах в ближней ультрафиолетовой и видимой областях спектра 121
3.6.1. Исследование спектров УФ-поглощения в растворах L-лизина монохлорида и
глицина 123
3.6.1. Концентрационная зависимость в спектрах УФ-поглощения растворов L-лизина монохлорида и глицина в ближней УФ- области 123
3.6.2. Исследование спектральных характреристик в спектрах флуоресценции лизина и глицина в УФ-видимой области 123
3.7. Исследование фототоиндуцированных процессов в L-лизина монохлорида и глицина в условиях освещения низко интенсивным видимым светом 126
3.7.1. Исследование динамических процессов в растворах L-лизина монохлорида и глицина при воздействии лазерного излучения низкой мощности 126
3.7.2. Исследование действия низкоинтенсивного видимого света на нуклеацию в L-лизина моногидрохлорида и глицина в не насыщенных растворах при комнатной температуре 127
3.7.4. Исследование температурных характеристик среды при
воздействии низкоинтенсивного лазера 130
Заключение 133
Выводы 136
Список литературы
- Общие характеристики основных спектральных методов исследования ретинальных белков
- Водородные связи и их роль в функционировании бактериородопсина
- Оптические измерения с помощью видеонаблюдения
- Исследование спектральных характеристик в спектрах ИК-эмиссии полностью-транс ретиналя при электронном возбуждении в резонансе с полосой электронного поглощения
Введение к работе
Введение. Актуальность проблемы
Свет, взаимодействуя с фоточувствительными или фоторецепторными системами,
такими как фотореакционные центры или родопопсинсодержащими комплексами обеспечивают живые системы информацией или энергией, необходимой для образования химических связей. Поглощение света инициирует в этих структурах движение и направленный перенос зарядов (электронов или ионов) в цепи последовательных донорно-акцепторных взаимодействий, завершающихся синтезом АТФ. Исследование молекулярных механизмов функционирования фоточувствительных биосистем является одной из наиболее важных проблем молекулярной биофизики и биохимии. Это объясняется как значимостью такого рода процессов в природных системах, так и растущим практическим интересом по применению фотоуправляемых процессов и гибридных молекулярных систем в современных информационных технологиях, в которых биологические молекулы часто используются в качестве активных сред, а свет является их ключевым элементом управления. В настоящее время эта тема очень важна так же c точки зрения практической медицины, где свет, активно используется не только как средство диагностики, но и как тонкий инструмент микрохирургического манипулирования и фотодинамической терапии.
Действие света на вещество исследуют более тысячи лет и, несмотря на столь длительную историю, механизмы взаимодействия света с веществом все еще остаются до конца не изученными. Хрестоматийные представления, привлекаемые для анализа фотобиологической активности света, основываются на предположении об избирательном характере взаимодействия излучения со сложными молекулярными биологическими системами через селективное поглощение и изменение населенностей электронных энергетических уровней в молекулах-мишенях или хромофорах. При отсутствии в системе специфических молекул-мишеней, эффект воздействия излучения на биосистему, как правило рассматривается с точки зрения нагревания вещества, при том, что в этом случае величина градиента может составлять только десятые доли градуса. Такое рассмотрение не дает понимания причины создаваемого температурным градиентом фотобиологического эффекта, как и не дает ответа на вопрос о средстве доставки энергии света к удаленным органеллам, клеткам и даже тканям, в которых регистрируется биологический эффект.
В то же время при рассмотрении фотофизического взаимодействия важно учитывать не только характеристики внешнего излучения, но и свойства самой системы, на которую оказывается воздействие. В этом отношении, полезно вспомнить, что многие биологические молекулы и структуры по своей организации являются жидкими кристаллами, т.е. они обладают жесткой стержнеобразную конформацию с большой степенью асимметрии
(отношение длины к диаметру). Между тем в физике хорошо известно, что жидкие кристаллы, достаточно легко переориентируются относительно слабыми (до нескольких милливатт) оптическими полями, вызывая сильную ориентационную нелинейность среды. Оптическое поле в такой среде может порождать пространственно-неоднородные поля пространственного заряда, напряженность которых существенно превосходит таковую самой оптической волны. Поэтому можно ожидать, что в мембранных структурах, которые по структурной организации и свойствам являются жидкими кристаллами, небольшие световые потоки способны вызывать в них перераспределение заряда и тем самым выполнять определенную регуляторную роль в функционировании системы. Опираясь на такие данные о фотофизических свойствах можно лучше понять молекулярные механизмы функционирования биологических молекул внутри живой клетки, так и сами физические механизмы фотоконтролируемого поведения биологических систем.
Бактериородопсин (БР), ретинальсодержащий, ион транспортирующий белок галобактерий H. salinarium, является известной биофизической моделью. Он является воего рода парадигмой транспортных белков и в частности, простейшей протон-транспортной системой. Процесс трансформации энергии и транспорта ионов в бактериородопсине, интенсивно исследуются в последние несколько десятилетий. БР - белок в 26 кДа, содержится в пурпурных мембранах (ПМ) галофильных архебактерий, обитающих в среде с экстремальным содержанием соли NaCl (3-4M). В аэробных условиях эти организмы синтезируют АТФ через респираторную цепь. В анаэробных условиях они синтезируют большое количество БР, светопоглощающего белка, который преобразует энергию солнечного света в химическую энергию, проталкивая протон против градиента через мембрану. Хромофором БР является молекула ретиналя, который имеет полностью транс геометрию в основном состоянии и претерпевает транс-цис изомеризацию при поглощении видимого света. Ретиналь, представляет собой полиеновую цепь, соединенную с белком через Шиффово основание в положении лизина 216. Первичное фотособытие термально запускает целый каскад событий, включая серию спектрально различимых интермедиатов, в течение которых Шиффово основание отдает свой протон во внеклеточный канал и затем забирает протон из цитоплазматического канала. В течение 10-20 миллисекунд ретиналь реизомеризуется обратно в полностью-транс форму и БР уже готов к новому циклу. В настоящее время БР исследован как никакой другой известный белок. С большой точностью определены кристаллографические структуры основной формы и всех стабильных интермедиатов фотоцикла, установлены их кинетические и спектральные характеристики. Так же, изучена последовательность основных этапов и молекулярных событий всего процесса переноса протона через плазматическую мембрану БР. Однако, несмотря на
многочисленность теоретических и экспериментальных данных все еще не существует однозначного понимания того, каким именно образом в БР реализуется активный транспорт протонов. Существующие противоречия в интерпретации данных прежде всего обусловлены погрешностью, присущей каждому из используемых методов. Исследования заставляют разрабатывать и использовать новые и более чувствительные методы.
В последние годы, все больше и больше подвергаются ревизии устоявшиеся представлении о физических процессах, приводящих к изомеризации ретиналя в белковом окружении. Долгое время неоспоримым считались данные резонансного комбинационного рассеяния и утверждение о том, что реакция изомеризации начитается сразу после возбуждения и завершается в первые 500 фсек до образования первого стабильного К-интермедиата. В этом случае, полагали, что глобула белок не играет никакой активной роли ни в процессе изомеризации, ни транспорте протона, выполняя роль стерического фактора среды по обеспечению направленности процесса изомеризации из полностью транс в 13-цис состояние и некоего резервуара по запасанию энергии поглощенного кванта. Запасание энергии осуществляется посредством изменения конформации белка, в ответ на изменение структуры ретиналя. Запасенная таким образом энергия расходуется затем в термальной стадии на последующую реорганизацию структуры, создавая условия для направленного переноса протона в пигмент-белковом комплексе реизомеризацию ретиналя. В этом случае также считали, что причиной батохромного сдвига спектра поглощения БР, т. н. опсинового сдвига, являлась реакция изомеризации. В то же время независимо в нескольких лабораториях было продемонстрировано наличие конформационных изменений уже на первичной стадии фотопревращений в ретинальсодержащих белках, однако попытки связать эти изменения с переходом от одной изомерной формы ретиналя к другой привели к разноречивым результатам. Все больше доказательств получают модели, рассматривающие в качестве первичного действия света не изомеризацию, а разделение или перенос заряда в БР. Однако в этом, как и в первом случае, белку отводится та же самая пассивная роль реорганизующейся структуры.
Появление новых нелинейных методов показало, что бактериородопсин обладает сильной оптической нелинейностью, которая может иметь определенное функциональное значение в биологической активности БР. Мы полагаем, что нелинейно оптические свойства не только ретиналя, но и белка могут иметь важное значение для функционирования белка. Белковая глобула в БР обладает выраженной структурной анизотропией и потому может сама проявлять нелинейную оптическую активность, инициируя перераспределения зарядов, напрямую не связанных с возбуждением ретиналя. Таким образом, свет могут выступать в роли кофактора в процессе транспорта протона. В частности, высокие электрические поля
наведенных действующим светом разделенных зарядов могут вызывать сильные молекулярные взаимодействия между полярными и заряженными химическими группами или ионами. Под действием сильных полей, обусловленных появлением фотоиндуцированных зарядов, белок может претерпевать функционально-важные конформационные реорганизации. Такие реорганизации, в свою, очередь, могут сильно влиять на энергию и кинетику процесса переноса заряда за счет модулированного действия движущих сил и энергии реорганизации. Эти эффекты, напрямую не связанные с поглощением света ретиналем, могут быть важными для динамики переноса протона, но они до сих пор тщательно не исследовались.
В данной работе исследуется светом-индуцированный ИК-эмиссионный отклик в бактериородопсине и модельных соединениях - основных компонентах структуры БР - в условиях непрерывно действующего видимого света умеренной мощности. В работе используется оригинальный подход комбинированного изучения спектральных свойств и динамики поведения многоатомных молекул и жидкостей в возбужденном электронном и колебательном состоянии. ИК-эмиссионные, флуоресцентные и оптические измерения, проведенные на ретинале in vitro и в белке in situ и на водных растворах глициновой и лизиновой аминокислот позволяют наблюдать и понять роль колебательного возбуждения и зависящих от энергии и микроокружения движущих сил процессов изомеризации и транспорта ионов водорода в ион-транспортных системах.
Цель и основные задачи диссертационной работы.
Целью настоящей диссертации является исследование фотоиндуцированных процессов в биологических молекулах и их роли в молекулярных механизмах оптического контроля структуры и функционирования бактериородопсина.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать спектральные и энергетические характеристики светом-индуцированной ИК-
эмиссии бактериородопсина в условиях умеренной мощности света.
2. Сравнить эффекты индуцированного действия света на спектральные параметры
модельного соединения ретиналя в условиях электронного и колебательного возбуждения.
3. Исследовать влияние инфракрасного света на структуру и спектральные свойства L-лизина
при селективном возбуждении репортерных групп.
4.Исследовать ИК-эмиссионный отклик в образцах лизина и глицина при воздействии видимым светом низкой интенсивности
-
Исследовать свойства растворов аминокислот в электронных спектрах поглощения и флуоресценции в УФ-и видимой области.
-
Оценить эффект теплового действия света в водных растворах биомолекул в условиях стационарного освещения видимым светом умеренной мощности.
-
Оценить эффект индуцированного действия видимого света на процесс кластеризации и ассоциирования молекул аминокислот в растворе
-
Выявить механизмы опосредованного действия индуцированных эффектов на структуру и ион транспортные свойства биологических молекул.
Научная новизна
В результате проведенных исследований были впервые выявлено индуцированное действие света на межмолекулярные взаимодействия в белке бактериородопсине в условиях умеренной и низкой интенсивности света.
Анализ экспериментальных данных показал, что фотоиндуцированная динамика молекулы бактериородопсина определяется не одним каналом реакции изомеризации ретиналля, а комбинацией нескольких различных каналов в возбужденном и основном электронных состояниях. Было определено, что вовлеченным в фотомодулированный ответ элементом структуры БР, может быть не только молекула ретиналя, но так же молекулярные структуры, включающие в себя димерные комплексы и молекулы воды.
Впервые показано, что низкоинтенсивный видимый свет может активировать среду не через энергозависимое поглощение, а посредством индуцированного электромагнитным полем световой волны перераспределения зарядов и выстраивания заряженных групп аминокислотных остатков в систему с кооперативными водородными связями. Также показано, что индуцированные низкоинтенсивным оптическим излучением процессы могут вызывать серьезные структурные перестройки в водных растворах аминокислот и БР. В частности выявлено образование сложных ассоциатов и пространственных неоднородностей разного геометрического профиля. Установлено, что среди образующихся ассоциатов могут быть образованы зародыши кристаллических структур.
Впервые экспериментально показано, что ненасыщенные растворы аминокислот обладают свойствами нематических жидких кристаллов и способны создавать под действием низкоинтенсивного света волноводные структуры и центры окраски.
Положения, выносимые на защиту:
1. Свет является важным кофактором в процессе однонаправленного переноса протона
через плазматическую мембрану. В бактериородопсине наблюдается параллельно
несколько процессов – электронное поглощение света и связанное с ним движение населенностей электронных уровней в хромофорном ретинале и индуцированные нелинейным взаимодействием процессы, не затрагивающие населенностей электронных уровней ретиналя. В первом случае активация ретиналя запускает реакцию изомеризации из полностью- транс в 13-цис состояние. Во втором случае, наблюдается зарождение функционально значимого ИК-излучения, за счет избирательного усиления ИК-излучения на определенных типах колебаний в ретинале и возможно в белке, непосредственно взаимодействующие с возбужденным ретиналем.
-
В механизм фотоконтролируемого поведения молекулы бактериородопсина вовлечено не только генерируемое внутри белка функционально значимое ИК-излучение, которое способно повлиять на донорно-акцепторные свойства боковых аминокислотных остатков, но так же способность света регулировать число молекул, вступающих в ФЦ.
-
Когерентный и некогерентный видимый свет способен не только активировать, но и вызывать значительные структурные перестройки в биологических молекулах и системах в условиях низкой и умеренной мощности.
Научно-практическая ценность
До настоящего времени не проводилось работ, посвященных раскрытию механизмов нелинейного действия света на структурные и функциональные свойства биологических молекул, экспонированных действию низкоинтенсивных оптических полей. Полученные данные вскрывают новые аспекты функционирования фотозависимых процессов в белках и сложных биологических системах, свидетельствуя о важной роли наряду с уже известными процессами поглощения и нагревания, нелинейных механизмов. Выявленные эффекты светоиндуцированных структурных перестроек и формирования волноводных и транспортных структур в водных растворах аминокислот могут послужить основой для понимания механизмов терапевтического действия лазерной медицины.
Выявленные условия проявления нелинейных эффектов существенно расширяют возможности по управлению динамикой молекул в неразрушающих условяих и представляют широкий интерес для широкого спектра приложений, включающего разнообразные спектроскопические стереохимические задачи по анализу молекулярной структуры, исследованию и контролю внутримолекулярной динамики и динамики химических реакций, кристаллизации вещества, ряд приложений в лазерной физике, таких как генерация ИК-и
терагерцового излучения, и множества других задач по реализации квантовых логических
устройств.
Результаты данной фундаментальной работы могут иметь практическую значимость для
биофизиков, биохимиков, фармакологов и физиков.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на различных международных и российских конференциях, симпозиумах и съездах, в том числе на европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии XXII European Congress on Molecular Spectroscopy (EUSMOS-XXII) 1994, Германия; 10 и 11-ой международных конференциях по ИК-Фурье спектроскопии (10th International on Fourier Transform spectroscopy (ICOFTS-10), 1995, Венгрия и 11th International on Fourier Transform spectroscopy (ICOFTS-11), США, 1997); на 3-ем международном симпозиуме по достижениями инфракрасной и Рама спектроскопии ( 3th International Symposium on Advanced Infrared and Raman Spectroscopy (AIRS-III), Австрия
1998); на 24-м, 25-м и 30-м европейский съездах по молекулярной спектросокпии (XXIV European Congress on Molecular Spectroscopy (EUSMOS-XXIV) 1998, Чехия, XXV European Congress on Molecular Spectroscopy (EUSMOS-XXV) 2000, Португалия и 30th European Congress of Molecular Spectroscopy, EUCMOS- 2010, 2010, Италия ) , на 45-ой ежегодной конференции американского общества по оптике (45th SPIE Annual Meeting The International Symposium on Optical Science and Technology 2000, США); на 9-й и 11-й конференции по ретинальным белкам ( 9th Interational conference on retinals proteins, 2000, Венгрия и 11th International conference on retinals proteins, 2004, Германия), на 3-й и 4-й конференции по достижениям колебательной спектроскопии (3rd International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy, ICAVS-3, 2005, США и 4 International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy, 2007, Греция ), на 2-м и 3-м международном симпозиуме по молекулярной фотонике (2 International symposium on Molecular photonics, 2006 , Россия и 3 международного симпозиума“ Molecullar photonics” dedicated to academician A.N. Terenin, 2011), на 14-й европейской конференции по биоэнергетике (14th European Bioenergetics Conference, 2006, Россия), на Международной конференции по оптической диагностике заболеваний в медицине («Shedding light on disease: Optical diagnosis for the new millennium», 2008, Бразилия), Троицк, Москва Россия), 5 Съезд Российского фотобиологического общества съезда, 2011, Россия, 2-м и 3 м съезде биофизиков России, XVIII Менделеевский Съезд по общей и прикладной химии, 2007, Россия, конференция, «Комбинационное рассеяние-80 лет исследований», 2008, Россия, III Троицкая конференция по медицинской физике и инновациям в медицине, 2008 и 2010, Россия, международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» - 2011 и 2013, Пущино.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 165 страниц машинописного текста, включая 36 рисунков, таблиц 8 и 350 библиографических ссылок.
Общие характеристики основных спектральных методов исследования ретинальных белков
В опубликованных пространственных моделях, полученных разными методами структуры всех семи параметры а-спиралей БР очень похожи между собой. Наибольшие различия между ними касаются локализации неупорядоченных участков в петлях . Молекулы воды и липиды выявляются только в структурах, полученных с высоким разрешением [Luecke, et al. 1999].
Последнее наилучшее разрешение в 1.55 А структуры основного состояния и интермедиатов ФЦ было получено дифракцией рентгеновских лучей в кристаллах, выращенных методом липидной кубической фазы [Landau, 1996] . Этот новый подход позволяет за счет многократного укладывания в стопку плоских пурпурных мембран ПМ с исходной Рз-симметрией получить пространственную группу Р6з [Landau, 1996; Takeda et al, 1998] . Состояние белка в таком кристалле очень похоже на его естественное состояние в ПМ [Heberle et al. 1998] .
Успехи в этой области позволили получить детальную информацию о расположении спиралей и боковых цепей, наружных гидрофильных последовательностей, связывающих альфа-спиральные колонны, устройстве контактов между единицами в триммере. Это позволило определить структуру в основном и промежуточных состояниях ФЦ. Были определены детали структурных изменений, сопровождающих ФЦ, как например: переориентация аминокислотных остатков, деформация а-спиралей, локализация и движение молекул воды внутри белка [Luecke, et al. 1999а, Luecke, et al. 1999b; Luecke, et al. 1998, Luecke, 2000; Lanyi, Schobert, 2004, Schobert et al. 2004 ]. Структура (1c3w) на рис. 5 показывает, что спирали Е, F и G находятся приблизительно в плоскости мембраны, тогда как А, В, С и D пересекают мембрану под небольшим углом к нормали. Все вместе эти спирали формируют протонный канал - путь перемещения протона через мембрану в течение ФЦ. Согласно структуре 1c3w протонированное ШО ретиналя локализовано в а-спирале G на расстоянии 0.6-1.0 нм от цитоплазматической стороны мембраны, тогда как Р- иононовое кольцо расположено почти посередине канала. Дипольный момент ретиналя составляет приблизительно угол 20-30 градусов по отношению к плоскости мембраны.
БР может находиться в так называемом свето- и темноадаптированном (ТА) состоянии [Oesterhelt et al., 1973]. Эти состояния различаются спектрами электронного поглощения. В свето - адаптированном (СА) состоянии ПМ поглощают при 568 нм, тогда как в состоянии ТА при 558 нм. Более того, ТА состояние БР представляет собой смесь (50:50) свето- и темноадаптированного БР [Fischer, Oesterhelt, 1979; Oesterhelt et al. 1973] с соответственно, полностью-транс и 13-цис конфигурацией ретиналя, тогда как в С А состоянии хромофор почти на 100% находится с полностью-транс конфигурацией ретиналя [Pettei, 1977; Harbison et al.1984].
Спектр поглощения БР характеризуется тремя основными полосами 190, 280 и 560 нм [Honig , Ebrey, 1974]. Первая полоса с максимумом при 190 нм обусловлена поглощением полипептидной цепи белкового компонента - опсина, полоса при 280 нм - типична для поглощения ароматических аминокислот. Основная полоса поглощения в видимом диапазоне расположена в области 570 нм и обязана своим происхождением ретиналю. Кроме этого широкого пика в суспензии ПМ присутствует минорный пик в области 400 нм [Литвин, и др. 1977]. Отметим, что ретиналь в растворе имеет полосу поглощения при 380 нм, однако в БР, как и во всех ретинальсодержащих белках эта полоса сдвигается в красную область и расположена в интервале 420-575нм. Установлено, что сдвиг в максимуме полосы поглощения ретиналя по сравнению с его свободной формой или протонированым Шиффовом основанием (ПШО) в растворе обусловлен влиянием белка, что получило название опсинового сдвига [Applebury, et al. 1978]. Это явление было детально изучено теоретически и экспериментально с использованием нативных белков, модельных соединений ретиналя и ПШО, а также факторов, непосредственно влияющих на их спектры поглощения [Blatz et al, 1977; Hamm, 1996]. Теоретические расчеты л-электронной системы протонированного альдимина показали, что в вакууме полоса поглощения должна быть расположена при 600 нм, между тем, как уже отмечалось выше, она обычно находится в наиболее коротковолновой области [Blatz et al, 1972]. Это противоречие частично устранялось наличием ассоциации протонированного альдимина с противоином. В неполярных растворителях, где соли не диссоциируют, воздействие аниона в ионной паре состоит в том, что положительный заряд фиксируется на NH-группе, поэтому максимум полосы поглощения сдвигается в голубую область спектра. Дополнительный гипсохромный сдвиг может быть получен при полярном окружении, а батохромный - при росте его поляризуемости.
Протонированный альдимин ретиналя - легко поляризуемая молекула. Поэтому для его спектральных свойств в белке существенно электростатическое взаимодействие с заряженными и полярными аминокислотными остатками. Так, например, варьируя расстояние между атомом азота и анионом, можно получить спектр поглощения альдимина ретиналя с полосой поглощения в области 440-600 нм [Blatz, 1972]. Помимо опсинового сдвига, белковое окружение ретиналя определяет и направление изомеризации по пути из полностью-транс в 13-цис, в то время как в свободном ретинале изомеризация приводит к образованию всех типов изомеров: 7-цис, 9-цис, 11-цис и 13-цис изомеров ретиналя. В однородном растворе ретиналь изомеризуется из полностью-транс в 9-, 11- и 13-цис с квантовым выходом 0.02, 0.14 и 0.01, соответственно [Freedma et al. 1986; Koyama et al.1991, Mukai, 1992, Hamm , 1996], а в БР средняя величина квантового выхода составляет 0.65 [Iwasa Т., et al., 1980; Xie A. et. al., 1990; Tiitor and Oesterhelt, 1990; Schneider G., et al. 1998; Logunov, et.al. 1997]. Квантовым выходом фотоцикла БР обычно называют квантовый выход образования батопродукта К590 [Литвин Ф.Ф. и др., 1975]. Скорость изомеризации ретиналя сильно зависит от окружения, например в растворе [Logunov, 1996] и в мутантах БР [Song, 1993] она значительно ниже, чем в белке БР дикого типа.
В хромофорном центре выделяют активный центр, который включает в себя ПШО, два аспартата (Asp85, Asp212), которые образуют водородные связи с молекулой воды, которая, в свою очередь, отделяет катион ШО (– NH+) от двух анионов аспартатов.
Водородные связи и их роль в функционировании бактериородопсина
Линейность соотношения наблюдается в большом числе случаев, однако когда электрическое поле становится очень большим, линейность условий нарушается. Линейность и нелинейность процесса определяется разным характером взаимодействия света с веществом. При линейном распространении световые волны разной частоты, поляризации и направленности не взаимодействуют между собой. При нелинейности процесса этот принцип суперпозиции нарушается: воздействие на среду нескольких световых волн в режиме нелинейного взаимодействия не сводится к сумме каждой из волн в отдельности. Это приводит к тому, что в спектре действующего света появляются новые компоненты (например, на удвоенной или утроенной частоте, суммарной или разностной частоте). Как правило, источник оптической нелинейности находят на атомарном уровне. Электрическое поле, которое связывает электрон с ядром атома большое (больше чем 10 ). Когда электрическое поле прикладывается к изолированному атому посредством света, то в обычных условиях такое поле вызвает незначительные пертубации в электронном облаке, вызывая небольшую поляризацию атома. Это удовлетворяет линейности соотношения Р и Е. Однако увеличение интенсивности света, приближаясь к соответствующему значению величины электрического поля внутри атома приводит к большим пертурбациям электрона и линейное соотношение уже не выполняется. Это приводит к нелинейным эффектам, обусловленным электронной нелинейностью. В случае нелинейности процесса плотность поляризации представляется разложением в ряд Тейлора [Ахманов, 1979; Shen, 1980] Р = о (ІЕ + х(2) Е2+ х(3) Е3 + ...) (4.4)
Члены (х(2) и х(3) известны как нелинейности 2 и 3-его порядка. Эти величины называются нелинейными восприимчивостями и они являются характеристиками реальных материалов и не только. Они отражают наличие множественных взаимодействий - на уровне квадруполей, октуполей и т.д.
Нелинейные материалы способны изменить характеристики не только внешнего излучения. В результате изменившихся характеристик внешнего излучения могут измениться и свойства самой нелинейной среды.
В современной оптике выделяют два наиболее крупных класса нелинейных механизмов: механизмы с нелинейным электронным откликом и механизмы с откликом ядер атомов и молекул [Масалов и Чижикова, 2011]. Для электронных нелинейностей характерен негармонический отклик электронов вещества на воздействие гармонического светового поля и как правило наблюдается при очень высоких мощностях света [Ахманов, 1979; Shen, 1980]. В этом классе электронных нелинейностей выделяют группы резонанных и нерезонансных нелинейностей (по соотношению частоты светового поля и частот атомных переходов). Нерезонансная электронная нелинейность обусловливает генерацию второй гармоники, генерацию суммарных и разностных частот, многофотонное поглощение и ряд других нелинейных явлений. Резонансная электронная нелинейность обусловливает просветление среды, которое впервые наблюдали СИ Вавилов и В.Л.Левшин задолго до появления лазеров [Масалов и Чижикова, 2011]. В нелинейных механизмах с откликом ядер атомов и молекул движение электронов вещества под действием поля остается гармоническим, но это движение становится причиной перемещения атомных остовов, что проявляется в изменении оптических свойств среды. Среди этих механизмов определяют электрострикцию, ориентацию оптически анизотропных молекул, раскачку молекулярных колебаний и др. Эти механизмы обусловливают нелинейность показателя преломления сред, наведенное двулучепреломление, вынужденное рассеяние света, эффект Керра и другие явления [Ахманов, 1979; Shen, 1980].
Как видно, нелинейные механизмы по своему разнообразию выходят за рамки влияния света на населенности энергетических уровней вещества. Многие нелинейные явления происходят вообще в отсутствие поглощения (генерация второй оптической гармоники, нелинейный показатель преломления и др.). В тех механизмах, которые сопровождаются изменением показателя преломления, всегда присутствуют эффекты самовоздействия световых волн, которые значительно могут изменить характеристики самих веществ [Масалов и Чижикова, 2011]. Из множества нелинейных механизмов кратко рассмотрим эффект Керра, который имеет непосредственное отношение к нашей работе.
Возвращаясь к определению восприимчивости (формула 4.4) , общий нелинейный эффект зависит от нелинейных коэффициентов второго х(2) или третьего х(3) порядка нелинейности поля, присутствующего внутри вещества. Таким образом общий нелинейный эффект в материале определяется нелинейным коэффициентом х(і) и полем, присутствующем в материале. В материалах с небольшой нелинейностью требуются большие входные мощности света (порядка 1016 Вт), в то же время для материалов, обладающей большой нелинейностью, таких как, например жидкие кристаллы (ЖК), вполне достаточно мощностей в несколько мВт, т. е. в 1018 - 1019 раз ниже мощности обычных материалов [Руденко, Сухов, 1994; Etchegoin, Phillips, 1996; Etchegoin, Phillips, 1997; Khoo, 2001]. Хорошо известно, что биологические мембраны и белки являются жидкими кристаллами [Birge, 1996; Yoon, 2012].
Качественное описание эффекта Керра Под воздействием внешнего постоянного электрического или переменного электромагнитного поля в среде может наблюдаться двойное лучепреломление, вследствие поляризации вещества. nе - no = k E, (4.5) где по -показатель преломления для входящего (обыкновенно) луча, пе - показатель преломления для необыкновенного луча, к - направление распространения. Закон Керра выражается соотношением пе - по = Во Е2 , (4.6) где В - постоянная Керра, о -длина волны падающего света. Коэффициент В зависит от природы вещества. Наибольшя величина постоянной Керра наблюдается у веществ молекулы которых обладают большим собственным дипольным моментом (для нитробензола В = 10"18 м2 В"2 (Wenjang Nie. Optical nonlinearityAphenomena, applications, and materials. Advanced Materials, 5(7-8).-P..520-545. 1993. ). В случае, когда В 0, то вещество ведет себя подобно оптически положительному одноосному кристаллу.
Физическая причина эффекта Керра состоит либо в ориентации структурных элементов вещества в электромагнитном поле, либо в искажении электронных оболочек молекул или атомов. В первом случае эффект Керра называют ориентационным, он наблюдается только в веществах, состоящих из дипольных молекул. Эффект Керра второго типа («поляризационный) характерен для веществ, молекулы которых первоначально не обладают дипольными моментами, но достаточно сильно поляризуются в электрическом поле.
Оптический эффект Керра - типичный пример нарушения принципа суперпозиции. При оптическом эффекте Керра световая волна изменяет свойства вещества. Он наблюдается во всех материалах [Прохоров, 1983]. Это быстрый эффект, который происходит на фемтосекундной временной шкале.
Оптические измерения с помощью видеонаблюдения
В частности, резонансное возбуждение образца L-лизин моногидрохлорида с помощью ИК-излучения на частоте 936, 1006 или 1301 см-1, приводило к его переизлучению в широком спектральном диапазоне. Среди наблюдаемых частот, наблюдали наиболее интенсивные эмиссионные полос при 1848, 1875, 1741 и 1890 см-1.
Полученный результат показывал, что возникающее под действием видимого света ИК-излучение ретиналя внутри белка потенциально способно активировать диполи аминокислот, тем самым, способно продуцировать ИК-эмиссионный отклик, наблюдаемый в спектрах ИК-эмиссии БР в области 2000-1800 см"1. Однако учитывая характер взаиморасположения ретиналя и аминокислотных остатков, потенциально способных таким образом взаимодействовать с ретиналем, было затруднительно ответить, насколько этот вклад мог быть существенным в случае БР. В этом отношении было полезно рассмотреть вариант непосредственного влияния видимого света на белок и ответить на вопрос может ли видимый свет вызвать ИК-активный отклик в белке в данных экспериментальных условиях. Исходя из традиционных представлений, следует ожидать отрицательный ответ на этот вопрос, поскольку аминокислоты, как известно, не поглощают видимый свет. Традиционно полагают, что в подобных экспериментальных условиях видимый свет не способен оказывать какого-либо воздействия на белок, соответственно, не существует причин для появления ответной реакции со стороны белка в данных условиях освещения. По этой причине в литературе отсутствуют подобные сведения не только о белках, но и аминокислотах. В данной работе, используя разные экспериментальные подходы, мы впервые исследовали влияние видимого света на аминокислоты лизина и глицина и их взаимодействия в растворе и твердом состоянии. Одним из используемых методов был разработанный нами подход ИКЭС. Прежде чем перейти к рассмотрению этих экспериментов, отметим ряд важных, на наш взгляд выводов, которые следовали из экспериментов по инфракрасному возбуждению лизина. Первое - было четко показано, что инфракрасное возбуждение вызывает в молекуле лизина сильное колебательное взаимодействие между модами. К такому выводу мы пришли на основе анализа распространения колебательного возбуждения в лизине, который исключал каскадный механизм размена колебательной энергии. (см. рис20). В частности, был выявлен перенос энергии с репортерных групп (локально возбужденных ИК-светом атомных групп) на разные части молекулы, расстояния между которыми варьировали от длины одной С-С связи ( 1.5 А) до нескольких единиц А. Хотя перенос энергии с донорной на акцепторную часть молекулы напоминает перенос электронной энергии, по своей природе они качественно различны. Мы обнаружили, что в лизине, как и ретинале внутримолекулярный перенос колебательной энергии происходит по механизму тесного ангармонического взаимодействия между модами, которое сопровождается не равномерным распределением между модами, а усилением отдельных типов колебаний, разных в зависимости от условий возбуждения. В частности, было обнаружено, что движение энергии от низкочастотных колебаний в направлении энергетически более высоко расположенные высокочастотныхе колебаний. (рис. 20), что может быть обусловлено сильным ангармоническим взаимодействием между модами [Волькенштейн и др., 1949; Теренин, 1967; Chaban et al., 2000; Dott, 2001].
Второе - особенно важным представляется результат, который показал, что спектры лизина обладают высокой чувствительностью к величине и частоте возбуждающих колебательных квантов. Это отражает высокую подвижность скелета молекулы и чувствительность структуры лизина к колебательному возбуждению лизина. Из этого следует важный вывод о способности ИК-излучения влиять на конформацию аминокислот при резонансном взаимодействии на функционально важных частотах. Этот результат согласуется с литературными данными о возможности конформационных переходов в аминокислотах при колебательном возбуждении и их сильной зависимостью от потока внутримолекулярной энергии, необходимой для преодоления энергетических барьеров. Как следует из представленных на рис. 23 спектров, в конформационные переходы лизина вовлечено множество разнообразных движений молекулы, многие из которых могут совершаться с большой амплитудой, отображая высокую подвижность боковых аминокислотных остатков. Это имеет большое функциональное значение для биологической активности БР, как и других белков в присутствии постоянного ИК-поля.. И наконец, эти эксперименты четко доказали, что аминокислоты, получая избыток ИК-энергии, часть его расходуют на изменение конформации, а другую часть отводят в виде переизлучения ИК-квантов в широком спектральном диапазоне. Следовательно, полагая, что возбужденный ретиналь внутри глобулы может представлять собой внутренний источник ИК-излучения, который, воздействуя на аминокислоты, может вызвать в них соответствующий ИК-отклик, аминокислоты, тем самым, могут вносить свой вклад в ИК-сигнал в спектрах БР.
Исследование действия видимого света на возбуждение ИК-эмиссии в образцах L-лизина монохлорида и глицина в условиях умеренной и низкой мощности
Используя в дальнейших экспериментах растворы, как и твердые образцы аминокислот [Терпугов, Дегтярева, 2001; Дегтярева и др. 2011; Дегтярева и др. 2013; Terpugova et al., 2012] мы исходили из распространенных представлений о том, что аминокислоты являются адекватными моделями, имитирующими поведение белков или самих аминокислот внутри белка. В такого рода экспериментах ИК-спектроскопия – это единственный метод, который может установить присутствие специфических форм аминокислот в растворе. Использование разработанного нами эмиссионного подхода позволяло проводить эти исследования в более широком по сравнению с традиционным методом ИК-диапазоне и изучать взаимодействие между аминокислотами на качественно другом уровне.
Прежде всего, было обнаружено, что видимый свет умеренной и низкой интенсивности способен вызывать в образцах L-лизина монохлорида и глицина активный ИК-эмиссионный отклик, который можно было надежно регистрировать с помощью имеющейся у нас ИК-Фурье-техники. Было обнаружено, что генерация ИК-сигнала возникала как в пленочных образцах, так и ненасыщенном растворе (при концентрации 1.0 М). В последнем случае ИК-сигнал был сопоставим (в 1.5-2.5 раза ниже) того, что наблюдали в микронного размера пленках, высаженных на подложку из тонкой пластины кристаллического кремния. Отметим, что исходные водные растворы были оптически однородными и не содержали нерастворенных частиц или агрегатов. Перед измерением растворы предварительно фильтровали с помощью микронного размера миллипоровых фильтров и контролировали по светорассеянию на длине волны 660 нм. Исследование зависимости интенсивности ИК-сигнала в эмиссионных спектрах образцов L-лизина монохлорида и глицина от мощности действующего света в диапазоне 42 - 660 мВт показало квадратичную зависимость от мощности (рис.23). Таким образом, на основе этих данных можно было заключить, что видимый свет может продуцировать подобный ИК-активный отклик непосредственно в белке. Предстояло определить насколько этот отклик может проявляться в спектрах БР в области 2000-1700 см-1 и какова его природа.
Исследование спектральных характеристик в спектрах ИК-эмиссии полностью-транс ретиналя при электронном возбуждении в резонансе с полосой электронного поглощения
Было показано, что в растворе лизина концентрацией 1.0 М на пути распространения светового луча длиной волны 633 нм и мощностью 1. 4 мВт в течение 10 минут создается градиент температуры по отношению к неосвещенному раствору величиной менее одной десятой доли градуса. Тем самым было продемонстрировано отсутствие сильного нагрева в среде и в то же время продемонстровано, что лазерное излучение создает перепады в величине температуры, которые согласно литературным данными, приводит к самофокусировке и другим обусловливающим его эффектам - эффект каналирования светового луча (рис. 32А) и появления волноводных структур, наблюдаемых в нашем эксперименте. Эти эффекты могут быть следствием изменения показателя преломления, термолинзы [Dovichi et al., 1976], самофокусировки [Maier et al., 1970; Pleck, Kelley, 1969], а также возникновению регистрируемого в наших условиях стимулированного ИК-излучения [ de Martini, 1966].
Как хорошо известно, явление самофокусировки света теоретически было предсказано Г. А. Аскарьяном в 1962 и позже подтверждено экспериментально и теоретияески в ряде работ [Аскарьян, 1962; Аскарьян, 1966; Зельдович, 1966; Owyoung, 1975; Ахманов, 1979; Kelley, 1965; Chai et al., 1993; Khoo, 1995, Ashkin et al., 2007; Chai et al., 2009]. Природа этого эффекта обусловлена тем, что под действием гауссовой формы светового пучка, нелинейная среда становится оптически неоднородной: в центре пучка, где больше интенсивность, показатель преломления больше, чем для краёв пучка. Это приводит к искажению первоначально плоского волнового фронта и искажениям в среде, в результате которых первоначально однородная среда становится своеобразной объёмной собирающей линзой , создающей концентрацию энергии световой волны [Dovichi et al., 1976;]. В этих условиях нелинейный показатель преломления нелинейно растёт с увеличением амплитуды поля Е:
П=По + пнл (Е ), где п- показатель преломения среды, по - линейный показатель преломления среды, пнл нелинейный показатель преломления среды, величина которого меняется пропрционально квадрату напряженности электрического поля. Эти эффекты в обычных материалах наблюдаются при очень высоких мощностях света, в то время как в материалах обладающих высокой оптической нелинейностью, особенно в жидких кристаллах, эти эффекты проявляютя на предельно низких мощностях света до 1 мВт и ниже.
Таким образом было доказано, что в растворах аминокислот подобно жидким кристаллам, низкие световые потоки способны вызывать ориентационные эффекты. Это позволяет сделать вывод о том, что подобные эффекты, наблюдаемые ранее в белках при высоких мощностях, могут иметь в естественных условиях.
С уверенностью можно утверждать следующее:
1. Под действием видимого света заряженные формы аминокислот в растворе вступают в тесное взаимодействие между собой и с молекулами воды, образуя межмолекулярные соединения или сольваты определенного стехиометрического состава.
2. Влияние низкоинтенсивного видимого света на молекулы аминокислот или белковую глобулу, происходит по механизму не прямого фотохимического или теплового воздействия излучения на биомолекулы, а посредством нелинейных взаимодействий, в основе которых лежит высокая нелинейная оптическая активность биологических молекул.
3. Понимание донорно-акцепторных взаимодействий при фотоиндуцированном транспорте зарядов внутри сложных биологических систем требует учета влияния нелинейных взаимодействий и фотоиндуцированных процессов, обусловленных самим белком.
В аспекте настоящего исследования существенно подчеркнуть, что рассматриваемые процессы построены на различных по своей природе и свойствам механизмам, вовлеченным в функционирование БР, как впрочем, и всех остальных ретинальных белков. Полученные данные и анализ литературы позволяют высказать предположение, что высокие нелинейные свойства биологических молекул, должны в значительной мере, определять их фотобиологическую активность. Это обстоятельство вытекает, прежде всего, из молекулярной организации пигмент-белкового комплекса, характеризующегося высокой степенью ассимметрии ее структуры и поляризационных свойств. Нетривильность в содержании такого утверждения состоит в том, что нелинейные свойства БР обусловлены не только ретинальным хромофорным, но и полярными структурами, существующими или индуцировано возникающими внутри белка, и что эти свойства играют большую роль в условиях низкой освещенности БР. Традиционно предполагали, что биологическая активность, как например, в бактериродопсине, светом-индуцированной протонной помпы, исключительно связана с поглощением и изомеризаций ретиналя вокруг критической двойной связи (в БР - это С13=С14 связь (транс-цис изомеризация)), которая обусловливает все последующие структурные перестройки внутри белковой глобулы, приводящие, в конечном счете к транспорту протона через плазматическую мембрану. Однако, появление фототермальных методов, атомной силовой микроскопии и метода генерации второй гармоники, показало, что структурные изменения происходят как в нативных молекулах БР, так и его аналогах, содержащих неизомеризующиеся формы ретиналя. Более того, накоплены свидетельства того, что ряд других катализируемых видимым светом химических реакций (отличных от тех, что наблюдаются при фотоцикле), сопровождающиеся фотоиндуцированными изменениями белковой конформации, не связаны с изомеризацией ретиналя. Так же накоплены данные о том, что существует корреляция между структурными перестройками и нелинейной активностью БР. Речь идет о встраивании ретиналя в белковую глобулу в присутствии света или удалении ретиналя из БР в реакции с использованием гидроксиламина. На основе этих доказательств было сделано заключение о том, что в таких случаях белок активируется за счет механизма, который не включает транс-цис изомеризацию. Было высказано новое предположение, что основным механизмом активации белка является первичная делокализация заряда, возникающая в возбужденном состоянии хромофора, которое в значительной степени подкреплялось теоретическими данными. Эти данные послужили тому, что в настоящее время, наряду с рассмотренной выше изомеризационной моделью первичных процессов, существует гипотеза, в которой в качестве альтернативного механизма проявления функциональной активности БР рассматривают светом-индуцированное разделение зарядов в ретинальном хромофоре. Однако согласно представлениям, высказанным в обоих этих гипотезах, активность белка – это вторичный процесс, обусловленный первичным поглощением света ретиналем.
Обнаруженные в настоящей работе факты показали, что белок в отсутствие поглощения может напрямую активироваться видимым светом. Согласно полученным данным активация может включать ряд нелинейных механизмов, среди которых мы выделяем ориентационный, и механизм, связанный с генерацией стимулированного ИК-излучения. Анализ литературы показал, что эти процессы внутри БР происходят на временной шкале реакции изомеризации.
