Введение к работе
Актуальность проблемы
Сложность функционирования внутриклеточных систем, участвующих в передаче игналов клеточного деления и/или клеточной дифференцировки, интерференция между ими являются одной из центральных проблем клеточной биологии и медицины. Для зучения таких сложных систем необходима разработка новых экспериментальных оделей, позволяющих контролировать последовательные этапы передачи сигнала от іервого контакта с индуктором до фенотипического проявления его эффектов, сследование механизмов действия фактора, ингибирующего лейкемию,- LIF (Leukemia nhibitory Factor) на культурах эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и в раннем мбриогенезе мышей позволяет приблизиться к формированию таких моделей и выявить екоторые этапы реализации его сигнальных эффектов. Актуальность таких сследований несомненна как для фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку IF является одним из ключевых цитокинов семейства интерлейкинов (IL-6), беспечивающих согласованность иммунной, эндокринной и нервной систем в ормальных условиях и в ответ на действие воспалительного и эмоционального стресса, аиболынее распространение LIF получил как фактор, поддерживающий ЭСК животных человека в недифференцированном плюрипотентном состоянии, а также в терапии нкологических заболевании и репродуктивной медицине (Gunawardana et al., 2003; uney et al., 2008; Novatny et al., 2009; Aghajanova, 2010).
В настоящее время известно, что для передачи сигнала LIF необходимо
заимодействие лиганда с LIF-рецептором (LIF-R) и трансмембранным переносчиком -
ликопротеином gpl30 с последующей активацией внутриклеточных сигнальных
аскадов, регулирующих клеточный рост, размножение и дифференцировку разных
ипов клеток. В ЭСК мыши наиболее изученными являются JAK-STAT3 Ras-
независимый и МАРК Ras-зависимый сигнальные пути (Huyton et al., 2007; Skiniotis et
al., 2008 Jeong et al., 2007; Niwa et al., 2009). В одном случае LIF поддерживает стволовые
клетки в недифференцированном плюрипотентном состоянии (JAK-STAT3), в другом,
напротив, его действие направлено на активацию процессов цитодифференцировки
(МАРК-путь). Установлена прямая корреляция между высокой активностью
транскрипционного фактора STAT3 и плюрипотентным потенциалом ЭСК мыши in vitro
(Niwa et al., 1998; Raz et al., 1999). Известны и другие молекулярно-генетические
системы, тесно связанные с поддержанием плюрипотентных свойств ЭСК in vitro. К ним
относятся, в частности, ВМР4 (Ying et al., 2003; Qi et al., 2004), Wnt-1 (Ogawa et al., 2006;
Wagner et al., 2010) и PI3K сигнальные пути (Jirmanova et al., 2002; Watanabe et al., 2006).
Результатом действия LIF на ЭСК мыши является усиление экспрессии
транскрипционных факторов плюрипотентности Oct3/4 и Nanog (Натагакі et al., 2006;
Niwa et al., 2009). Возможно также и независимое от LIF прямое влияние тАК2-сигнала
на хроматин с последующей активацией в ЭСК мыши STAT3 и Nanog (Griffiths et al.,
2011).
Множественность путей LIF-регуляции стволовых клеток наглядно продемонстрирована в работах на мутантных линиях ЭСК мыши с нокаутами по генам
2 основных компонентов передачи сигнала И/-/-, lifr-/-, gpl30-/-, stat3-/- (Ware et al., 1995; Li et al., 1995; Yoshida et al., 1996; Dani et al, 1998). При этом для стволовых клеток, у которых отсутствуют рецепторные белки LIF-R и/или gpl30, как и для клеток дикого типа, требуется присутствие LIF в среде культивирования для поддержания их в плюрипотентном состоянии (Takeda et al., 1997; Dani et al., 1998). Однако в условиях /' vivo эмбрионы мышей с дефицитом LIF и основных посредников этого лиганда при действии на клетки (LIF-R, gpl30, STAT3, Oct3/4 и Nanog) могут развиваться в организме приемных матерей, вплоть до рождения (Boiani, Scholer, 2005).
Пока точно не установлено, какие из LIF-сигнальных путей доминируют в процессах поддержания плюрипотентного потенциала ЭСК и эмбриональных клеток в составе зародыша in vitro, а какие in vivo. Остаются до сих пор недостаточно исследованными последствия контакта LIF с его рецепторами и липидным матриксом клеточных мембран. Не выявлены различия в эффектах LIF при экзогенном и/или эндогенном поступлении сигналов в цитоплазму, функциональная полидоменность этого белка при действии на темпы клеточных делений и на генетический аппарат клеток в целом.
Выделение отдельных этапов передачи сигнала LIF и изучение его «веерных»
эффектов на разных типах эмбриональных клеток общего происхождения может
способствовать развитию адекватных моделей для исследования систем передачи
сигнала на клеточном уровне с целью эффективного управления процессами роста и
дифференцировки in vitro и в раннем эмбриогенезе. Для выделения разных этапов
передачи сигнала LIF нами был разработан комплекс экспериментальных моделей,
начиная от контакта LIF с клеточными мембранами и его влияния на цитоплазму и
кончая генетическими изменениями клеточного состава в различных популяциях ЭСК
мыши с оценками сохранения плюрипотентного потенциала и пролиферативной
активности. Разрабатываемые нами подходы в решении проблемы управления
процессами развития ЭСК in vitro, основанные на изучении мембранных,
внутриклеточных и популяционных эффектов LIF, могут способствовать пониманию
механизмов перехода плюрипотентных клеток в дифференцированное состояние и
созданию эффективных и безопасных ЭСК-технологий для современной медицины.
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования состояла в сравнительном изучении молекулярных и
клеточных механизмов передачи сигнала LIF в эмбриональных стволовых клетках и в
раннем эмбриогенезе мышей для установления роли этой сигнальной системы и
характера ее влияния на процессы пролиферации, дифференцировки и поддержания
кариотипической стабильности стволовых клеток in vitro.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: 1. Провести сравнительную оценку биологической активности рекомбинантных белков LIF мыши из про- и эукариотических систем экспрессии для выяснения возможных эффектов посттрансляционных модификаций белков при их взаимодействии с бислойными липидными мембранами (БЛМ).
2. Выявить эффективность действия LIF в зависимости от его продуцента
(прокариоты - эукариоты) на процессы пролиферации и/или дифференцировки ЭСК
мыши, а также оценить характер влияния LIF на активность митохондриальных
дегидрогеназ, прохождение клеточного цикла и выход стволовых клеток в апоптоз.
-
Получить ///-трансфицированные клоны ЭСК мыши с экспрессией белка LIF и установить роль эндогенного LIF в поддержании плюрипотентных свойств, колониеобразования и способности ЭСК дифференцироваться в эмбриоидные тела.
-
Оценить влияние экзогенного и эндогенного LIF на мутационные спектры ЭСК мыши и дать теоретическое обоснование кариотипической эволюции стволовых клеток в системе in vitro.
5. Разработать экспериментальные подходы для индукции миокардиалыюй
дифференцировки ЭСК мыши, оценить перспективы использования эмбриональных
кардиомиоцитов для тестирования кардиоактивных фармакологических препаратов.
6. Выявить чувствительные к действию LIF стадии доимплантационного развития, а
также мишени для повышения эффективности выделения из бластоцист первичных
колоний эмбриональных клеток - предшественников ЭСК.
Научная новизна работы
-
Впервые проведено всестороннее исследование разных этапов передачи сигнала LIF и сравнительный анализ биологической активности этого регуляторного белка в зависимости от систем экспрессии (эукариоты-прокариоты) при действии на клеточные мембраны, культуры ЭСК и ранние зародыши мыши. Предложены теоретические и экспериментальные обоснования выявленных различий, обусловленные биохимическими модификациями молекул зрелого белка в эукариотических продуцентах. Показано, что такие модификации важны для повышения выживаемости ЭСК мыши in vitro и для индукции процессов миокардиальной дифференцировки.
-
Разработан новый экспериментальный подход для получения из ЭСК мыши клеток с сократительной активностью по типу кардиомиоцитов в условиях пролонгированного культивирования с рекомбинантным белком LIF эукариотического происхождения. Исследованы свойства кардиомиоцитов in vitro и показано, что такие клетки дают положительную реакцию на /?-адренергическую стимуляцию и могут быть использованы как тест-системы для исследования механизмов миокардиальной дифференцировки in vitro и скрининга с высокой пропускной способностью кардиоактивных фармакологических препаратов. Впервые регуляторный белок LIF охарактеризован как индуктор дифференцировки ЭСК мыши в кардиомиоциты.
3. Доказано существование принципиально нового молекулярного механизма
передачи информации рекомбинантным белком LIF мыши путем формирования в
липидной мембране ионного канала. Канал отличается сложным поведением, зависящим
от знака и величины мембранного потенциала, ионной силы раствора и состава
липидного бислоя. Получены данные о возможных различиях в работе ионного канала
LIF в зависимости от продуцента этого белка про- или эукариотического происхождения.
Впервые показано, что молекулы LIF могут задействовать для передачи сигнала в клетки
4 рецепторный механизм и ионные каналы, что объясняет функциональную избыточность этого белка.
-
Установлены основные принципы LIF-регуляции эмбриональных и стволовых клеток мыши in vitro и найдены наиболее чувствительные процессы, отвечающие на действие этого фактора усилением пролиферативной активности за счет изменения соотношения клеток в популяциях по фазам клеточного цикла. Выявлены антиапоптотические свойства рекомбинантного белка LIF, что, по нашему мнению, является необходимым условием для поддержания высокой пролиферативной активности и сохранения плюрипотентного потенциала ЭСК.
-
Получена плазмидная конструкция pcDNA3 со встроенным геном ///мыши для трансфекции ЭСК мыши, получены //^-трансфицированные клоны с экспрессией белка L1F для повышения стабильности плюрипотентных свойств и изучения LIF как аутокринного регулятора процессов клеточного роста и дифференцировки. Проанализирована возможность использования ///^трансфицированных клонов в качестве модельных объектов для исследования молекулярных механизмов дифференцировки.
-
Предложена схема «цепной» кариотипической эволюции плюрипотентных линий ЭСК мыши под влиянием экзогенной и эндогенной LIF-регуляции, объясняющая нестабильность хромосомного аппарата этих клеток при разных условиях культивирования in vitro. Впервые описана гетерогенность ЭСК мыши по наличию таких эпигенетических характеристик, как спонтанные G-банды и деспирализация перицентромерных районов метафазных хромосом, а также динамика частоты их возникновения при увеличении возраста культуры. Доказано, что эволюционные процессы в различных популяциях ЭСК мыши связаны с селекцией плюрипотентных клеток по их чувствительности к регуляторному белку LIF.
7. Впервые оценена перспектива использования метода микроинъекции как
дополнительного инструмента для получения первичных колоний эмбриональных клеток
из бластоцист мышей с разным генотипом, а также показана возможность использования
первичных колоний в качестве экспериментальной модели для изучения трофобласт-
эндометриальных взаимодействий в системе in vitro и выделения новых линий ЭСК.
Выявлено стимулирующее влияние рекомбинантного белка LIF на Са2+-зависимые
морфогенетические процессы на стадии формирования бластоциста.
Научно-практическое значение работы
Разработанные и изученные в данной работе экспериментальные модели перспективны для исследования сложных систем передачи регуляторных сигналов от плазматической мембраны клеток до динамики изменения состава клеточных популяций, молекулярных и клеточных механизмов дифференцировки, изучения функций регуляторных молекул и биологически активных веществ. В частности, разработанная на основе ЭСК тест-система для скрининга кардиоактивных фармакологических препаратов может быть использована как для исследовательских целей, так и иметь практическое значение для идентификации и определения биологической активности новых лекарственных препаратов. Данные о ключевой роли LIF в трофобласт-эндометриальных взаимодействиях и повышении выживаемости доимплантационных зародышей in vitro за
5 чет усиления пролиферативной активности клеток трофобласта могут представлять нтерес для решения проблем репродукции человека.
Результаты работы могут быть использованы как в научно-исследовательских, так образовательных учреждениях биологического и медицинского профиля для подготовки специалистов к работе с клеточными культурами и ранними зародышами.
Конкурсная поддержка работы
Работа выполнена в ИБК РАН по теме НИОКР «Роль цитокинов и ростовых факторов в регуляции роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей» (№ 0120.0 403628), а также при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований: грант № 97-04-48398 «Трансформация эмбриональных стволовых клеток мыши геном life целью изучения механизмов регуляции развития», грант № 00-04-48135 «Роль цитокина LIF в поддержании плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток in vitro и in vivo», грант № 04-04-48904 «Изучение пролиферации, жизнеспособности и направленной дифференцировки в генетически модифицированных линиях ЭСК мыши», грант № 05-04-49521 «Механизмы действия физических факторов на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей», Программы Президиума РАН «Разработка тест-системы для скрининга кардиоактивных препаратов на основе использования стволовых клеток» и грантов Президента РФ ведущих научных школ № НШ - 1842. 2003.4 «Механизмы рецепции химических и физических сигналов», № НШ - 2741. 2008.4, № НШ - 3202. 2010.4 «Рецепция сигналов химической и физической природы».
Личный вклад автора
Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на симпозиумах «Биология клетки в культуре» и «Клеточная биология на пороге XXI века», Санкт-Петербург (1998, 2006-2007), международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва (2003), междисциплинарном семинаре по проблемам использования стволовых клеток в медицине, Минск (2004), Съездах биофизиков России (1999, 2004), школе по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии», Звенигород (2005), международных конференциях: «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород (2005, 2009); «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи (2007); «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино (2009), International Congress «Gene diagnostics, gene therapy, and informational in Biotechnology», Ankara (1995), International Congress of Ecology, Voronezh (1996), Microinjection and Detection of Probes in Cell, Germany (2005), Biophysical chemistry meets molecular medicine, Portugal (2005), Workshop in Association with the European Commission «Stem cells: Policy, Research, and Innovations. European Union -
6 Russian Federation Perspectives», Moscow (2007), International Schools «Molecular Mechanisms of Regeneration: From Stem Cells to Organ Development, Function and Regeneration», «From Pluripotency to Senescence Molecular Mechanisms of Development, Disease and Ageing», Greece (2007, 2010), International Heinrich F.C. Behr Symposium «Stem Cells and Cancer», Germany (2010), ежегодных школах-конференциях «Биология -наука 21 века», Пушино (2001-2010), международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск (2010).
Материалы опубликованы в печати в виде тезисов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 50 статей, из них 28 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для защиты докторских диссертаций, и 22 статьи в сборниках и журналах, не вошедших в список ВАК.
Структура и объем диссертации
