Введение к работе
Актуальность проблемы.
Современные представления о молекулярных механизмах вкусовой трансдукции практически полностью базируются на данных молекулярно-биологических исследований периферического вкусового органа и на системных физиологических данных, полученных с использованием генетически модифицированных животных (нокаут-ные (knock-out) и трансгенные мыши). Первые позволили идентифицировать во вкусовой ткани ряд потенциально важных сигнальных белков, а вторые (поведенческие эксперименты и регистрации электрической активности афферентных вкусовых нервов) позволили продемонстрировать ключевую роль ряда из этих белков в восприятии вкусовых стимулов той или иной модальности. В настоящий момент общепризнано, что следующие сигнальные белки играют основополагающую роль в трансдукции вкусовых стимулов - от распознавания во вкусовой поре до передачи информации на нервное окончание:
1) Два семейства гептаспиральных вкусовых рецепторов, включая примерно 30 рецепторов семейства T2R, распознающие горькие вещества, и три рецептора семейства T1R, формирующие один гетеродимерный рецептор сладкого (T1R2/T1R3) и один рецептор аминокислот (T1R1/T1R3).
Альфа субъединица G-белка гастдуцина (а-гастдуцин), фосфолипаза С (32, ионный канал TRPM5, knock-out каждого из которых приводит к снижению или даже полному подавлению чувствительности генетически модифицированных животных к горькому, сладкому и умами вкусам.
Канальные белки PKD2L1 и субъединицы эпителиального натриевого канала (ENaC). Генетический нокаут PKD2L1 приводит к снижению чувствительности животных к кислому, удаление альфа-субъединицы ENaC приводит к подавлению ами-лорид-зависимой компоненты физиологических ответов на соленые стимулы.
Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторы, локализованные на нервных окончаниях, инервирую-щих вкусовую почку, knock-out которых приводил к полному исчезновению вкусовой чувствительности у мышей.
С использованием иммуногистохимии и гибридизации in situ был проанализирован профиль экспрессии вышеупомянутых белков в популяции клеток вкусовой почки, что позволило сделать довольно убедительные заключения о физиологических функциях вкусовых клеток различных подтипов, идентифицированных ранее на основе ультраструктурных критериев. Выяснилось, что вкусовые клетки типа II вклю-
чают 3 субпопуляции, ответственные за рецепцию горького, сладкого и умами, соответственно; вкусовые клетки III типа отвечают за восприятие кислого, а клетки I типа выполняют функции глиальных клеток и соленого-чувствующих рецепторных. Таким образом, на сегодняшний день ясны основные функции для клеток каждого морфоти-па, однако при всей значимости данных последних лет, полученных методами молекулярной биологии, иммуногистохимии и генной инженерии, существующие представления о процессах возбуждения вкусовых клеток носят в значительной степени гипотетический характер. Характерным в этом отношении является пример а-гастдуцина и ионного канала PKD2L1.
Ген а-гастдуцина был первым геном, относящимся ко вкусовой системе, который был подвергнут генетическому нокауту (Wong et al, 1996). Оказалось, что га-стдуцин-нуль мыши в поведенческих экспериментах демонстрируют сильно подавленную чувствительность к горькому и сладкому, но не к кислому и соленому. О том, что такие аномальные поведенческие реакции нокаутных животных обязаны своим происхождением именно изменениям в периферической вкусовой системе, свидетельствуют подавленные реакции вкусового нерва на аппликацию горьких и сладких стимулов в полости рта (Wong et al, 1996). Следует отметить, что а-гастдуцин относится к G; белкам и является близким гомологом а-трансдуцина - ключевого G-белка каскада фототрансдукции. На основании этих фактов долгое время считалось, по аналогии с фототрансдукцией, что гастдуцин сопрягает молекулярные рецепторы вкусовых веществ с каскадом циклических нуклеотидов. Однако в 2003 году (Zhang et al) было продемонстрировано, что нокаут фосфолипазы СР2 также приводит к почти полной потере чувствительности у мышей к горькому и сладкому, что заставило пересмотреть роль а-гастдуцина. Последний в покое ассоциирован с Р- и у-субъединицами в гетеротримерный G-белок, который при активации диссоциирует на гастдуцин и Ру-комплекс. Между тем, для Gi-белков показано, что Ру-комплекс, входящий в их состав, может активировать фосфолипазу С. На основании этого было предположено, что в случае нокаута а-гастдуцина сохраняющиеся партнеры по гете-ротримеру (Ру-комплекс) могут поддерживать в покое высокую активность фосфолипазы СР2, что нарушает работу каскада вкусовой трансдукции. После того, как развитие инструментальных методов позволило начать эффективные исследования молекулярных механизмов вкуса на клеточном уровне (Clapp et al, 2008), обнаружилось, что а-гастдуцин, вероятно, представляет собой конститутивно активный G-белок, регулирующий уровень циклических нуклеотидов даже в покоящейся рецепторной
клетке, что отражается на чувствительности сенсорных клеток к вкусовой стимуляции.
В случае PKD2L было показано, что генно-модифицированные мыши, у которых удалены клетки, содержащие PKD2L1, полностью теряли чувствительность к кислому (Huang et al, 2006). Этот факт был расценен как свидетельство ключевой роли канального белка PKD2L в трансдукции кислого, поскольку PKD2L является субъединицей протон-активируемого катионного канала. Используя другие генно-инженерные подходы, позже было установлено, что PKD2L не имеет такого принципиального значения для трансдукции кислого - полученные Хуангом и соавторами результаты связаны, скорее всего, с тем, что именно РКГ)2Ь-положительные клетки, относящиеся к типу III, являются кисло-чувствующими, и их разрушение естественно должно было подавить чувствительность животных к кислому.
Отметим также, что все больше накапливается фактов, которые свидетельствуют о том, что генетическое выключение одного гена может существенно влиять на активность экспрессии других генов. Таким образом, обсуждаемые в литературе механизмы вкусовой трансдукции необходимо проверять в физиологических экспериментах на уровне одиночных идентифицированных вкусовых клеток. Это целесообразно еще и потому, что именно при использовании такого подхода был достигнут заметный прогресс в области исследования сенсорных клеток других типов - фоторецеп-торных, обонятельных и механочувствительных клеток.
Совершенно неизученными остаются механизмы афферентной нейропередачи во вкусовых клетках типа П. Хотя эти клетки являются основными рецепторными для горького и сладкого вкуса, для них характерно отсутствие синаптических структур и других атрибутов классических химических синапсов, включая отсутствие пресинап-
9-І-
тических белков комплекса SNARE и потенциал-зависимых Са каналов. Еще одна проблема заключается в том, что вкусовые клетки типа II электрически возбудимы, но в отсутствии аксонов и классических Са -зависимых синапсов совершенно непонятна необходимость генерации ими потенциалов действия. Надо отметить, что физиологическая роль электрической возбудимости во вкусовых клетках других типов также не ясна. Во многом остаются неизученными механизмы электрогенеза во вкусовых клетках и природа их ионной проницаемости. Крайне мало известно и о функциональных свойствах клеток типов I-III, что делает актуальным анализ физиологических особенностей каждого из них, поскольку ранее немногочисленные физиологические исследования проводились преимущественно с использованием неидентифи-цированных клеток вкусовой почки. Это делает целесообразным всеобъемлющее фи-
зиологическое исследование популяции клеток вкусовой почки млекопитающих.
Цель исследования.
Провести комплексный физиологический анализ гетерогенной популяции клеток вкусовой почки млекопитающих (на примере мыши) из желобоватого, листовидного и грибовидного вкусовых сосочков, используя современные методы клеточной и молекулярной физиологии, и тем самым решить ряд проблем физиологии периферического органа, включая выяснение механизмов афферентной нейропередачи вкусовой информации, механизмов электрогенеза вкусовых клеток и роли электрической возбудимости в их физиологии.
Основные задачи исследования.
С использованием методов флуоресцентной микроскопии провести анализ гетерогенной популяции одиночных вкусовых клеток и охарактеризовать функционально клетки различных морфотипов. В частности, проанализировать агонист-зависимую Са сигнализацию во вкусовых клетках и исследовать механизмы Са сигнализации.
Установить корреляции между фармакологическими, а также обнаруженными нами ранее электрофизиологическими портретами индивидуальных вкусовых клеток и профилем экспрессии генов определенных сигнальных и маркерных белков. Целесообразность выявления таких корреляций диктуется необходимостью установления функциональных критериев для идентификации и последующего исследования индивидуальных вкусовых клеток, применимых в физиологических экспериментах.
Провести сравнительный анализ механизмов электровозбудимости идентифицированных вкусовых клеток и, в частности, очертить спектр и охарактеризовать биофизические свойства ионных каналов, вовлеченных в генерацию потенциала действия во вкусовых клетках типа II и типа III.
Изучить механизмы афферентной нейропередачи во вкусовых клетках идентифицированных морфотипов.
Отработать методы исследования рекомбинантных канальных белков для создания биосенсоров и для сравнительного анализа ионных каналов вкусовых клеток in situ и в экспрессионной системе с целью изучения их биофизических свойств. Исследовать селективность, потенциалзависимость, термочувствительность, чувствительность к блокаторам некоторых из них.
6. Отработать методы мониторинга высвобождения сигнальных молекул из
вкусовой почки и одиночной вкусовой клетки с использованием метода биосенсора -культивируемых клеток, эндогенно/экзогенно экспрессирующих молекулярные рецепторы к исследуемым агонистам.
Научная новизна работы.
На основе статистически репрезентативной серии экспериментов впервые предложены неинвазивные критерии для идентификации морфофункциональных типов вкусовых клеток. Впервые показано, что для клеток различных морфотипов, идентифицированных на основе специфических маркеров, характерен специфический
9-І-
спектр агонистов, способных стимулировать Са сигнализацию. Ранее предложенные нами электрофизиологические критерии с учетом новых результатов по экспрессии специфических белков во вкусовых клетках, исследованных методом пэтч-кламп, позволили нам применить данные критерии для идентификации 3 известных морфофункциональных типов клеток вкусовой почки.
Впервые исследованы механизмы секреции АТФ вкусовыми клетками в ответ на вкусовую стимуляцию. Показано, что для нейропередачи используется АТФ мито-хондриального, а не гликолизного происхождения. Показано, что одиночные вкусовые клетки типа II высвобождают АТФ через потенциал-зависимые АТФ-проницаемые ионные каналы в ответ на деполяризацию плазматической мембраны -ключевого явления вкусовой трансдукции, опосредованного активацией катионного канала TRPM5. На основании экспериментов с животными с нокаутированным геном Panxl, ингибиторного анализа, а также исследования свойств рекомбинантного Panxl впервые получены свидетельства, что канальный белок Panxl, который рассматривался в качестве основного претендента на роль АТФ-проницаемого канала, не вовлечен в секрецию АТФ во вкусовых клетках типа П. Эти данные, а также ингибиторный анализ АТФ-проницаемых каналов вкусовых клеток свидетельствуют о том, что такие каналы формируются белками щелевых контактов - коннексинами.
Впервые исследована роль потенциалов действия (ПД) в афферентной нейропе-редаче во вкусовых клетках и, в частности, показано, что ПД обеспечивают квантовый характер высвобождения афферентного нейромедиатора АТФ из клеток типа П. Впервые разработана математическая модель потенциал-зависимой секреции АТФ при участии АТФ-проницаемых ионных каналов.
Исследована чувствительность вкусовых клеток к различным агонистам. Впер-
вые показано, что в клетках III типа функционально активен гептаспиральный рецептор внеклеточного кальция (CaSR), обеспечивающий чувствительность этих клеток к аминокислотам (глутамату, фенилаланину и аргинину) и дивалентным катионам. Показано, что клетки I типа отвечают на нейроактивные вещества (АТФ, АДФ, УТФ, ацетилхолин и карбахол, глутамат в микромолярных концентрациях) и горькое веще-
9-І-
ство денатоний мобилизацией внутриклеточного кальция и стимуляцией Са -активируемых СГ-каналов.
Научно-практическая ценность.
Полученные результаты позволили сформировать совершенно новое представление о механизмах афферентной нейропередачи и межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Значительно расширены существующие представления о механизмах электрогенеза и возбудимости клеток вкусовой почки. В частности, впервые рассмотрена и экспериментально обоснована новая физиологическая функция потенциалов действия - регуляция и дискретизация невезикулярного высвобождения нейромедиатора. Методические разработки, использовавшиеся в работе, особенно метод биосенсора для мониторинга первичных медиаторов, включая АТФ и серотонин, могут представлять интерес для исследования других клеточных систем. Данные, полученные при исследовании рекомбинантного паннексина 1, могут быть использованы при выяснении физиологической функции этого канала в различных системах.
Личный вклад автора.
Все результаты по функциональному анализу вкусовых клеток с использованием широкого спектра методов (пэтч-кламп; флуоресцентная микроскопия, мониторинг внутриклеточного кальция, загрузка флуоресцентных зондов и красителей; математическое моделирование) были получены лично Р.А. Романовым. Результаты экспериментов, выполненных при использовании сочетания биофизических методов с методами молекулярной биологии и культуры клеток, были получены совместно с О.А. Рогачевской и М.Ф. Быстровой.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации были представлены на «X международном Съезде по биосенсорам» (Шанхай, Китай, 2008г.); на международном симпозиуме по TRP-каналам (Стокгольм, Швеция, 2009); на международной конференции «Новые горизонты в кальциевой сигнализации» (Пекин, Китай, 2010); на XXI съезде Европейской организации хеморецепторных исследований (Манчестер, Англия,
2011); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009, 2011гг.); на международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, Беларусь, 2008); на международной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.Петербург, 2009); на 20-том и 21-ом съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (2008, 2010); на V съезде Украинского общества нейронаук (Киев, 2011).
Публикации.
Основные результаты диссертации представлены в 42 печатных работах, в числе которых 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в книге, включенной в систему цитирования Web of Science, 5 статей в сборниках.
Структура и объем диссертации.
