Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая характеристика заболевания 11
1.2. Краткая характеристика возбудителя 12
1.3. Патогенез гриппа 14
1.4. Патологическая анатомия гриппа 24
1.4.1. Поражения органов дыхательной системы 24
1.4.1.1. Поражения верхних дыхательных путей, трахеи и крупных бронхов 25
1.4.1.2. Поражения мелких бронхов и бронхиол 25
1.4.1.3. Поражения респираторных отделов легких 26
1.4.2. Поражения других органов 29
1.4.3. Сравнение патоморфологии инфекций, вызванных вирусом гриппа H1N1 Калифорния и циркулировавшими ранее разновидностями вируса гриппа 31
1.5. Экспериментальные модели гриппа 35
1.6. Заключение 37
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Секционный материал и методы его исследования 39
2.1.1. Иммунофлуоресцентное и иммуногистохимическое исследование секционного материала 39
2.1.2. Морфометрическое исследование секционного материала 40
2.1.3. Электронно-микроскопическое исследование секционного материала 40
2.2. Экспериментальный материал и методы его исследования 41
2.2.1. Определение инфекционного титра вируса гриппа в легких экспериментальных животных 42
2.2.2. Морфометрическое и иммуногистохимическое исследование секционного материала 43
Глава 3. Результаты собственных исследований 44
3.1. Общая характеристика изменений легких и других органов умерших от гриппа в 2009-11 гг 44
3.2. Клинический случай развития при гриппе генерализованного хламидиоза 64
3.3. Общая характеристика изменений легких и других органов при экспериментальном гриппе у белых беспородных мышей 76
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 86
Выводы 91
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Список литературы 100
- Патогенез гриппа
- Общая характеристика изменений легких и других органов умерших от гриппа в 2009-11 гг
- Клинический случай развития при гриппе генерализованного хламидиоза
- Общая характеристика изменений легких и других органов при экспериментальном гриппе у белых беспородных мышей
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Грипп широко распространен во всем мире, вызывая ежегодные эпидемии, принимающие, в некоторых случаях, глобальный характер (Деева Э.Г., 2008; Онищенко Г.Г., 2013; Покровский В.И., Киселев О.И., 2005; Ansart S. et al., 2005). В конце XX в. только в Соединенных Штатах Америки грипп приводил к 20000-40000 летальных исходов ежегодно (Ghendon Y., 1992). При этом помимо летальных исходов, непосредственно связанных с острым гриппом, инфекция приводит к усугублению фоновой соматической патологии и так называемой «скрытой» или «вторичной» смертности (Zambon M.C., 1999).
Экономические потери, связанные с гриппом оцениваются в миллиарды долларов только в США (Wood S.C. et al., 2000). По данным K.L. Nichol (2001) в США вакцинация позволяет сэкономить $30,35 на каждого вакцинированного. Это обусловлено сокращением числа обращений за медицинской помощью, уменьшением количества дней, пропущенных по болезни, и сохранением высокой производительности труда.
Тем не менее, несмотря на многочисленные успехи фармакотерапии и вакцинопрофилактики гриппа, его эпидемическое значение практически не уменьшается из-за непрерывного изменения генома вируса гриппа (Киселев О.И., 2009; Taubenberger J.K. et al., 1997; Zimmer S.M, Burke D.S., 2009). Актуальность проблемы гриппа также подтверждают эпидемиологические данные, согласно которым заболеваемость и смертность во время пандемии «свиного» гриппа 2009-2010 гг. сопоставимы с соответствующими показателями пандемий 1957 г. («Азиатский грипп»), 1968-1969 гг. («Гонконгский грипп») и даже 1918-1919 гг. («Испанский грипп») (Деева Э.Г., 2008; Киселев О.И., 2009; Киселев О.И. и соавт., 2010; Киселев О.И. и соавт., 2003; Sullivan S. J. et al., 2010).
Хотя основными способами диагностики являются вирусологический, клинический и эпидемиологический, во многих случаях посмертная морфологическая диагностика играет важную роль, особенно в случаях с атипичными клиническими проявлениями, когда в силу разных причин не были проведены прижизненные вирусологические исследования. Кроме того, без морфологических исследований у умерших практически невозможно решать важнейшие вопросы, связанные с пато- и танатогенезом гриппа, такие как выявление клеток-мишеней в органах дыхания, верификация внелегочных поражений и достоверное установление непосредственных причин смерти.
Однако многие аспекты патоморфологии гриппа в настоящее время изучены недостаточно. Критерии морфологической диагностики современного гриппа не вполне ясны. Диагностика гриппа подробно освещена в работах А.В. Цинзерлинга, опубликованных в 70-е гг. XX в. (Цинзерлинг А.В., 1970; Цинзерлинг А.В., 1977), однако для применения разработанных им положений в современных условиях необходимо провести сравнительную характеристику патоморфологических изменений, отмеченных при гриппе в 70-е гг. XX в. и наблюдаемых в настоящее время.
Цель исследования
Определить особенности морфологических изменений и патогенеза гриппа H1N1 Калифорния при его тяжелом клиническом течении в сравнении с экспериментальной инфекцией.
Задачи исследования
1. Дать характеристику структурных изменений в легких, головном мозге и сердце при летальных исходах, связанных с гриппом H1N1 Калифорния в сравнении с изменениями, наблюдавшимися при гриппе в предшествующие эпидемии.
2. Охарактеризовать вирусиндуцированные изменения клеток в пораженных органах и оценить их диагностическую значимость.
3. Описать структурные изменения у экспериментальных животных, зараженных разными штаммами вируса гриппа, и сравнить их с данными, полученными при изучении секционного материала.
4. Изучить возможность развития при гриппе генерализованной инфекции и дать ее морфологическую характеристику на секционном и экспериментальном материале.
5. На секционном материале умерших от гриппа выявить поражения обусловленные другими возбудителями, описать связанные с ними структурные изменения и оценить их роль в танатогенезе.
Научная новизна
Проведена подробная оценка цитопатического и цитопролиферативного эффекта вируса гриппа H1N1 Калифорния на секционном и экспериментальном материале. Дана подробная характеристика вирусиндуцированных изменений клеток мерцательного эпителия, альвеолоцитов и альвеолярных макрофагов.
На клиническом и экспериментальном материале доказана способность вируса гриппа H1N1 Калифорния вызывать генерализованную инфекцию с поражением головного мозга и сердца.
Продемонстрировано наличие вирусиндуцированных изменений клеток вплоть до 2-3 недели заболевания.
Показана возможность развития на поздних сроках гриппозной инфекции тяжелого генерализованного хламидиоза, явившегося причиной смерти.
Теоретическая и практическая значимость
Доказана способность вируса гриппа H1N1 Калифорния вызывать как цитопатические, так и пролиферативные изменения в клетках мерцательного эпителия, альвеолоцитах и альвеолярных макрофагах.
Доказано значение в патогенезе гриппа специфических изменений, индуцированных непосредственно вирусом гриппа, а также неспецифических изменений, связанных с системной воспалительной реакцией и активацией вторичной микробиоты, таких как диффузное альвеолярное повреждение, являющееся морфологическим эквивалентом острого респираторного дистресс-синдрома взрослых.
Обосновано применение экспериментальной модели гриппа H1N1 Калифорния на белых беспородных мышах для воспроизведения основных морфологических проявлений инфекции.
Методология и методы исследования
Выполнение работы базируется на представлениях школы члена-корреспондента РАМН профессора А.В. Цинзерлинга (1923-1995) о развитии при гриппе характерных морфологических изменений в легких, головном мозге и ряде внутренних органов, которые в зависимости от свойств возбудителя могут несколько варьировать. Представители этой школы придают первостепенное значение разграничению поражений, непосредственно связанных с вирусом гриппа, и разнообразных осложнений вызванного им заболевания.
Выбранные методы исследования являются классическими для патологоанатомов, изучающих инфекционную патологию: сопоставление морфологических и вирусологических данных на клиническом (аутопсийном) и экспериментальном материале. Принципиальным является использование методов, направленных на выявление возбудителей в тканях, и дифференцированная оценка тканевых реакций. В настоящем исследовании для достижения этих целей были использованы современные методологические подходы, прежде всего иммуногистохимические исследования.
Положения, выносимые на защиту
1. Морфологические проявления гриппа характеризуются как специфичными для гриппа изменениями клеток мерцательного эпителия, альвеолоцитов и альвеолярных макрофагов, так и неспецифичным диффузным альвеолярным повреждением (острым респираторным дистресс-синдромом взрослых).
2. Характерные для гриппа H1N1 Калифорния изменения клеток отличаются более выраженными пролиферативными изменениями и увеличением ядерно-цитоплазматического коэффициента по сравнению с соответствующими изменениями клеток, наблюдавшимися при гриппе в предшествующие эпидемии.
3. Вирус гриппа H1N1 Калифорния способен приводить к генерализованной инфекции с преимущественным поражением головного мозга и сердца.
4. Грипп H1N1 Калифорния может протекать как смешанная инфекция, но в 2009-11 гг. сочетание гриппа H1N1 Калифорния с бактериальной инфекцией встречалась редко; в то же время в единичном наблюдении было выявлено сочетание гриппа H1N1 Калифорния с генерализованным хламидиозом.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обеспечена использованием широкого набора морфологических методов, включая иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное исследование, а также электронную микроскопию, на клиническом и экспериментальном материале в сопоставлении с вирусологическими данными. При морфологической оценке характерных для гриппа клеток проведено морфометрическое исследование со статистической обработкой (критерий Стьюдента).
Полученные результаты опубликованы в 6 работах, из которых 3 работы опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией. Материалы доложены на всероссийской конференции памяти О.К. Хмельницкого (2011 г.), конференциях молодых ученых Санкт-Петербургского университета «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (2011-2012 гг.), научно-практической конференции, проведенной НИИ гриппа (2011 г.).
Личный вклад автора
Автор разработал план исследования, изучил литературные источники прежних лет, провел поиск современных источников, имеющих отношение к теме исследования. Автором проведен анализ протоколов патологоанатомических вскрытий из ряда больниц Санкт-Петербурга и Ленинградской области и изучены соответствующие микропрепараты. Иммуногистохимические исследования аутопсийного материала проведены совместно с сотрудниками НИИ Гриппа (д.б.н. И.Н. Жилинская) и использованы в диссертации в рамках совместной публикации. Разработан план и проведены морфометрические исследования и статистическая обработка их результатов.
Автор совместно с научным руководителем и сотрудником НИИ гриппа к.б.н. В.В. Зарубаевым принял участие в разработке плана экспериментального исследования, лично участвовал в заражении животных, их забое, заборе материала для вирусологического и гистологического исследований. Автор лично проводил гистологические исследования экспериментального материала.
Вирусологические и иммуногистохимические исследования были проведены совместно с к.б.н. В.В. Зарубаевым и д.б.н. И.Н. Жилинской и использованы в диссертации в рамках совместной публикации. В одном наблюдении иммуногистохимическое исследование было проведено совместно с к.м.н. В.Е. Каревым, иммунофлуоресцентное исследование было проведено совместно с к.м.н. Н.В. Семеновым, и электронно-микроскопическое исследование было проведено в НИИ гриппа совместно с к.б.н. В.В. Зарубаевым и к.б.н. А.К. Сироткиным.
А.К. Сироткину
Автор выражает признательность научному руководителю, д.м.н., проф., В.А. Цинзерлингу, д.б.н. И.Н. Жилинской, к.б.н. В.В. Зарубаеву, к.м.н. В.Е. Кареву, к.м.н. Н.В. Семенову и к.б.н. А.К. Сироткину за помощь в совместных исследованиях.
Публикации
По материалам диссертации автором опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы – в ведущих рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 113 страницах печатного текста, состоит из 4-х глав и содержит 41 рисунок и 3 таблицы.
Патогенез гриппа
Как известно, вирус гриппа был открыт в 1933 г. W. Smith, С. Andrewes, Р. Laidlow (Taubenberger J.K., Morens D.M., 2008).
Вскоре после его открытия во многих странах мира началось интенсивное изучение этой инфекции на клиническом материале и в эксперименте.
В СССР наиболее полные исследования экспериментального гриппа (у мышей) были начаты В.Е. Пигаревским в конце 50-х гг. XX в. и проводились в тесном сотрудничестве с крупнейшим вирусологом А.А. Смородинцевым (Пигаревский В.Е., 1964). В те годы была дана подробная гистологическая характеристика изменений легких, обусловленных различными штаммами вируса гриппа А. Были подробно охарактеризованы различные типы внутриклеточных включений.
Изучению гриппа, как на секционном, так и на экспериментальном материале, были посвящены и исследования Н.А. Максимович и ее сотрудников, позволившие охарактеризовать особенности структурных изменений при гриппе в сравнении с изменениями, обусловленными другими респираторными вирусами (Максимович Н.А., Горин В.И., 1980). В этих исследованиях было начато обсуждение возможности развития при гриппе внелегочных поражений и появления вирусно-бактериальных ассоциаций.
Определенным этапом изучения патоморфологии гриппа явились исследования В.Н. Парусова (1981), в которых были суммированы результаты многочисленных экспериментальных работ и проанализирован ряд летальных исходов у людей. Подробно охарактеризованы ассоциации гриппа со стафилококковой инфекцией. Выдвинуто положение о различиях в клинико-морфологических проявлениях на разных сроках гриппозной инфекции.
Однако, всеми перечисленными авторами мало освещались критерии морфологической диагностики гриппа и сущность его внелегочных проявлений, а также ассоциации гриппа с небактериальными возбудителями. А.В. Цинзерлингом и его сотрудниками дана наиболее полная морфологическая характеристика гриппа у умерших детей (Цинзерлинг А.В., 1970; Цинзерлинг А.В., 1977), а также взрослых (Цинзерлинг А.В. и соавт., 1973) и, в меньшей степени, на экспериментальном материале (Цинзерлинг А.В. и соавт., 1980; Zinserling A.V. et al., 1983). В этих работах, выполненных преимущественно в 70-80-е гг. XX в., проводились сопоставления структурных изменений с результатами иммунофлуоресцентного исследования, серологическими данными (РСК и РТГА) и, в некоторых случаях, данными, полученными при электронной микроскопии и выделении вируса на куриных эмбрионах. Методические возможности в то время не позволили точно идентифицировать клетки-мишени, поражаемые вирусом гриппа. Морфологические исследования, посвященные гриппу в последующие годы, проводились во всем мире лишь в очень ограниченном объеме (Lucas S., 2010).
Основным источником инфекции при гриппе является больной человек с клинически выраженными и атипичными формами заболевания. Вместе с тем, последние вспышки гриппа (например, в Гонконге в 1997 г.) дают основания предполагать, что возможна передача вируса типа А от животного (птицы) к человеку.
Передача инфекции от человека к человеку происходит преимущественно воздушно-капельным путем. Вирус со слизистых оболочек дыхательных путей выделяется в большом количестве при дыхании, чихании, кашле, разговоре. Существует вероятность передачи инфекции через предметы обихода, игрушки, белье, посуду. Возможна и гематогенная трансплацентарная передача вируса от беременной женщины к плоду (Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф., 2002).
Выделение вируса от больных при неосложненном течении гриппа обычно заканчивается к 4-5-му дню от начала заболевания. При пневмонии, осложняющей течение гриппа, вирус обнаруживается в организме до 2 - 3 нед. с момента заболевания. Вирусы гриппа постоянно циркулируют среди населения. (Patel М., 2010; Sullivan S.J. et al., 2010).
При инфицировании вирус гриппа оказывает на них следующие эффекты:
цитопатическое (цитолитическое) действие на эпителий прежде всего бронхов, трахеи и альвеол, а также нейроэпителий, клетки трофобласта, а возможно и другие, вызывает их альтерацию, дистрофию, некроз, десквамацию;
вазопатическое (вазопаралитическое) действие (полнокровие, стазы, плазмо- и геморрагии);
иммунодепрессивное действие: угнетение активности нейтрофилов (подавление фагоцитоза), моноцитарных фагоцитов (подавление хемотаксиса и фагоцитоза), иммунной системы (развитие аллергии, появление токсических патогенных иммунных комплексов) (Цинзерлинг А.В., Цинзерлинг В.А., 2002).
Следует отметить, что существуют два основных варианта развития заболевания в зависимости от особенностей механизма заражения.
Один из них более характерен для тяжелого течения заболевания в эпидемический период. Мелкодисперсная аэрозоль, содержащая вирус, образуется при сильном чихании и кашле больного, в силу биофизических закономерностей проникает непосредственно в респираторные отделы легких. Вирус проникает в клетки альвеолярного эпителия и макрофаги и начинает в них размножаться при минимальной реакции со стороны нейтрофильных лейкоцитов. Это сопровождается массивным выбросом цитокинов (интерлейкина 1, ФНО и др.), что может рассматриваться как неспецифическая системная воспалительная реакция. Ее клиническим эквивалентом является лихорадка, недомогание, головная боль, ломота в суставах и др. при отсутствии катаральных явлений, которые присоединяются через 2-3 дня и являются следствием гематогенного или контактного распространения вируса гриппа на эпителий выше лежащих респираторных путей (Киселёв О.И. и соавт. 2012). Принципиально возможна, особенно у детей раннего возраста и ослабленных лиц, и более массивная гематогенная генерализация процесса с поражением других органов, прежде всего мягких мозговых оболочек и хориоидальных сплетений (Цинзерлинг А.В., ЦинзерлингВ.А., 2002).
Второй вариант возможен в случае формирования при катаральных явлениях у больного более крупных содержащих вирус капель жидкости. Их адсорбция происходит на слизистой оболочке носа, гортани, трахеи. Следствием проникновения вируса в клетки мерцательного эпителия и размножения в них является развитие катарального воспаления с соответствующей клинической симптоматикой ринита, ларингита, трахеита. При этом общее состояние пациента может существенно не меняться. Возможно распространение вируса на нижележащие отделы дыхательной системы (бронхи, респираторные отделы), что ведет к появлению соответствующей клинической симптоматики (Киселёв О.И. и др., 2012; Streng A. et al., 2011; Sullivan SJ. et al., 2010). Позднее может произойти и дальнейшая генерализация инфекции.
Гриппозная инфекция приводит к подавлению иммунитета, а при внедрении вторичной бактериальной флоры через некротизированную поверхность слизистой оболочки дыхательных путей могут возникнуть различные осложнения. Наиболее частое и серьезное осложнение гриппа - острая пневмония. Она обычно носит смешанный вирусно-бактериальный характер вне зависимости от сроков ее возникновения (Цинзерлинг А.В., Цинзерлинг В.А., 2002).
Воспалительный процесс в легких может быть обусловлен присоединением различной микробиоты (чаще всего пневмококков и стафилококков), но в последние годы приобретает значение другая флора (микоплазма, хламидия пневмонии, золотистый стафилококк), а при тяжелом течении пневмонии -грамотрицательная микрофлора (Цинзерлинг А.В., Цинзерлинг В.А., 2002).
В патогенезе поражения трахеобронхиального дерева несомненную роль играет иммунный ответ организма, выработка интерлейкинов, фактора некроза опухоли, иммуноглобулинов, а также состояние лимфоидной ткани бронхов и трахеи. Особое значение имеет активные формам кислорода, образуемые нейтрофилами под воздействием вируса гриппа. Под действием окислителей повреждаются клеточные мембраны, что является важнейшим условием распространения вирусов от клетки к клетке, вплоть до генерализации инфекции (Itoh Y. et al., 2009).
В свою очередь, инфицированные вирусом клетки начинают вырабатывать и выделять интерферон, препятствующий распространению вируса. Защите от вируса способствуют также неспецифические термолабильные В-ингибиторы и секреторные антитела класса IgA. Параллельно с гибелью части эпителия происходит регенерация базальных клеток и частичное восстановление барьерной функции слизистой оболочки. В местной защитной реакции важная роль принадлежит интерферону, который обнаруживается в носовой слизи, крови, лёгочной ткани. Его синтез стимулирует повышение температуры тела и накопление недоокисленных метаболитов. В защите организма участвует лихорадка, воспалительная реакция, тканевые ингибиторы, рибонуклеаза. С 9-10 суток болезни в крови и носовом секрете появляются антитела, относящиеся к IgA. Развивается также гуморальный иммунитет, обусловленный IgG- и IgM-антителами. У лиц, перенесших грипп А, иммунитет сохраняется около 2-3 лет, грипп В — 3-5 лет, грипп С - пожизненно (Киселёв О.И. и соавт., 2012).
Инкубационный период продолжается от 12 до 48 часов, хотя может увеличиваться до 3-х дней. Длительность инкубационного при гриппе A (H5N1) обычно составляет 2-3 дня с колебаниями от 1 до 7 дней (Киселёв О.И. и соавт., 2012). В клинической картине заболевания ведущую роль играют два основных синдрома - интоксикации и поражения дыхательных путей (катаральный синдром).
Общая характеристика изменений легких и других органов умерших от гриппа в 2009-11 гг
В работе был использован аутопсийный материал из различных стационаров Санкт-Петербурга и Ленинградской областей, полученный в периоды эпидемического подъема заболеваемости 2009-2011 гг. Во всех случаях диагноз гриппа был подтвержден полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией. Всего был проанализирован 31 летальный исход с подтвержденным гриппом НШ1 Калифорния.
Среди умерших было 20 мужчин и 11 женщин, из них в возрасте от 15 до 20 лет — 1 человек, от 21 года до 25 лет — 2 человека, от 26 до 30 лет — 9 человек, от 31 года до 35 лет - 6 человек, от 36 лет до 40 лет - 4 человека, от 41 года до 45 лет - 2 человека, от 46 лет до 50 лет - 3 человека, от 51 года до 55 лет - 3 человека, от 61 года до 65 лет - 1 человек. Продолжительность заболевания до наступления летального исхода составила: менее 3 суток - в 1 наблюдении, от 3 суток до 7 суток - в 2 наблюдениях, от 8 суток до 14 суток - в 10 наблюдениях, от 15 суток до 21 дня - в 12 наблюдениях, от 22 до 28 суток - в 4 наблюдениях, от 29 до 35 суток - в 1 наблюдении и от 36 до 42 суток — в 1 наблюдении. 25 человек умерло ноябре-декабре 2009 г., 6 человек - в феврале-марте 2011 г.
Клинически заболевание протекало с характерной симптоматикой. Тяжелых фоновых и сопутствующих заболеваний отмечено не было. Во всех случаях диагноз гриппа был поставлен прижизненно, и пациенты получали противовирусную, антибактериальную и патогенетическую терапию.
При макроскопическом исследовании отмечалось умеренное количество серозного экссудата в просвете дыхательных путей. Слизистая оболочка гладкая, местами с выраженной гиперемией. Легкие резко уплотнены, красного цвета с неравномерной воздушностью (Рисунок 2). В некоторых случаях прозекторы использовали термин «красное опеченение». В большинстве случаев участков уплотнения легких серовато-зеленого цвета не наблюдалось, гнойного экссудата в просвете дыхательных путей не было. Со стороны других внутренних органов и головного мозга значимых характерных макроскопических изменений не отмечалось.
При гистологическом исследовании в трахее и крупных бронхах было отмечено умеренно выраженное катаральное воспаление, местами с некротическими изменениями и нейтрофильной инфильтрацией. Эпителий трахеи часто слущивался при характерном увеличении клеток в размерах, как за счет ядра, так и за счет цитоплазмы (Рисунок 3).
В мелких бронхах и респираторных отделах легких определялись резкое снижение воздушности легочной ткани, серозный экссудат и резкое полнокровие сосудов легких, в ряде случаев с образованием фибриновых микротромбов (Рисунок 4). В отдельных наблюдениях в просветах альвеол наблюдались гиалиновые мембраны.
В 12 из 31 (37%) случая была отмечена умеренно выраженная очаговая нейтрофильная инфильтрация в просвете и стенках бронхов, а также в альвеолах, расцененная как присоединение бактериальной инфекции, что позволило говорить о смешанной вирусно-бактериальной пневмонии (Рисунок 5). Следует отметить, что в некоторых участках легких были изменения клеток, которые были расценены как вирусиндуцированные.
В двух наблюдениях нейтрофильная инфильтрация была значительно более плотной, отграниченной от окружающей ткани, что позволило говорить о начинавшемся абсцедировании (Рисунок 6).
Следует отметить, что частота бактериальной наслойки была значительно меньшей описанной всеми авторами в предшествующие годы наблюдений. При этом обструктивных пневмоний, рассматриваемых в прежние годы как типичные для «осложненного гриппа», практически не было.
Наряду с проявлениями ДАП и бактериальных пневмоний закономерно определялись изменения, расцененные как вирусиндуцированные. К ним были отнесены изменения со стороны эпителия воздухоносных путей, альвеолярных макрофагов и альвеолоцитов. Обращали на себя внимание и изменения эндотелия кровеносных сосудов.
Мерцательный эпителий бронхов и бронхиол был большей частью сохранен, но начиная со второй недели заболевания отмечено образование многорядных структур, представленных клетками с крупными светлыми ядрами (Рисунок 7). Отдельные клетки эпителия становились многоядерными.
В просвете альвеол закономерно определялись измененные альвеолярные макрофаги и слущенные альвеолоциты, несколько увеличенные в размерах как за счет ядер, так и за счет цитоплазмы. При этом представлялось возможным выделить несколько вариантов таких поражений.
Во-первых, отмечены клетки с относительно крупными светлыми ядрами и существенно увеличенной цитоплазмой, активно окрашенной эозином, изредка с легким базофильным оттенком. С учетом сходства этих клеток с гриппозными клетками, описанными еще в 70-х гг. XX в. (Цинзерлинг А.В., 1977), они были условно обозначены как «гриппозные клетки 1-го типа» (Рисунок 8).
Кроме того, наблюдались несколько иные изменения, а именно, появление крупных светлых ядер с несколько подчеркнутыми ядрышками в клетках с небольшой цитоплазмой. При этом во многих клетках присутствовали два, три или более ядра. Такие клетки были условно обозначены как «гриппозные клетки 2-го типа» (Рисунок 9).
Эндотелий кровеносных сосудов разного калибра приобретал крупные светлые ядра, часто неправильной формы, лежавшие в несколько рядов. Для доказательства непосредственной связи описанных изменений с вирусом гриппа в отдельных случаях были проведены иммуногистохимические и иммунофлуоресцентные исследования. При иммуногистохимическом исследовании легких нуклеопротеин и гемагглютинин были выявлены в клетках различных типов: альвеолоцитах, альвеолярных макрофагах, эндотелии сосудов и мерцательном эпителии (Рисунок 10, Рисунок 11).
Для более подробной морфологической характеристики «гриппозных клеток» разных типов были проведены морфометрические исследования, результаты которых показаны в Таблице 1.
Изображения гриппозных клеток 1 типа были получены при микроскопии архивных микропрепаратов 70-х гг. XX в.
Из Таблицы 1 видно, что описанные в данной работе гриппозные клетки 2 типа, характерные для гриппа H1N1 Калифорния, крупнее (р 0,05) гриппозных клеток, описанных А.В. Цинзерлингом, и отличаются от них большим ядерно-цитоплазматическим коэффициентом (р 0,05).
Следует, однако, отметить, что в некоторых клетках были изменения, свойственные как для 1, так и для 2 типа, поэтому их разграничение несколько условно.
Клинический случай развития при гриппе генерализованного хламидиоза
В одном из случаев гриппа H1N1 Калифорния удалось провести полное морфологическое исследование, включая иммуногистохимическое, иммунофлуоресцентное и электронно-микроскопическое исследование.
Мужчина В., 31 год, социально адаптированный, гиперстенической конституции, без хронических заболеваний в анамнезе, заболел остро 15 февраля 2011 г. с повышением температуры до 39С, кашлем, был вынужден спать сидя, самостоятельно принимал «Антигриппин». При госпитализации 18 февраля 2011 г. отмечены продуктивный кашель и выраженная слабость, состояние средней тяжести.
Диагноз при поступлении: грипп, двусторонняя пневмония, дыхательная недостаточность I-II степени.
За время пребывания в стационаре отмечено прогрессирование дыхательной недостаточности, в связи с чем больному проводилась ИВ Л и 23 февраля 2011 г. была выполнена нижняя трахеостомия. Несмотря на проводимую интенсивную терапию состояние пациента прогрессивно ухудшалось. Смерть наступила 22 марта 2011 г. при остановке кровообращения на фоне полиорганной недостаточности и отека головного мозга.
В анализах крови отмечался нарастающий лейкоцитоз со сдвигом влево при прогрессирующей анемии и повышении СОЭ.
Рентгенологически отмечалась очаговая и сливная инфильтрация, преимущественно в нижних долях легких, без положительной динамики.
Диагноз «грипп H1N1 Калифорния» был подтвержден серологически (титр антител при повторном РТГА крови 1/160-1/640) и по результатам ОТ-ПЦР.
Клинический диагноз
Основное заболевание: грипп A (H1N1), тяжелая форма, позднее поступление.
Осложнения: Двусторонняя вирусно-бактериальная пневмония. Острый респираторный дистресс-синдром, дыхательная недостаточность III степени. Рецидивирующий альвеолярный отек легких. ИВЛ, нижняя трахеостомия от 23 февраля 2011 г. Прогрессирующая полиорганная недостаточность. Отек головного мозга.
На вскрытии (протокол вскрытия № 4219/81, прозектор Д.В. Комарова) кожные покровы бледно серого цвета с очаговыми кровоизлияниями в клетчатке конечностей и туловища. Подкожная клетчатка с очень толстым слоем жировой ткани, в передней брюшной стенке толщина подкожной жировой клетчатки до 10 см. В надпупочной области по срединной линии грыжевое выпячивание диаметром до 6 см (диаметр грыжевых ворот 2,5 см), содержащее неизмененный фрагмент большого сальника. Мышцы развиты удовлетворительно, на разрезе синюшно-красные, блестящие. Кости и суставы не изменены. Отеков нет. Склеры сероватые без кровоизлияний.
Кости свода и основания черепа целы. Твердая мозговая оболочка не напряжена, розоватая, блестящая. Артерии головного мозга без бляшек. Извилины больших полушарий рельефные, борозды четкие, ткань головного мозга достаточно упругая, на разрезе влажная, умеренно полнокровная, с обычным распределением серого и белого вещества и четкой границей между ними. Желудочки головного мозга не расширены, внутренняя поверхность их гладкая, блестящая. Сосудистые сплетения мягкие, умеренно полнокровные.
Купол диафрагмы справа на уровне 4 ребра, слева - на уровне 5 межреберья. В полости брюшины жидкости и сращений нет, брюшина тонкая блестящая. В плевральных полостях жидкость и ограниченные рыхлые сращения (больше в области нижней доли), плевра тусклая, покрыта несмываемыми фибринозными наложениями серого цвета. В полости перикарда около 50 мл прозрачной бесцветной жидкости, внутренняя поверхность перикарда гладкая, блестящая.
Сердце большое, массой 650 г и размерами 12х 11 х 10 см, толщина стенки левого желудочка 1,7 см, правого - 0,7 см. Эпикард с умеренным количеством жировой ткани. Артерии сердца эластичные, внутренняя поверхность с отдельными мелкими пятнами-бляшками у устьев. Мышца сердца эластичная, волокнистая, на разрезе коричневато-синюшная, без четко выявляемых очажков, умеренно полнокровная. Пристеночный эндокард и клапаны сердца тонкие, блестящие, хордальные нити тонкие, длинные. Полости желудочков расширены, содержат жидкую кровь и небольшое количество темно-красных свертков крови. Аорта эластичная, внутренняя поверхность ее гладкая, в брюшном отделе с мелкими, плоскими желтоватыми бляшками. В просвете полых вен и легочной артерии жидкая кровь.
На коже шеи по срединной линии на 2 см выше яремной вырезки поперечно ориентированная рана размерами 2 х 1 см с трахеостомической трубкой. Слизистая оболочка надгортанника и гортани истончена. В верхней трети трахеи дефект с выступающими хрящами (трахеостомическое отверстие). Слизистая оболочка ниже дефекта красновато-синюшная с тонкими пленчатыми наложениями. В просвете трахеи скудное количество мутной слизи. Нижние доли обоих легких несколько спавшиеся, в самых нижних отделах над диафрагмой в обоих легких крупные, до 6-7 см в диаметре полости с серым гноевидным содержимым. Стенки полостей расположены частично субплеврально, толщина их достигает 2-2,5 мм, внутренняя поверхность гладкая. Остальные отделы нижних долей без четких уплотнений, ткань красноватая, пониженной воздушности, умеренно полнокровные. Остальные доли легких неравномерной плотности, серо-синюшные, на разрезе с сероватыми безвоздушными участками, не рвущимися под пальцами, без четкого отделяемого при надавливании. Просветы бронхов свободные. Нижние трахеобронхиальные лимфатические узлы до 1,5 см в диаметре, светлого красновато-серого оттенка.
Миндалины диаметром до 1,3 см, лакуны широкие. Слизистая оболочка глотки сероватая, блестящая. Слизистая оболочка пищевода серо-синюшная, блестящая, складки четкие, без наложений и выраженности вен. В просвете желудка крови нет, слизистая оболочка серо-синюшная, складчатая, без дефектов. В просвете тонкой кишки умеренное количество жидкого содержимого серого цвета, в толстой кишке очень большое количество коричневатых каловых масс, в дистальных отделах оформленных. Слизистая оболочка кишечника тонкая, блестящая, складчатая. Фатеров сосок не увеличен. Желчные пути свободно проходимы. Лимфатические пути ворот печени не определяются. Желчный пузырь не напряжен, стенка его слегка отечная, слизистая оболочка бархатистая, желтая. Масса печени 3600 г, правая доля выступает на 9 см, левая - на 4 см по срединно-ключичной линии. Капсула печени тонкая, поверхность гладкая, блестящая, коричневато-синюшная. Ткань печени мягко эластичная с острым краем разреза, упругая во всех отделах, однородная, со смешанным рисунком печеночных долек, коричневато-синюшная, умеренно полнокровная. Поджелудочная железа продолговатая, эластичная, на разрезе дольчатая, сероватая с синюшным оттенком, умеренно полнокровная. Селезенка массой 500 г, капсула тонкая, ткань мягко эластичная, вишнево-красная, полнокровная, с нечетким соскобом.
Почки большие, окружены толстым слоем жировой ткани. Капсула снимается легко. Поверхность почек гладкая, синюшно-коричневатая, ткань мягко эластичная, на разрезе корковый слой слегка выбухает. Ткань на разрезе умеренно полнокровная, с обычным рисунком и четкой границей между слоями. Слизистая оболочка лоханок, мочеточников и мочевого пузыря тонкая, блестящая, светло-желтая. Мочевой пузырь небольшой. Предстательная железа не увеличена, обычного строения.
Надпочечники треугольной формы, плоские с различимыми слоями. Щитовидная железа не увеличена, эластичная, светло-буроватая.
При микроскопическом исследовании легких отмечена пневмония с фокусами дис- и ателектазов, очаговыми кровоизлияниями, образованием симпластов, перибронхиальных и периваскулярных лимфоидных инфильтратов, полями отека, фокусами абсцедирования с формирующимися фиброзными стенками и фибринозно-гнойным плевритом с геморрагическим компонентом и участками фиброза (Рисунок 24). Также отмечено образование преимущественно макрофагального экссудата с вакуолизацией и некоторым просветлением цитоплазмы составляющих экссудаты макрофагов (Рисунок 25), что видно и при иммуногистохимическом окрашивании антителами против CD68 (Рисунок 27). При окраске микропрепаратов реактивом Шиффа выявлены многочисленные Шифф-положительные включения, расположенные в цитоплазме макрофагов (более мелкие) и внеклеточно (более крупные) (Рисунок 26). Аналогичные включения окрашивались азуром при окраске по Романовскому. При иммуногистохимическом окрашивании парафиновых срезов легкого получена положительная реакция с антителами против Chlamydia trachomatis (Рисунок 28) при слабоположительной реакции с антителами против вируса гриппа H1N1 и отрицательной реакции с антителами против Mycoplasma pneumoniae, цитомегаловируса, вируса простого герпеса и респираторно-синцитиального вируса. Основная масса клеток в просвете альвеол по результатам иммуногистохимического исследования оказались CD68+ альвеолярными макрофагами (Рисунок 27). Положительная реакция с антителами против Chlamydia trachomatis была также получена при иммунофлуоресцентной микроскопии по прямому методу Кунса (Рисунок 29).
При электронно-микроскопическом исследовании легких в клетках эпителия, в клетках иммунной системы (макрофагах и моноцитах) и в межклеточном пространстве были обнаружены многочисленные включения, содержащие зрелые и находящиеся в стадии созревания элементарные тельца хламидий (Рисунок 30).
Общая характеристика изменений легких и других органов при экспериментальном гриппе у белых беспородных мышей
Для моделирования гриппа на животных были использованы белые беспородные мыши, которых интраназально заражали вирусом гриппа H1N1 Калифорния и H1N1 WSN в соответствии с общепринятыми методиками.
В эксперименте были использованы следующие группы: 45 мышей заражали интраназально вирусом гриппа California или WSN в физиологическом растворе, 5 мышам интраназально вводили физиологический раствор, еще 5 мышей использовали в качестве отрицательного контроля.
На 3, 7 и 14 сутки после заражения 10 животных из каждой группы заражения выводили из эксперимента, из них 5 животных использовали для определения титра вируса в ткани легких и 5 животных — для гистологического исследования.
При макроскопическом исследовании легкие зараженных животных были несколько увеличены в объеме, отмечалась выраженная смешанная, преимущественно венозная гиперемия их поверхности. У контрольных животных подобных изменений выявлено не было. Значительных макроскопических изменений других органов у зараженных животных не отмечалось.
При микроскопическом исследовании дыхательных путей и легких можно было выявить признаки трахеита, бронхита и пневмонии.
При гистологическом исследовании в трахее и крупных бронхах можно было наблюдать слущивание респираторного эпителия с умеренно выраженной мононуклеарной инфильтрацией, часто с формированием нейтрофильных наложений на поверхности эпителия трахеи и бронхов (Рисунок 33).
У некоторых животных в менее крупных бронхах была массивная нейтрофильная инфильтрация, при этом гнойный экссудат заполнял просвет бронха практически полностью (Рисунки 34-36).
У всех мышей отмечалась выраженная неравномерная воздушность легочной ткани, в части клеток наблюдались дистрофические изменения, часто с альтеративными проявлениями, в ряде случаев было отмечено слущивание.
В ряде случаев это сопровождалось выраженной гранулоцитарной инфильтрацией, в просвете альвеол обнаруживались альвеолярные макрофаги с увеличенными светлыми ядрами, однако без существенного увеличения цитоплазмы (Рисунок 37). У многих мышей также наблюдались участки уплотненной легочной ткани с нейтрофилыю-макрофагальной инфильтрацией.
Антиген вируса гриппа в этой зоне определялся лишь в небольшом числе случаев. При окраске по Романовскому в этих участках определялись небольшие скопления мелких кокков.
Следует отметить, что на поздних сроках экспериментальной инфекции (на 14 сутки) в мелких бронхах можно было наблюдать выраженную гиперрегенерацию бронхоцитов, при которой происходило утолщение эпителиального слоя с формированием в некоторых случаях многорядного эпителия (Рис 38).
Однако в ряде наблюдений на этом сроке инфекции в респираторных отделах легких зараженных животных при иммуногистохимическом исследовании можно было выявить антиген вируса гриппа (Рис 39).
Антиген вируса гриппа был также обнаружен в мягкой мозговой оболочке (Рисунок 40).
В сердце была отмечена умеренно выраженная мононуклеарная инфильтрация интерстиция миокарда (Рисунок 41).
При гистологическом исследовании почек отмечались дистрофические изменения эпителия канальцев вплоть до цитолиза. В этих зонах закономерно определялся антиген вируса H1N1 Калифорния.
Данные о динамике репликации вирусов гриппа A/California/07/09 (H1N1) и A/WSN (H1N1) в ткани легких представлены в Таблице 2. Показаны средние значения и стандартное отклонение, полученные при обработке данных от 5 мышей из каждой группы на каждом из указанных сроков после заражения.
Как видно из показанных значений, репликация вирусов гриппа обоих типов была максимальной на 3 сутки после инфицирования с ее постепенным снижением на 7 и 14 сутки. Следует отметить, что на 14 сутки средние показатели репликации вируса гриппа А/Калифорния (H1N1) более чем в два раза превышают соответствующие показатели A/WSN (H1N1).
В Таблице 3 приведена площадь безвоздушных очагов в легких мышей, инфицированных интраназально вирусами гриппа H1N1 Калифорния и H1N1 WSN (разведенными в физиологическом растворе), контрольных животных, которым интраназально вводили физиологический раствор (аналогично процедуре инфицирования), и интактных контрольных животных, которым не проводили интраназального введения вирусов или физиологического раствора. Показаны средние значения и 95%-ные доверительные интервалы.
Как видно из Таблицы 3, площадь безвоздушных очагов, соответствующих при микроскопическом исследовании очагам преимущественно вирусной пневмонии со смешанно-клеточным экссудатом и увеличенным перибронхиальным лимфатическим фолликулам, была максимальной на 7 и 14 сутки после инфицирования, достоверно превышая соответствующие показатели контрольных животных. Эти очаги связаны не только с островоспалительной инфильтрацией, обусловленной репликацией вируса гриппа, но и пролиферативными изменениями со стороны различных клеток, в том числе лимфоидных.
