Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 12
1.1. Физико-химические закономерности процесса электровосстановления кислорода 12
1.1.1. Влияние природы материала электрода на прогрес ЭВ 02 13
1.1.2. Влияние природы растворителя на процесс ЭВ О2 17
1.1.3. Влияние рН раствора на процесс ЭВ О2 23
1.1.4. Влияние состава электролита на процесс ЭВ О2 25
1.1.5. Влияние поверхносто-активных веществ на процесс ЭВ Ог 26
1.2. Процесс восстановления кислорода в биологических мембранах 31
1.3. Классификация и механизмы действия биоантиоксидантов 37
1.4. Методы определения антиоксидантной активности 44
1.5. Методы определения антиоксидантной активности, основанные на восстановлении кислорода 56
2. Закономерности процесса электровосстановления кислорода в условиях нестационарной диффузии на электродах ограниченного объема 59
2.1. Закономерности процесса электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов в водных средах 59
2.2. Определение оптимальных условий для оценки антиоксидантной активности с использованием методов планирования эксперимента 68
3. Аппаратура и методика эксперимента 77
3.1. Приборы, ячейки, электроды, растворы и реактивы 77
3.2. Объекты исследования 83
3.3. Методика эксперимента 85
4. Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии индивидуальных антиоксидантов в водных средах 89
4.1. Влияние аскорбатов металлов на кинетику катодного восстановления кислорода в условиях квазиобратимого электродного процесса 89
4.2. Влияние консервантов на кинетику катодного восстановления кислорода в условиях квазиобратимого электродного процесса 99
5. Использование закономерностей процесса электровосстановление кислорода в аналитической практике 112
5.1. Исследование свойств препарата моноглюкозида токоферола -водорастворимой формы а-токоферола 112
5.2. Определение антиоксидантной активности лекарственного растительного сырья 118
5.3. Определение антиоксидантной активности косметических средств 124
5.4. Сравнительная характеристика гипероксигенированных инфузионных растворов 129
Обсуждение результатов 135
Выводы 144
- Процесс восстановления кислорода в биологических мембранах
- Определение оптимальных условий для оценки антиоксидантной активности с использованием методов планирования эксперимента
- Влияние консервантов на кинетику катодного восстановления кислорода в условиях квазиобратимого электродного процесса
- Определение антиоксидантной активности косметических средств
Введение к работе
Актуальность темы. Вопросы кислородного метаболизма в организме человека являются объектами постоянного внимания медиков, химиков и биохимиков. Особенно сейчас, когда стало очевидно, что избыточное содержание кислорода и его активных радикалов вызывают радикально-цепные процессы окисления в клетках организма, приводя к значительным нарушениям в их нормальном метаболизме. Нарушения в регуляции свободнорадикальных процессов являются одной из причин таких тяжелых патологий как атеросклероз, инфаркт миокарда, диабет, онкологические и другие заболевания.
Фармакологическая коррекция оксидативного стресса осуществляется с помощью биологически-активных веществ (БАВ), в частности, антиоксидаитов (АО). Они прерывают быстрорастущие процессы окисления, образуя малоактивные радикалы, легко выводящиеся из организма. Терапия с включением АО находит все большее применение при лечении ряда заболеваний. Вот почему сейчас в мире широкое распространение получили АО, производимые либо в виде пищевых добавок, косметических средств, либо в виде фармацевтической продукции. Поэтому на первый план выносится проблема количественной оценки суммарной антиоксидаитной активности (САОА) комплексных препаратов и их эффективных концентраций, изучение электрохимических свойств АО, исследование их влияния на жизненно важные процессы окисления, происходящие в организме.
Совершенствование способов обнаружения и исследования антиоксидантиых свойств препаратов стимулирует создание новых методов, применение которых должно помочь уточнению диагноза, лечению заболеваний и оценке эффективности антиоксидаитной терапии у конкретного больного. Основным препятствием на пути таких исследований является ограниченный круг применяемых методов, в большинстве своем
7 дорогостоящих, неэффективных и зачастую трудоемких. Кроме того,
результаты исследований часто несопоставимы, так как получены в разных
модельных системах, не отражающих окислительные процессы организма
человека и животного. Поэтому поиск других альтернативных методов
определения САОА лекарственных препаратов, пищевых продуктов и
растительных объектов представляет актуальную задачу.
Электрохимические методы анализа интенсивно развиваются в
настоящее время и отличаются принципиально новым подходом к
определению БАВ. Оперативность, высокая чувствительность и
использование в качестве модельной реакции процесс
электровосстановления кислорода (ЭВ 02), идущий по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках организма человека и животного, являются характеристиками, которые позволяют вольтамперометрическому анализу успешно конкурировать с традиционными методами определения САОА, предлагая им, в ряде случаев, разумную альтернативу.
Цель работы: рассмотреть закономерности процесса ЭВ О2 в присутствии АО в условиях нестационарной диффузии на электродах ограниченного объема с точки зрения их использования в решении ряда аналитических проблем, в частности, для определения САОА различных объектов.
В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:
Разработать новый, более эффективный способ определения САОА объектов. Установить количественные критерии оценки САОА.
Исследовать влияние индивидуальных АО на кинетические закономерности процесса ЭВ 02 в условиях нестационарной диффузии на электродах ограниченного объема.
Провести оценку наиболее эффективной концентрации и времени активного действия индивидуальных АО по отношению к процессу ЭВ Ог с использованием методов планирования экспериментов.
4. Исследовать САОА ряда индивидуальных веществ, лекарственных
препаратов, объектов растительного происхождения для дальнейшего выяснения их роли в механизмах антиоксидантнои защиты организма и ослабления действия окислительного стресса.
Рассмотреть влияние ряда факторов: исходного типа сырья, способа выделения и концентрирования, рН раствора - на САОА ряда объектов, что позволило бы более грамотно подойти к комплексной антиоксидантнои терапии.
Исследовать процессы релаксации ряда оксигенированных инфузионных растворов по отношению к процессу ЭВ 02 с целью расширения возможностей неотложной помощи при острой гипоксии.
Научная новизна. Впервые рассмотрены теоретические
закономерности процесса ЭВ 02 в условиях нестационарной диффузии на стационарных электродах ограниченного объема в присутствии АО. Предложен способ определения константы скорости последующей химической реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами.
Дано теоретическое обоснование результатов влияния АО на электрохимическое восстановление кислорода и его кинетические закономерности. Сделано предположение, что процесс соответствует ЕС-механизму.
Впервые для количественной оценки введены концентрационный и кинетический критерии САОА объектов.
Проведена оценка эффективной концентрации АО и времени их активного действия, используя методы планирования эксперимента.
Впервые проведено определение САОА индивидуальных веществ, ряда лекарственных препаратов, объектов растительного происхождения и готовой косметической продукции методом катодной вольтамперометрии (КВА).
Предложен способ оценки процессов релаксации оксигенированных
инфузионньтх растворов для их более эффективного использования в лечении острой гипоксии.
Практическая значимость. Способ определения константы скорости последующей химической реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами.
Новый метод аналитического контроля САОА БАВ с помощью КВА, отличающийся высокой чувствительностью, простотой исполнения, экспрессностью и универсальностью.
Количественные критерии САОА: концентрационный, отражающий эффективную концентрацию АО, и кинетический, отражающий количество кислородных радикалов, прореагировавших с АО во времени.
Оценка САОА индивидуальных веществ, лекарственных препаратов, объектов растительного происхождения, косметической продукции. Определены оптимальные условия применения исследованных объектов.
На защиту выносятся:
Количественные критерии определения САОА различных объектов.
Результаты определения САОА ряда индивидуальных веществ, лекарственных препаратов, объектов растительного происхождения, косметической продукции.
Результаты исследований кислородной емкости ряда инфузионных растворов, применяемых для лечения гипоксических состояний.
Способ определения константы скорости последующей химической реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены в устных докладах на VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002); Региональной научно-практической конференции "Химия и технология лекарственных препаратов и полупродуктов" (Новокузнецк, 2002) и стендовых докладах на XII International Conference "EiiroFoodChem" (Brugge, 2003); 3th International Conference "Instrumental Methods of Analysis"
(Thessaloniki, 2003); 15th International Symposium "Pharmaceutical and Biomedical Analysis" (Florence, 2004); III Всероссийской научной конференции "Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий" (Томск, 2004); VII Всероссийской научной конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2004); Всероссийской научной конференции с международным участием "Электроаналитика 2005" (Екатеринбург, 2005); Международной научной конференции "Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий" (Томск, 2006).
По материалам диссертации опубликовано 8 статей и 9 тезисов докладов.
Диссертация выполнена при поддержке гранта Минобразования РФ № 12.58.2004 "Разработка методики и создание макета вольтамперометрического комплекса определения антиоксидантной активности объектов"; ведомственной научной программы "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект 5.21.2005 "Создание комплекса по определению суммарной антиоксидантной активности биологических объектов" и проект 5.31.2005 "Исследование связи антиоксидантиых, электрохимических и кваытово-химических свойств ряда лекарственных препаратов и ферментов, их теоретическое обоснование").
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 176 страницах, содержит 15 таблиц, 27 рисунков и библиографию из 207 наименований. Работа состоит из введения, пяти глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе приведен литературный обзор, характеризующий современное состояние теории и практики процесса ЭВ 02, его кинетических и физико-химических закономерностей. Рассмотрены общие вопросы
процесса восстановления кислорода в биологических мембранах. Описаны способы оценки определения АОА.
Во второй главе рассмотрены теоретические закономерности процесса ЭВ Ог в присутствии АО в условиях нестационарной диффузии на электродах ограниченного объема. Обоснованы количественные критерии оценки САОА объектов.
В третьей главе описаны условия эксперимента, способы приготовления растворов и электродов, представлены данные об используемом оборудовании и объектах исследования.
В четвертой главе рассмотрены особенности процесса ЭВ 02 в присутствии индивидуальных АО в водных средах в условиях нестационарной диффузии на электродах ограниченного объема. Представлены результаты опытной проверки теоретических положений для процесса ЭВ 02, осложненного присутствием АО в растворе. Представлены результаты определения АОА индивидуальных АО по введенным количественным критериям.
В пятой главе описано применение установленных закономерностей процесса ЭВ 02 в аналитической практике. Проведено определение САОА индивидуальных веществ, фармацевтических препаратов, экстрактов растительного сырья, косметической продукции. Определены оптимальные условия применения исследованных объектов. Рассмотрено влияние различных факторов (исходного типа сырья, способа выделения и концентрирования, рН раствора) на их САОА. Исследованы процессы релаксации оксигенированных инфузионных растворов для их более эффективного использования в лечении острой гипоксии.
Процесс восстановления кислорода в биологических мембранах
В настоящее время наблюдается повышенный интерес к изучению свободных радикалов в живых системах в связи с признанием их важной роли в развитии синдрома окислительного стресса и разнообразных патологических состояний, включая такие, как атеросклероз, сердечнососудистые и неврологические заболевания, гипертонию, диабет, рак, катаракту и другие [87]. В биологических системах можно выделить несколько типов свободных радикалов. Одни из них образуются в качестве нормальных продуктов обмена веществ, другие возникают при измененных условиях жизнедеятельности. В числе последних - свободные радикалы воды и органических молекул, образующиеся при действии на клетку ионизирующих и ультрафиолетового излучений, различных токсичных веществ, а также при нарушении клеточного метаболизма при различных заболеваниях. Первой теорией биологического окисления была перекисная теория, сформулированная в 1896-1897 годах. Ее основная идея заключалась в том, что при активации молекулярным кислородом разрываются не две, а только одна химическая связь, в результате чего образуется пероксидыая группа -0-0-, которая присоединяется как целое к окисляющемуся соединению, образуя пероксид последнего. Согласно современным представлениям, этот процесс может начаться, если в системе появляются свободные радикалы. Первичными молекулярными продуктами окисления являются перекисные соединения, обычно гидропероксиды, но в некоторых случаях полипероксиды. Детали механизма меняются в зависимости от структуры окисляемого субстрата. В организме животных и человека это обычно полиненасыщенные остатки жирных кислот фосфолипидов мембран. Продукты более глубокого окисления - карбонильные, карбоксильные и другие - образуются в основном в результате последующих превращений перекисных соединений [88].Обобщив литературные данные [88-93], можно Процессы первичной генерации радикалов весьма разнообразны. Что касается биологических систем, то радикалы образуются при взаимодействии кислорода с молекулами липидов или в результате реакций с участием металлов переменной валентности (железо, марганец, медь), присутствующих в следовых количествах.
Наиболее вероятным окислителем липидньтх компонентов является гидроксильный радикал (1.2.1), ОН . Он образуется из продуктов одно- и двухэлектронного восстановления кислорода в реакции (1.2.2), которая катализируется следовыми количествами ионов металлов переменной валентности, главным образом, железа. В первую очередь, это относится к железу, не включенному в гемоглобин, ферменты и другие биомакромолекулы. Ионы железа (II) способны инициировать перекисное окисление липидов, вызывать разветвление цепи или, взаимодействуя со свободными радикалами, приводить к обрыву цепи. Реакция Фентона (1.2.3) является основной реакцией образования гидроксильных радикалов в биологических системах. В настоящее время известно, что супероксид анион-радикал кислорода, 02 , тоже играет немаловажную роль в повреждении биологических мембран. Одним из основных источников его накопления в живых системах является окисление железа молекулярным кислородом (1.2.4). В кислой среде происходит протонизация 02 с образованием гидроперекисного радикала, НО .,, (1.2.5) и (1.2.6). Радикал Н02 обладает высокой реакционной способностью, хотя она ниже, чем у радикала ОН , но все же выше, чем у пероксида водорода. Поэтому радикал Н02" способен к окислению ряда органических молекул по одному из двух механизмов (1.2.7) или (1.2.8). Таким образом, если в системе происходит окисление железа молекулярным кислородом, то образуются в какой-то пропорции все продукты последовательного восстановления кислорода, и какой из продуктов этого окисления может наиболее эффективно осуществлять инициирование перекисного окисления липидов - пока не известно. Образующийся в результате реакции инициирования свободный радикал R обладает обычно высокой реакционной способностью. Он активно реагирует с кислородом с образованием перекисного радикала R02 (1.2.9). Причем присоединение кислорода происходит практически необратимо, т.к. константа скорости этого процесса велика, а энергия активации практически равна нулю. Следовательно, при содержании кислорода в системе выше 10"6М все радикалы R превратятся в R02 . Атом углерода в молекуле липида, остающийся с неспаренньтм электроном, стремится к стабилизации. Поэтому радикал ЯОг может вступить во взаимодействие с новой молекулой липида, при этом образуется гидропероксид ROOH и вновь появляется радикал R" (1.2.10). Чередование реакций (1.2.9) и (1.2.10) приводит к тому, что в процесс вовлекаются все новые и новые молекулы липида и кислорода. Это приводит к цепному окислению по схеме: +02 +RH +02 H-R.H R RO: - R - RO; - R (1.2.22) 1 -ROOH l -ROOH Эта стадия процесса иногда называется стадией "пролонгирования", или, иначе говоря, продолжение цепного окисления. Скорость всего процесса определяется при этом более медленной реакцией пероксидного радикала с молекулой липида.
Следует отметить, что константа скорости этой реакции зависит от химической природы жирной ненасыщенной кислоты: она выше у жирных кислот с большим числом двойных связей, чем и объясняется более высокая скорость их окисления. Классический вариант окисления, приводящий к образованию гидропероксидов в качестве первичного молекулярного продукта, не является единственным возможным. Так, при окислении непредельных соединений вместо реакций радикального замещения (1.2.10) может происходить присоединение R02 по двойной связи: +RO, OOR +02 00- OOR С = С - С -С - С-С (1.2.23) Цепь в этом случае ведет полипероксидный радикал, а первичным продуктом окисления оказывается полипероксид. Такой процесс иногда называют окислительной полимеризацией. В тех случаях, когда в молекуле ненасыщенного соединения есть достаточно слабая связь С-Н, рассматриваемый путь продолжения цепей конкурирует с реакцией типа (1.2.10), при этом в системе образуется смесь гидропероксидов и полипероксидов. Они, как неустойчивые соединения вступают в различные химические реакции с образованием свободных радикалов, которые начинают новые цепи, разветвляя цепную реакцию (1.2.11)-(1.2.13), Появление новых свободных радикалов происходит в биологических тканях очень часто в присутствии ионов железа (1.2.14). Более того, в условиях клетки скорость реакции разветвления цепей в значительной степени зависит от их концентрации и локализации в биоструктурах. Если бы свободные радикалы реагировали всегда только с новыми молекулами липидов, то рано или поздно все они превратились бы в перекиси. Однако этого не происходит потому, что радикалы могут реагировать с другими радикалами (1.2.15)-(1.2.17), с ионами металлов переменной валентности (1.2.18) и (1.2.13) или с молекулами так называемых АО (1.2.20) и (1.2.21). В первых двух случаях образуются молекулярные продукты, а в третьем - малоактивные радикалы, не способные вступать в реакцию с новой молекулой липида. Но в любом случае происходит процесс обрыва цепи. Между моментом появления свободного радикала и моментом его исчезновения происходит несколько последовательных циклов реакций с участием радикалов R и ROi , в результате чего образуются молекулы гидропероксида. Это число характеризует длину цепи. Очевидно, что длина цепи ограничена реакциями обрыва и сокращения в присутствии АО, чем обычно и объясняют их действие в качестве ингибиторов свободи орадикальных процессов. Таким образом, окисление липидов молекулярным кислородом представляет собой цепную свободнорадикальную реакцию, скорость которой зависит от концентрации перекисных радикалов, являющихся источниками новых цепей, а весь этот процесс называется перекисным окислением липидов (ПОЛ) и биологических мембран.
Определение оптимальных условий для оценки антиоксидантной активности с использованием методов планирования эксперимента
Эксперимент, как определенный вид человеческой деятельности, используется в различных областях науки и промышленности, Правильная организация эксперимента, применение методов математической статистики и приемов планирования позволяют существенно сократить время эксперимента, делают поведение экспериментатора целенаправленным и организованным. Экспериментальные исследования многообразны, но, в большинстве своем, они сводятся к трем математическим задачам: 1) статистическая обработка результатов химического эксперимента, отбор значимых факторов (дисперсионный, регрессионный анализы). 2) создание математической модели процесса и определение ее параметров (факторный эксперимент). 3) оптимизация процесса, т.е. определение условий, обеспечивающих оптимальный режим какого-либо процесса или оптимальные свойства какого-либо продукта (методы оптимизации: метод крутого восхождения, симплексное планирование и т.д.). При использовании методов планирования и организации эксперимента решение этих задач обеспечивается при минимуме опытов и с наибольшей производительностью. Из полученных выражений (2.1.30) и (2.1.31), позволяющих экспериментально обосновать механизм процесса ЭВ Ог в присутствии АО, очевидно, что АОА зависит как от концентрации АО, так и от времени его взаимодействия с активными кислородными радикалами. Поэтому, для оценки наиболее активной концентрации и времени активного действия АО в данной работе использовали методы планирования эксперимента; полный факторный эксперимент и метод крутого восхождения. Оценку строгой зависимости между откликом и влияющими факторами осуществляют с помощью регрессионного анализа. При этом исследуемая система должна удовлетворять следующим четырем допущениям: 1) случайная погрешность определений обусловлена измерением функции отклика Y, а не факторами (аргументов: Х\, Х2..Хк), т.е. Sy» х; 2) все опыты равноточные. Они дают, примерно, одинаковую воспроизводимость измерения У. Дисперсии в каждой серии опытов должны быть однородны; 3) погрешность измерения Y имеет случайный характер и не имеет систематической составляющей; 4) погрешность измерения Y не зависит от опыта и имеет нормальное распределение. В данном случае для получения математической модели процесса ЭВ 02 в присутствии АО, оценки ее адекватности и оценки значимости коэффициентов полученного уравнения регрессии использовался полный факторный эксперимент. Факторы варьировались по двум уровням (концентрация и время), число опытов необходимое для реализации всех возможных экспериментов равно N=2n=22=4. В качестве функции отклика (Y) использовали относительное изменение тока ЭВ 02, что по разработанной методике соответствует антиоксидантной активности образца.
В приложении показаны все расчеты для индивидуального вещества - аскорбиновой кислоты. Для всех исследуемых веществ получено, что модель адекватно описывает процесс, эффект взаимодействия факторов не значим, все коэффициенты линейной модели значимы и имеют знак плюс, что означает увеличение критериев оптимизации с увеличением значений обоих факторов. Следует отметить, что наибольшее влияние оказывает второй фактор - время взаимодействия АО с активными кислородными радикалами. Ниже представлены математические модели процесса для исследованных веществ с учетом значимости коэффициентов: Конечной целью планирования экспериментов является нахождение точки оптимума на поверхности отклика. Известно, что когда модель адекватна и все коэффициенты линейной модели значимы, дальнейшие решения зависят от того, насколько далеко мы находимся от оптимума. Если до желаемого оптимума еще далеко или вообще о его положении ничего не известно, то может быть принято только одно решение - осуществить движение по градиенту. Существует целая группа методов, позволяющих ускорить нахождение экстремума. Одним из них является метод крутого восхождения (метод Бокса - Уилсона). Используя данный подход, получены двухфакториые поверхности отклика для исследуемых антиоксидантов, изображенные на рис. 2.2.1. Таким образом, очевидно, что АОА зависит как от концентрации АО, так и от времени его взаимодействия с активными кислородными радикалами. Следует заметить, что наибольшее влияние оказывает второй фактор. Во всех случаях наблюдается тип поверхности отклика -«стационарное возвышение» - плавное возрастание функции отклика при изменении факторов. При таком типе максимум не наблюдается.
На основе вышесказанного, согласно разработанной методике определения АОА вольтамперометрическим методом, из практических соображении предложено два эмпирических критерия АОА: 1. Концентрационный критерий - отражает степень изменения концентрации кислорода и его активных радикалов в зависимости от концентрации АО в растворе. Размерность мл/г. По результатам определений строится график зависимости (—) - (Сдо) и рассчитывается Ккат : где //-ток ЭВ О2 в присутствии АО в растворе, мкА, /„-ток ЭВ О? в отсутствие АО в растворе, мкА; Сдо- концентрация АО, г/мл. Недостаток данного критерия в том, что эффективная концентрация каждого АО - разная, различающаяся на несколько порядков. Поэтому данный критерий можно использовать в одной области концентраций АО (одного порядка). Кроме того, для сложных объектов (соки, сиропы, любые жидкие образцы) рассчитать концентрацию АО сложно. В таких случаях необходимо сначала переводить эти образцы в сухой остаток, его взвешивать и только тогда определять АОА в пересчете на сухой остаток вещества. 2. Кинетический критерий - отражает количество активных кислородных радикалов, прореагировавших с АО (или суммарным содержанием АО) во времени. Размерность: мкмоль/л-мин. По результатам определений строится график зависимости (1-—) - (0 и рассчитывается К,.ШШ1: ,.,=(1-74-Г" (2-2.12) где /гток ЭВ О2 в присутствие АО в растворе, мкА, /0-ток ЭВ Ог в отсутствие АО в растворе, мкА; С - исходная концентрация кислорода в растворе, мкмоль/л, /-время протекания реакции взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными радикалами, мин. Таким образом, для получения математической модели процесса ЭВ Oi в присутствии АО, оценки ее адекватности и оценки значимости коэффициентов полученного уравнения регрессии использовался полный факторный эксперимент. Варьируемыми факторами служили концентрация АО и время его взаимодействия с активными кислородными радикалами. В качестве функции отклика использовали относительное изменение тока ЭВ02. Для всех исследуемых веществ получено, что модель адекватно описывает процесс, эффект взаимодействия факторов не значим, все коэффициенты линейной модели значимы и имеют знак плюс, что означает увеличение критериев оптимизации с увеличением значений обоих факторов. Следует отметить, что наибольшее влияние оказывает второй фактор - время взаимодействия АО с активными кислородными формами. Представлены уравнения математической модели для исследованных АО с учетом значимости коэффициентов. Кроме того, для нахождения точки оптимума реализован метод крутого восхождения, и получены двухфакторные поверхности отклика. Следует заметить, что АОА зависит как от концентрации АО, так и от времени его взаимодействия с активными кислородными радикалами. Тип поверхности отклика - «стационарное возвышение» - плавное возрастание функции отклика при изменении факторов. При таком типе поверхности отклика максимум не наблюдается. Таким образом, в соответствии с разработанной методикой определения АОА вольтамперометрическим методом предложено два критерия АОА: концентрационный критерий, отражающий степень изменения концентрации кислорода и его активных радикалов в зависимости от концентрации АО в растворе; и кинетический критерий, отражающий количество активных кислородных радикалов, прореагировавших с АО (или суммарным содержанием АО) во времени.
Влияние консервантов на кинетику катодного восстановления кислорода в условиях квазиобратимого электродного процесса
Среди многих добавок консерванты получили широкое распространение. Они содержатся в пищевых продуктах, напитках, фармацевтических препаратах, косметических средствах [173, 174]. Многие из консервантов имеют природное происхождение, встречаются во фруктах, ягодах, чае [175]. Одни консерванты ведут себя как бактерицидные добавки, другие ведут себя как АО, а некоторые могут выполнять обе функции. Многие из них действуют на дрожжи, плесень и бактерии, в то время как другие специфично поражают определенные классы микробов. Известно, что сорбаты и бензоаты - специфичные ингибиторы бактерий, а производные 4-шдроксибензойной кислоты обладают как антимикробной, так и АОА [176]. В этой связи изучение активности наиболее известных консервантов, широко используемых в пищевой и косметической промышленности, представляется актуальным. Бензойная кислота и бензоат натрия - одни из самых распространенных химических консервантов, обладающие антибактериальными и противогрибковыми свойствами, которые используются в концентрациях 0.05 - 0Л % при рН 4 и ниже. Сорбиновая кислота обладает сильными антимикробными свойствами, однако очень часто в качестве консервантов используются ее соли (калий, натрий или кальций сорбат) из-за большей их растворимости [177]. 4-гидроксибензойная кислота и ее производные, используемые отдельно или в комбинации, являются идеальными консервантами. Эти вещества имеют широкий спектр антимикробной активности, безопасны для использования и устойчивы в широком диапазоне рН. Однако их растворимость уменьшается с увеличением длины алифатической цепи сложноэфирной группы. Одновременное использование метилового эфира и пропилового эфира 4-гидроксибензоЙной кислоты имеет синергичный эффект и увеличивает их антимикробную активность даже при более низкой концентрации [176,178]. В данном параграфе рассмотрено влияние сорбиновой кислоты, бензойной кислоты, 4-гидроксибензойной кислоты и ее производных (рис. 4.2.1), на электрохимическое поведение кислорода и его кинетические параметры в водной среде в условиях квазиобратимого электродного процесса катодного восстановления кислорода на электродах ограниченного объема. Влияние исследуемых веществ на электрохимическое поведение кислорода рассмотрено в фоновом электролите - фталатном буфере (0.05М КСКН5О4) с рН4.01 для сорбиновой и бензойной кислот, и в фосфатном буфере (0.025М КН2Р04 и 0.025М Na2HP04), подкисленным до рН 5.80 для остальных консервантов. Проведенные исследования показали ингибирование предельного тока катодного восстановления кислорода при увеличении концентрации исследуемых веществ (рис. 4.2.2) и времени протекания процесса взаимодействия АО с кислородными радикалами (рис. 4.2.3). Ингибирование катодных волн кислорода свидетельствует о взаимодействии исследуемых веществ с продуктами восстановления кислорода.
Наблюдается сдвиг потенциала предельного тока ЭВ 02 в положительную область, что указывает на облегчение процесса ЭВ 02 при добавлении консервантов в раствор фонового электролита. Такой характер изменения катодных волн позволяет предположить, что в данном случае вероятный ЕС механизм ингибирования электродного процесса ЭВ 02 в присутствии АО включает последующую химическую реакцию взаимодействия АО с активными кислородными радикалами. Таким образом, можно предположить, что исследуемые вещества, находясь в растворе, влияют на процесс ЭВ 02 и, прежде всего, на собственно электрохимическую реакцию катодного восстановления кислорода, проявляя антиоксидантные свойства. При оценке кинетических параметров процесса ЭВ 02, осложненного присутствием АО, в условиях квазиобратимого электродного процесса воспользуемся полученным ранее уравнением:. В работе были построены графики зависимостей — - (VO на РПЭ в фталатном буфере с рН4.01 - для сорбиновой и бензойной кислот и в фосфатном буфере с рН 5.80 - для остальных консервантов (рис. 4.2.4). Данные зависимости имели прямолинейный характер. По уравнению (4.2.1) определены константы скорости последующей химической реакции АО с активными кислородными радикалами (к; ), представленные в табл.4.2.1. Наибольшее значение константы скорости последующей химической реакции АО с активными кислородными радикалами наблюдается для сорбиновой кислоты и бутилового эфира 4-гидроксибензойной кислоты.
Следует отметить, что исследованные вещества, находясь в растворе фонового электролита, оказывают значительное влияние на собственно электрохимическую стадию процесса ЭВ 02, причем значение к} увеличивается с увеличением длины алифатической цепи сложноэфирнои группы. Поскольку АОА зависит как от концентрации АО, так и от времени его взаимодействия с активными кислородными формами, согласно разработанному способу определения АОА вольтамперометричесїсим методом количественно антиоксидантная способность исследуемых консервантов определялась по двум критериям: концентрационному и кинетическому. В связи с этим, в работе рассмотрены зависимости относительного изменения предельного тока ЭВ 02 от концентрации их в объеме раствора (-)-(Сдо) (рис. 4.2.5) и от времени взаимодействия АО с активными кислородными радикалами (1-—) - (/) (рис. 4.2.6). Степень уменьшения тока ЭВ 02 является показателем АОА исследуемых веществ, концентрационный критерий, Ктт, рассчитывается по выражению (2.2.11), а кинетический критерий, Ккшет - по выражению (2.2Л 2). В табл. 4.2.2 приведены коэффициенты АОА исследуемых веществ. Во всех рассмотренных случаях наблюдается проявление хорошей АОА. Наблюдается корреляция между концентрационным и кинетическим критериями. Так же хорошо согласуются результаты определения АОА со значениями констант скорости последующей химической реакции АО с активными кислородными радикалами. Наибольшая АОА наблюдается у сорбиновой кислоты и бутилового эфира 4-гидроксибензойной кислоты. Следует отметить, что как значение /с/ так и коэффициенты АОА увеличиваются с увеличением длины алифатической цепи сложноэфирной группы, что хорошо согласуется с результатами работы [179], в которой исследовалась взаимосвязь эстрогенных свойств консервантов с их структурными особенностями. Эти исследования продемонстрировали, что бутиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты показал наибольшую АОА. Активность других соединений уменьшалась в ряду пропиловый- этиловый- метиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты. Кроме того, в работе исследовалась липофильность консервантов. Известно, что липофильность обычно выражается коэффициентом распределения Р, полученного из исследования распределения соединения между водой и несмешиваю щимся неполярным соединением[180]. В данных работах показана важность физико-химических и других структурных свойств в биологической активности, эмпирическое уравнение, которое связывает биологическую активность для членов одного ряда с параметрами заместителя, отражающие липофильиые, электронные и пространственные эффекты. Значения коэффициентов распределения Р, полученные из системы п-октанол - вода, являются подходящими для характеристики взаимодействия между химическими веществами и биологической системой. Однако п-октанол - изотропная жидкость, в отличие от сильной анизотропной природы биомембраны. Поэтому было предложено множество модификаций данного критерия. В частности, был введен липофильный параметр К, используемый вместо коэффициента распределения Р. Метод ВЭЖХ был выбран для определения липофильного параметра К, который используется для оценки антимикробной активности консервантов [181-183]. Поэтому в данной работе исследовали антимикробную активность консервантов, а именно определяли липофильный параметр К, который рассчитывается из данных ВЭЖХ как пропускной коэффициент согласно уравнению:
Определение антиоксидантной активности косметических средств
В живых клетках существует совершенная система антиоксидантной защиты, регулирующая процессы образования свободных радикалов. Однако различные внешние воздействия на кожный покров индуцируют свободиорадикальное окисление и нарушают работу ферментных АО кожи. В косметике, основным предназначением которой является защита кожного покрова, широко используются природные и синтетические антиоксидантные системы - от индивидуальных веществ, до сложных природных КОМПОЗИЦИЙ [200]. Главная роль АО в составе косметических средств - ингибирование процессов перекисного окисления липидов кожи, усиливающихся при развитии заболеваний кожи различной этиологии, воздействии УФ-лучей и других неблагоприятных факторов окружающей среды. Другой функцией антиоксид антных добавок является уменьшение образования пероксидов в самой косметике, которые образуются при длительном хранении и являются распространенной причиной дерматита и различных воспалительных процессов. Однако для более эффективной работы косметических средств необходимо соблюдать определенный баланс используемых веществ. Зачастую новые компоненты вводятся в продукцию в дозах, превышающих необходимый уровень, что не только не помогает, но ухудшает качество продукции. Кроме того, многие композиции просто несовместимы друг с другом, что может нанести вред организму. Контролируя АОА как отдельных ингредиентов, так и готовой продукции, можно выбрать наиболее эффективные композиции для повышения качества косметических средств, подобрать эффективный и безопасный стабилизатор для них. В связи с этим в данном параграфе исследовалась САОА готовой косметической продукции, а также водно-спиртовых экстрактов растительных объектов, входящих в их состав. В качестве объектов исследования использовалась косметическая продукция ЗАО «Компания Кора» г. Москва: гель, крем и тоник (пункт 3.2). В качестве БАД использовались экстракты лекарственных растений -люцерны, солодки гладкой, клевера лугового и хмеля дикорастущего. Выбор данных растений обусловлен тем, что они обладают адаптогенньш, противовоспалительным, успокаивающим, противоаллергическим действием [195,201]. Для оценки влияния исследуемых образцов рассмотрены зависимости предельного тока ЭВ 02 от концентрации их в объеме раствора(рис. 5.3.1). Уменьшение тока ЭВ ( свидетельствует о том, что входящие в состав косметической продукции растительные экстракты, представляющие собой сложную многокомпонентную смесь, содержат значительное количество БАВ, проявляющих САОА. Большая разница в САОА продукции без экстрактов и с экстрактами растений говорит об эффективной работе добавляемых экстрактов. Разбавление тоника показало небольшое ухудшение результатов, т.е. наиболее эффективные сочетания компонентов наблюдаются в исходном препарате. Гель и крем с экстрактами оказались более эффективными в разбавленном в два раза состоянии. Это подтверждают исследования экстрактов клевера и хмеля. Уменьшение их концентрации в два раза в продукции, очевидно, приведет к наилучшим результатам.
Крем и гель без экстрактов также показали небольшую САОА. По-видимому, это связано с антиоксидантной активностью основных компонентов продукции. САОА геля почти в два раза меньше, чем для крема. Скорее всего, это объясняется структурой геля, так как без экстрактов САОА основы геля во много раз меньше таковой в креме. Отмечено, что введение экстрактов в гель более чем в 10 раз повышает САОА основы, тогда как для крема - в 8-9 раз. Это может быть связано с мобильностью геля. Хорошая растворимость в водных и спиртовых средах компонентов геля способствует их лучшему взаимодействию друг с другом. При соответствующем подборе компонентов в связи с их лучшей растворимостью в геле, возможно значительно повысить САОА, если это необходимо. Однако в данном случае нужно постоянно контролировать САОА, чтобы избежать проаитиоксидантного эффекта. Таким образом, проведена оценка САОА водно-спиртовых экстрактов растительных объектов, входящих в состав косметических средств. Полученные результаты позволили выявить наиболее эффективные композиции для повышения качества косметических средств. Проведенная оценка САОА готовой косметической продукции без экстрактов и с экстрактами растений свидетельствует об эффективной работе добавляемых экстрактов. Все большее распространение в практическом здравоохранении получает внутривенная гемоксигенация при затруднении или невозможности адекватного внутрилегочного газообмена. Введение гипероксигенированных растворов в сосудистую систему больного показано при острой гипоксии, шоке, бронхоспазме, при ожогах трахеи и бронхов, отравлении угарным газом, проведении реанимационных мероприятий и т.д. [202-205]. Преимущество данного способа оксигенотерапии заключается в высокой скорости оксигенации крови за счет дополнительного растворения кислорода в плазме. Клинический эффект введения кислорода путем внутри сосудистой инфузии растворов объясняется активацией биологического окисления через оксиредуктивные системы и оптимизацией таким образом тканевого дыхания за счет кислорода, как связанного с гемоглобином, так и растворенного в плазме. Поэтому актуальным является оснащение реанимационных бригад скорой медицинской помощи набором гипероксигенированных растворов с целью расширения возможностей неотложной помощи больным. Перед инфузией оксигенированного раствора необходима декомпрессия с целью профилактики газовой эмболии. Ранее была изучена кислородная емкость нескольких инфузионных растворов, применяемых для лечения гипоксических состояний у больных бронхиальной астмой [205, 206]. В настоящее время значительно расширился перечень фармакологических препаратов, применяемых для борьбы с шоком. Поэтому целью исследования данного параграфа явилось изучение кислородной емкости новых инфузионных растворов - реамберина и стабизола - в сравнении с применяемыми в настоящее время полиглюкином и физиологическим раствором. Вольтамперограммы катодного восстановления кислорода снимали для каждого раствора до и после оксигенации в течение 2-4 часов, также Во всех растворах после гиперболической оксигенации, как и следовало ожидать, наблюдается значительное повышение концентрации кислорода. В течение первых пяти минут после оксигенации наблюдается резкое падение парциального давления кислорода и его концентрации за счет декомпрессии. Поэтому в этот период проводить введение оксигениро ванных растворов больным нельзя из-за опасности возникновения газовой эмболии. Затем происходит постепенное уменьшение содержания несвязанного кислорода (рис. 5.4.2). Наибольшей кислородной емкостью обладает физиологический раствор. Однако быстрое выведение его из организма или депонирование в межклеточных пространствах при шоке не может гарантировать эффект антигипоксических мероприятий. Раствор полиглюкина длительно задерживается в сосудистом русле, но значительно уступает противошоковому эффекту растворов стабизола и реамберина. Гипероксигенированиый раствор реамберина обладает несколько большей емкостью по сравнению со стабизолом, но в процессе декомпрессии отдает весь растворенный кислород в течение одного часа, что имеет большое значение для купирования острой гипоксии при проведении реанимационных мероприятий. Раствор стабизола удерживает кислород в течение двух часов, процессы релаксации замедлены, что может быть использовано для лечения хронической гипоксии, т.к. оксигеиированныи раствор, удерживая кислород длительное время, медленно отдает его в кровь. Самую малую кислородную емкость и время релаксации имеют растворы Рингера-Локка и глюкозы.
