Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор по физико-химическим методам исследования и определения витаминов в различных объектах 11
1.1. Основные свойства водорастворимых витаминов Вь В2 и жирорастворимого витамина Е 11
1.2. Современное состояние методов аналитического контроля витаминов 19
1.3. Особенности электрохимических методов анализа витаминов 28
Глава 2. Аппаратура и методика проведения эксперимента 38
2.1. Приборы, электроды, ячейки 38
2.2. Приготовление растворов, посуды 41
2.3. Объекты исследования 42
2.4. Методика проведения эксперимента 43
Глава 3. Выбор рабочих условий вольтамперометрического определения ряда витаминов 45
3.1. Жирорастворимый витамин Е (а-токоферола ацетат) 45
3.2. Водорастворимый витамин Вг (рибофлавин) 54
3.3. Водорастворимый витамин Ві (тиамин) 60
Глава 4. Исследование электрохимического поведения витаминов и определение некоторых физико-химических констант ... 68
4.1. Изучение механизма электрохимического поведения витаминов с использованием вращающегося дискового электрода и метода циклической вольтамперометрии 68
4.2. Изучение адсорбции витамина В і методом двойного обратного интегрирования 80
Глава 5. Разработка методик количественного определения витаминов в многокомпонентных сухих витаминизированных смесях 85
5.1. Оценка предела обнаружения и нижней границы определяемых содержаний витаминов 85
5.2. Оценка мешающего влияния сопутствующих примесей на аналитические сигналы витаминов 87
5.3. Применение многофакторного планирования эксперимента для оптимизации условий подготовки пробы при вольтамперометрическом определении витамина Е 90
5.4. Методики количественного химического анализа витаминов Ві, В2 и Е в многокомпонентных сухих витаминизированных смесях: поливитаминных препаратах, витаминизированных подкормках для животных, биологически активных добавках 95
Обсуждение результатов 111
Выводы 124
Литература 127
Приложение
- Современное состояние методов аналитического контроля витаминов
- Приготовление растворов, посуды
- Водорастворимый витамин Вг (рибофлавин)
- Изучение адсорбции витамина В і методом двойного обратного интегрирования
Введение к работе
Актуальность. Увеличение степени загрязнения окружающей среды, жесткая технологическая обработка производимых продуктов питания привели к существенному снижению содержания в потребляемых продуктах биологически активных веществ, а особенно, витаминов. На восстановление качества продуктов питания направлен закон РФ № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 2 января 2000 г. Приняты правительственные общероссийские программы:
• «Обогащение пищевых продуктов микроэлементами»;
• «Концепция здорового питания России», утвержденная постановлением Правительства № 247, одним из разделов которой является «Разработка быстрых и надежных методов контроля».
В настоящее время на рынке появилось огромное количество витаминизированных продуктов питания для человека и кормов для животных, представляющих собой сухие многокомпонентные смеси. Ассортимент таких продуктов представлен достаточно широко. Это, прежде всего, биологически активные добавки к пище, премиксы, комбикорма для животных и птиц, поливитаминные препараты. Критерием качества таких продуктов может являться их анализ на содержание витаминов и, особенно, таких жизненно необходимых, как водорастворимые витамины Bj, Вг и жирорастворимый витамин Е, количество которых регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.
Для определения витаминов применяют различные методы. Широко используемые оптические методы анализа трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов, применение хроматографических методов осложнено использованием дорогостоящего оборудования.
Электрохимические методы анализа в настоящее время переживают бурное развитие в связи с их применением для определения органических веществ. Одним из наиболее универсальных электрохимических методов определения следовых количеств веществ является вольтамперометрический метод анализа. В 1999 году данный метод приобрел статус арбитражного (вышел ГОСТ Р 51301-99) для определения тяжелых металлов в пищевых продуктах. Методы вольтамперометрии также нашли применение при анализе органических веществ, в том числе и витамина С. Однако, методики вольтамперометричёского определения водорастворимых витаминов Вь Вг и жирорастворимого витамина Е практически отсутствуют.
Проведение исследований по оптимизации условий вольтамперометричёского определения витаминов в присутствии сложной органической матрицы, создание методик количественного химического анализа витаминизированных продуктов питания для человека и животных на содержание витаминов методом вольтамперометрии и метрологическая аттестация разработанных методик является актуальным и имеет большую практическую значимость.
Цель работы заключалась в исследовании электрохимического поведения водорастворимых витаминов Bi, В2 и жирорастворимого витамина Е, разработке вольтамперометрических методик их количественного химического анализа в многокомпонентных сухих витаминизированных смесях.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• установить рабочие условия вольтамперометричёского определения водорастворимых витаминов В і, В2 и жирорастворимого витамина Е;
• исследовать физико-химические закономерности электрохимического поведения витаминов и оценить некоторые параметры электродной реакции (рК, п, рп);
• изучить адсорбционную способность витамина В і с использованием метода двойного обратного интегрирования;
• провести оценку мешающего влияния сопутствующих примесей на аналитические сигналы определяемых компонентов и разработать алгоритм подготовки проб при определении витаминов;
• разработать и метрологически аттестовать методики количественного химического анализа многокомпонентных сухих витаминизированных смесей на содержание витаминов методом дифференциальной вольтамперометрии.
Научная новизна:
• Впервые предложен способ определения жирорастворимого витамина Е (а-токоферола ацетата), а также водорастворимых витаминов В і (тиамина) и Вг (рибофлавина) методом дифференциальной вольтамперометрии и установлены условия проведения электродного процесса.
• Проведена оценка некоторых физико-химических параметров электродного процесса с участием витаминов (рК, п, Рп).
• Рассчитаны параметры адсорбции витамина В і методом двойного обратного интегрирования.
• Предложены условия по устранению мешающего влияния сложной органической матрицы.
• Разработан алгоритм подготовки проб для вольтамперометрического определения витаминов.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
• на основании проведенных исследований предложены алгоритмы методик количественного химического анализа водорастворимых витаминов Вь Вг и жирорастворимого витамина Е для широкого круга объектов: поливитаминных препаратов, витаминизированных подкормок и кормов для животных, биологически активных добавок;
• методики: «Витаминизированные корма и подкормки. Определение массовых концентраций витамина В і методом вольтамперометрии», «Витаминизированные корма и подкормки. Определение массовых концентраций витамина В2 методом дифференциальной вольтамперометрии» и «Биологически активные добавки. Вольтамперометрический метод определения массовых концентраций витаминов С, Bj, В2, Е и кверцетина» метрологически аттестованы, внесены в Федеральный Реестр МВИ.
На защиту выносятся:
• рабочие условия вольтамперометрического определения витаминов Вь В2 и Е;
• основные параметры электродной реакции с участием витаминов и их адсорбционную способность;
• способ подготовки проб, включая процедуру выделения определяемых органических веществ из многокомпонентных смесей;
• алгоритм методик количественного химического анализа многокомпонентных сухих витаминизированных смесей на содержание витаминов методом дифференциальной вольтамперометрии.
Апробация работы.
Отдельные разделы диссертации докладывались на: симпозиуме «Теория электроаналитической химии и метод ИВ - 2000» (Томск, 2000); VI конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока- 2000» (Новосибирск, 2000); IV Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2000» (Краснодар, 2000); II Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2004» (Уфа, 2004); III Всероссийской научной конференции «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (г.Томск, 2004); 8th Korea-Russia International Symposium of Science and Technology (Tomsk, 2004); VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2004» (Новосибирск, 2004), а также на объединенных научных семинарах кафедры физической и аналитической химии и проблемной лаборатории микропримесей Томского политехнического университета.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, включая 41 рисунок, 22 таблицы, состоит из введения, пяти глав, выводов, приложения и списка литературы из 251 библиографических названий работ отечественных и зарубежных авторов.
Во введении обоснована актуальность проблемы, определены цели и задачи исследования. Первая глава представляет собой обзор литературы по физико-химическим и особенностям электрохимических методов анализа водо-и жирорастворимых витаминов. На основании литературного обзора формируются задачи исследования. Описание используемой аппаратуры, типов электродов, объектов исследования и методики проведения эксперимента приведены во второй главе. Третья глава посвящена выбору условий вольтамперометрического определения витаминов. В четвертой главе исследованы физико-химические закономерности электрохимического поведения витаминов и проведена оценка некоторых параметров электродной реакции. Оценке мешающего влияния сопутствующих примесей на аналитические сигналы определяемых компонентов и разработке алгоритма подготовки проб при определении витаминов посвящена пятая глава. Анализ полученных экспериментальных данных приведен в обсуждении результатов. В заключении сделаны выводы. В приложении представлены свидетельства о метрологической аттестации разработанных методик и акты о внедрении результатов работы.
Современное состояние методов аналитического контроля витаминов
Обзор литературы по аналитическим возможностям физико-химических методов определения витаминов проведен по реферативным журналам «Химия» за 1980-2004 гг, журналам «Фармация», «Лабораторное дело», «Вопросы питания», «Химико-фармацевтический журнал» и т.д., зарубежным периодическим изданиям «Analyst», «Analytical Chemistry» и др, данным Интернет и некоторым другим источникам в основном за последние 25 лет. Анализ количества публикаций по методам определения витаминов представлен на рис. 1.1. Из рисунка видно, что распределение числа опубликованных работ по годам весьма неравномерно. В работах 80-х годов витамины анализируют в основном оптическими методами. Развитие хроматографических методов анализа обусловило появление огромного числа публикаций по определению витаминов за последние 10 лет. Проведенный наукометрический анализ ясно указывает на резкое увеличение числа публикаций по анализу витаминов в последние годы. Таким образом, актуальность определения водо- и жирорастворимых витаминов неуклонно растет. На рис. 1.2.-1.4 представлены диаграммы распределения числа публикаций по физико-химическим методам определения витаминов. Из диаграмм следует, что большинство публикаций по методам количественного химического анализа водорастворимых витаминов Bj, В2 и жирорастворимого витамина Е посвящены широко распространенному за рубежом методу ВЭЖХ (около 60% работ).
Оптические методы анализа использовали примерно в 20% публикаций, электрохимические - в 10%. Из представленных диаграмм следует, что вольтамперометрический метод анализа в настоящее время успешно развивается для определения водо- и жирорастворимых витаминов. Обзор литературы по аналитическим возможностям физико-химических методов определения витаминов Е, Bi и Вг в различных объектах представлен в таблице 1.1. Простейшими методами определения водорастворимых витаминов В і и В2 являются химические и микробиологические. Гравиметрический метод анализа тиамина бромида основан на его осаждении кремневольфрамовой, фосфорновольфрамовой или пирколоновой кислотами. Тиамина хлорид определяют методом неводного титрования в растворе безводной уксусной использованием тест-организма L. casei АТСС 7469 [2] длителен и требует специальных условий. Методы являются сравнительно простыми, однако отличаются малой специфичностью, невысокой чувствительностью и не нашли широкого применения для анализа витаминов в многокомпонентных смесях. Широко распространены оптические методы определения витаминов. Колориметрическое определение тиамина основано на образовании окрашенных комплексов с п-аминофенолом [152, 158], ализарином фиолетовым [170], натриевой солью фенилгидразин-4-сульфоновой кислоты [155], их экстракции с последующим измерением оптической плотности при Х,=430 нм [152, 158], Х,=575 нм [170], Х,=490 нм [155]. Метод применяли для анализа тиамина в фармпрепаратах. Наличие в молекуле тиамина ядра тиазолия позволяет определять концентрацию витамина В і колориметрически с помощью соли цинка при А,=670нм [157]; 2,3,5,6-тетрабромо-1,4-бензохинона (II) в водно-ацетонитрильных растворах [156], в виде комплексов с эозином [151]. В основу колориметрических методов определения витамина Вг положены цветные реакции: с реактивом Дениже (раствор сульфата окиси ртути) - оранжевое окрашивание; при рН 6,5 - 7,2 с раствором нитрата серебра - красное или розово-красное окрашивание [2].
Предложены методики спектрофотометрического определения рибофлавина, основанные на его реакции с NaJ04 и измерении оптической плотности образовавшегося катионного красителя [115]. Производную спектрофотометрию [119] использовали при анализе пищевых продуктов. Малая селективность, высокая длительность анализа, а также низкая чувствительность (10"4 - - 10"3 моль/л) не позволяет использовать эти методы для анализа водорастворимых витаминов в многокомпонентных смесях. Колориметрический метод определения витамина Е основан на его способности окисляться с образованием окрашенных продуктов. При этом химическая структура продуктов окисления и их окраска разнообразны и зависят от характера окисления. Наиболее известным является железопиридиловый метод Эммери-Энгеля, основанный на окислении токоферола хлорным железом в присутствии а-а-дипиридила [15-18, 21] или о-фенантролина. В методе Фуртера-Мейера токоферол окисляют концентрированной азотной кислотой, образующийся при этом о-токоферилхинон имеет красную окраску [2, 4]. Государственная Фармакопея (ГФ X) рекомендует количественное определение токоферола проводить периметрическим методом, основанном на его титровании сульфатом церия (IV) в присутствии в качестве индикатора дифениламина до появления сине-фиолетового окрашивания [2, 4]. Основными недостатками колориметрических методов определения витамина Е является их неспецифичность. Многие вещества, встречающиеся в исследуемых объектах, при окислении способны подобно токоферолам давать окрашенные продукты [28]. С целью удаления из исследуемой среды посторонних мешающих веществ (каротиноидов, стеролов, витамина А) чаще всего применяют щелочное омыление спиртовым раствором КОН с добавкой антиоксидантов (пирогаллола, аскорбиновой кислоты) и последующей экстракцией токоферола из неомыленной части сернокислым эфиром [15-17, 21,27,31]. Щелочное омыление небезразлично для токоферола, который нестоек в щелочной среде, тем более что мешающие анализу вещества часто остаются в неомыляемой фракции [28]. Перечисленные недостатки отсутствуют во флуориметрическом методе [22, 25-27], основанном на образовании флуоресцирующего красителя феназина при конденсации окисленной формы токоферола о-токоферилхинона с о-фенилендиамином.
Сравнение перечисленных оптических методов анализа токоферола проведено в работе [27]. Авторы показали что, флуориметрический метод определения витамина Е в продуктах детского питания имеет меньшую погрешность анализа по сравнению с колориметрическими методами. Флуориметрические методы определения водорастворимых витаминов В] и Е$2 рекомендованы нормативными документами и чаще всего используются в современных лабораториях. Флуориметрический метод определения тиамина основан на его окислении в щелочной среде с образованием сильнофлуоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения тиохрома, интенсивность флуоресценции которого прямопропорциональна концентрации тиамина. В качестве окислителей используют K3[Fe(CN)6] [164, 163, 167], BrCN [168], систему CuS04+KCN [162], свежеприготовленный NaBrO [161], HgCl2 [160], N-бромсукцинимид [112] и другие окислители. Образовавшийся тиохром экстрагируют изобутанолом, либо изопропанолом. Анализ многокомпонентных смесей затрудняется наличием в ряде объектов веществ, обладающих флуоресценцией. Маскируя флуоресценцию тиохрома, эти вещества искажают результаты анализа и делают невозможным экспрессное определение тиамина без специальных обработок проб. Мешающие соединения удаляют, пропуская анализируемый раствор через колонки с ионообменными смолами [167]. Флуориметрический метод определения витамина Вг применяют в двух вариантах. Интенсивность флуоресценции рибофлавина до и после восстановления его гидросульфитом натрия определяют в варианте прямой флуориметрии. Данный способ широко используется при анализе пищевых продуктов [114, 124], биологических объектов [122], лекарственных препаратов [112]. Способность рибофлавина при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин используют при анализе поливитаминов [120], овощей [118].
Приготовление растворов, посуды
Метод вольтамперометрии предъявляет повышенные требования к чистоте применяемых реактивов, очистке воды, материалам электродов и посуде. При анализе водорастворимых витаминов В і и Bj для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду по ГОСТ 6709-72, перегнанную в присутствии серной кислоты (0,5 мл концентрированной серной кислоты на 1,0 л дистиллированной воды) и перманганата калия (3,0 мл 3%-ного раствора на 1,0 л дистиллированной воды). При определении жирорастворимого витамина Е применяли ацетонитрил (ТУ 6-09-3534-87) и хлороформ по ГОСТ 20015-88. Основной раствор, содержащий 1000,0 мг/дм витамина В2, готовили растворением навески фармакопейного препарата сухого порошка рибофлавина (с содержанием основного вещества не менее 99,5 %) в 10,0 см3 раствора NaOH концентрации 0,1 моль\дм , перемешиванием и последующим доведением объема до метки бидистиллированной водой. »
Основной раствор, содержащий 1000,0 мг/дм витамина Вь готовили растворением навески сухого порошка тиамина хлорида (с содержанием основного вещества не менее 99,5 %) в бидистиллированой воде. Основной раствор, содержащий 1000,0 мг/дм витамина Е, готовили растворением навески фармакопейного препарата а-токоферола ацетата [35] в хлороформе перемешиванием с последующим разведением ацетонитрилом. Рабочие растворы более низкой концентрации готовили разбавлением ,щ основных растворов по общепринятой методике. Растворы фоновых электролитов готовили из реактивов марки ХЧ и ОС.Ч. Растворы фоновых электролитов при определении водорастворимых витаминов готовили растворением навески соответствующих солей в бидистиллированной воде. При определении жирорастворимого витамина Е растворы фоновых электролитов готовили растворением навески соответствующих солей в ацетонитриле. Для приготовления растворов использовали лабораторную мерную стеклянную посуду второго класса точности по ГОСТ 1770-74Е: колбы наливные вместимостью 25,0; 50,0; 100,0; 1000,0 см ; цилиндры вместимостью 10,0; 25,0 см . Пипетки мерные лабораторные стеклянные 2 класса точности вместимостью 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 см3 по ГОСТ 29227-9IE; дозаторы пипеточные различной емкости типа ДПВ-1-5-40, ДПВ-1-40-200, ДПФ-1-200 илиШ. В качестве объектов исследования использовали многокомпонентные сухие витаминизированные смеси: поливитаминные препараты («Эвитол», изготовленный KRKA, d.d. Novo mesto, Slovenia; «Дуовит», KRKA, d.d. Novo mesto, Slovenia; «Аэровит», АО «Ай си эн Октябрь», г.Санкт-Петербург, Россия), представляющие собой смеси водо- и жирорастворимых витаминов, а также микроэлементов, содержащие наполнители и антиоксиданты; биологически активные добавки (БАД), выпускаемые фирмой «Артлайф» г.Томск - «Формула женщины», «Диенал», «Тенерол», «Супер йохимбе максимум», «Маньчжу Айсинь», «Метаболайн», «Бур док С».
Биологически активные добавки имеют различный состав и содержат значительное количество органических и неорганических веществ: витаминов, флавоноидов, полифенольных соединений, микроэлементов и т.д.; витаминизированные подкормки и корма для животных и птиц — премикс для цыплят «Солнышко», премикс для гусей «Иван Иваныч», премикс для телят «Гаврюша» (НПО «Гигиена-Био», ООО «Агровит»), минерально-витаминная подкормка для собак, кошек и пушных зверей, витаминно-минеральная подкормка для цыплят фирмы "Апитокс" г.Краснодар, жмых соевый с кукурузой, шрот подсолнечный, мясокостная мука и др. В таких смесях витамины В і, Вг и Е находятся практически в свободном состоянии и могут быть электрохимически определены без дополнительной длительной пробоподготовки. Кварцевый стаканчик с фоновым электролитом объемом 10,0 мл помещали в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора и погружали в раствор индикаторный, вспомогательный электроды и электрод сравнения, установленные в соответствующие разъемы электрохимической ячейки. С помощью установленной на компьютере программы СТА или ВАМ выбирали режим съемки вольтамперограмм и регистрировали вольтамперограмму фона. Добавляли аликвоту стандартного раствора определяемого компонента и вновь регистрировали вольтамперограмму при тех же условиях. Для изучения адсорбции витамина В і методом двойного обратного интегрирования проводили съемку зависимостей емкостного тока от потенциала электрода при различных концентрациях витамина. В области совпадения кривых зависимости емкостного тока от потенциала электрода определяли потенциал сравнения (Еср, В) после чего находили соответствующую величине Еср плотность заряда (qcp, Кл/см ) и изменение поверхностного натяжения (Ааср, Дж/см). Проводили интегрирование соответствующих кривых зависимости емкостного тока от потенциала электрода, находили искомую зависимость плотности заряда и изменения поверхностного натяжения от потенциала РПЭ при различной концентрации тиамина в растворе. Все расчеты выполнялись с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.
Водорастворимый витамин Вг (рибофлавин)
При вольтамперометрическом определении витамина В2 (рибофлавина) в качестве индикаторных использовали три типа углеродных электродов: графитовый, пропитанный смесью полиэтилена с парафином в вакууме, пирографитовый и стеклоуглеродный. По легкости окисления рибофлавина электроды можно расположить в ряд: графит стеклоуглерод пирографит -(0,33 - 0,37)В -(0,25 - - 0,27)В -(0,22 - 0,25)В Максимальное значение регистрируемого тока с использованием графитового электрода несколько выше (на 20-30 %), однако из-за большого остаточного тока он оказался менее удобным в работе. Поэтому количественное определение витамина проводили с использованием стеклоуглеродного электрода. Вольтамперограммы электроокисления рибофлавина на СУЭ представлены на рис. 3.8. С целью выбора рабочего фонового электролита исследовали электроокисление рибофлавина в растворах: 0,1 KCI+HCI (рН 4), 0,1 М KCNS, 0,1 М (NH4)2S04, 0,1 М KCI, 0,1 М C6H1407N2, 0,1 М C4H506Na-H20, 0,1 М С4Н60б, 0,1 М С6Н807, буферных растворах Бриттона-Робинсона с рН 1,50 -7,28. Полученные опытные данные представлены в таблице 3.2. Все перечисленные электролиты можно использовать для количественного определения витамина, однако лучшими фоновыми электролитами являются 0,1 М аммоний лимоннокислый двузамещенный (СбНбОуИг) и 0,1 М натрий виннокислый кислый (C4H506Na-H20), на фоне которых регистрируются хорошо воспроизводимые пики окисления. Линейная зависимость градуировочных графиков сохраняется в широком диапазоне концентраций от 2,0 мг/дм до 28,0 мг/дм . Электролит 0,1 М C4H506Na-H20 также является хорошим высаливателем водорастворимых белков (рН раствора соответствует изоэлектрической точке гидролиза водорастворимых белков), мешающих экспрессному определению витамина Вг в кормах. Важным фактором при вольтамперометрическом определении, влияющем на процесс электроокисления витамина, является рН среды [230]. Зависимость потенциала и тока пика электроокисления рибофлавина на СУЭ от рН представлены на рис. 3.9. и 3.10. Зависимость потенциала максимума анодного пика рибофлавина от рН среды имеет сложный характер. С увеличением концентрации гидроксид ионов происходит смещение потенциала пика в катодную область, т.е. способствует облегчению процесса электроокисления рибофлавина, что, по-видимому, связано с протеканием ступенчатой реакции депротонизации различных форм витамина.
Депротонизация может предшествовать стадии отдачи электрона от молекулы деполяризатора к электроду или протекать одновременно с ней. Известно, что в водных растворах рибофлавин может находиться в катионной, нейтральной и анионной формах, а также в виде семихинонов [12, 13]. При рН 8 рибофлавин существует в катионных формах: АНг+, АН3+, АН4+. В очень кислых растворах, при рН 4, рибофлавин находится преимущественно в катионных формах АНз+ и АН/ (протонирован атом азота в положении 1 и 10). С увеличением концентрации гидроксид ионов (рН 4), рибофлавин переходит в менее протонированную форму в виде АН2+ и АН3+ (протонирован атом азота в положении 10). При дальнейшем увеличении кислотности среды (рН 7) рибофлавин, по-видимому, существует в виде нейтральной молекулы АН и АН2. При рН 10 возможно образование анионных форм рибофлавина А и АИ{ (отсутствует протон у атома азота в положении 3). Характер зависимости потенциала пика от рН обусловлен смещением протолитического равновесия органического вещества в растворе. Значения рН в точках пересечения продолжений прямолинейных участков экспериментальной зависимости Е от рН соответствует величинам pKi=3,6 и рК2=7,2 [231,233].
Вычисленные эффективные значения констант диссоциации различных форм рибофлавина удовлетворительно согласуются с литературными данными, полученными другими методами [13], и представлены в таблице 3.3. По мере повышения рН фонового электролита изменяется форма нахождения рибофлавина в растворе, определяемая протолитическим равновесием. Т.к. на отрыв электрона от нейтральной частицы требуется меньше энергии, чем от катионной, потенциал электроокисления витамина в щелочной среде (где преобладает нейтральная форма молекулы рибофлавина) ниже, чем в кислой. Потенциал пика органического вещества в растворе определяется не отношением концентраций окисленной и восстановленной форм в уравнении Нернста, а кинетикой переноса электронов, и, возможно, протонов, зависящих от адсорбции органического вещества и строения двойного электрического слоя [230]. В этом случае зависимость Е от рН определяется выражением: где V- число протонов, принимающих участие в электродном процессе.
Тангенс угла наклона зависимости Е от рН равен 0,625, что свидетельствует об участии в электродном процессе одного электрона и одного протона. Характер зависимости величины тока окисления витамина В2 от рН фонового электролита, представленной на рис. 3.10, можно объяснить « изменением механизма электрохимического окисления органического вещества с увеличением рН среды. Фоновые электролиты 0,1 М C6H14O7N2 (рН 4-5) и 0,1 М C4H506Na-H20 (рН 3-4), применяемые при вольтамперометрическом определении рибофлавина в многокомпонентных витаминизированных смесях, имеют оптимальные значения рН, при которых рибофлавин находится в устойчивой протонированной форме.
Изучение адсорбции витамина В і методом двойного обратного интегрирования
Известно, что органические вещества, содержащие тиольную группу, обладают большой адсорбционной способностью. Для изучения адсорбции витамина Bj на ртутно-пленочном электроде впервые применили метод двойного обратного интегрирования емкостных токов [242]. Этот метод менее трудоемкий, чем известные [243], экспрессный и позволяет избежать необходимости использования большого количества токсичной ртути. Зависимость емкостного тока витамина
В і от потенциала электрода снимали в диапазоне от -1,6 В до 0,2 В при различных концентрациях витамина. Величины потенциалов нулевого заряда (Ен.3.) фоновых электролитов 0,1 М ЫазР04 и 0,1 М КОН оценивали по минимумам значений емкостного тока в отсутствии тиамина. В области совпадения кривых зависимости емкостного тока от потенциала электрода при различных значениях концентрации витамина определяли Еср, после чего находили соответствующую величине ЕСР; плотность заряда (qcp) и изменение поверхностного натяжения (ЛСУ,ТУ Проводили интегрирование соответствующих кривых зависимостей емкостного тока от потенциала электрода: где к - коэффициент пропорциональности, оцениваемый измерением величины емкостного тока на конденсаторе известной емкости, согласно выражению: где d - дифференциальная емкость двойного электрического слоя. Используя уравнения 4.4. и 4.5, находили искомую зависимость плотности заряда и изменения поверхностного натяжения от потенциала РПЭ при различной концентрации тиамина в растворе. Все расчеты выполнялись с использованием компьютерной программы Microsoft Excel. Полученные опытные данные частично представлены на рисунках 4.12-4.15. Из анализа полученных данных следует, что в растворах 0,1 М Na3P04 и 0,1 М КОН имеет место анионный тип адсорбции витамина. Этот факт подтверждает известные в литературе данные о том, что в щелочных средах в растворе тиамин существует в виде аниона RS .
С электроаналитической точки зрения здесь важно четко зафиксировать значение потенциала десорбции. Потенциал десорбции витамина В і находится на отрицательной ветви электрокапиллярной кривой и равен Едес= -0,7 В для 0,1 М Na3P04 и Едес=-1,05 В для 0,1 М КОН. Полученные опытные данные позволили также оценить величину адсорбции (Г, моль/см ), константу адсорбционного равновесия (К, дм /моль), величину максимальной адсорбции (Го,, моль/см), изменение свободной энергии адсорбции (AGA, кДж/моль). Для количественной оценки величины адсорбции использовали уравнение Гиббса: л-4 -4 Из (4.8) следует, что график в координатах Cj/Tj = f(Q) описывается прямой линией (рис. 4.17.), из углового коэффициента которой можно оценить величину Га,, а из отрезка, отсекающего этой прямой по оси ординат, величину константы адсорбционного равновесия, К. По уравнению (4.9) оценивали изменение свободной энергии процесса адсорбции &GA , кДж/моль. Обобщенные данные количественной оценки величины адсорбции витамина В і на ртутно-пленочном электроде на фонах 0,1 М ЫазР04 и 0,1 М КОН представлены в таблице 4.3. Величина полученных из экспериментальных данных параметров адсорбции свидетельствует о вкладе адсорбционной составляющей в величину предельного тока восстановления тиамина с поверхности ртутно-пленочного электрода. При определении малых содержаний компонентов важными метрологическими характеристиками являются нижняя граница определяемых содержаний (С„) и предел обнаружения (Cmjn p) [244]. Нижняя граница определяемых содержаний соответствует достижению некоторого регламентированного уровня относительного стандартного отклонения (Sr) в соответствии с экспериментально полученной зависимостью Sr от содержания определяемого компонента [245]. При определении Сн строили кривые зависимости Sr от содержания компонента, определяемого по данной методике. Принцип построения Sr = f(Q) заключается в получении и оценке Sr для всего диапазона содержаний, определяемых по данной методике [234]. Нижнюю границу определяемых содержаний витаминов находили как минимальное содержание вещества, определяемое по данной методике при Sr=0,33 (табл.5.1). В вольтамперометрическом методе, как и в других методах анализа, для расчета предела обнаружения используют критерии, основанные на предположении о нормальности закона распределения аналитического сигнала. В соответствиями с рекомендациями [246] Стш,р-наименыцая концентрация, при которой по данной методике можно обнаружить значимое присутствие определяемого компонента в анализируемом объекте. Для оценки Cmjn,p в литературе описано достаточно большое количество критериев: критерий оценки ПО для ограниченного числа параллельных измерений; непараметрический критерий оценки [247]. Для объективного сравнения возможностей одного метода с другим нами использован трехсигмовый критерий Кайзера [245] (табл.5.1).
