Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Общая характеристика жирорастворимых витаминов 10
1.2. Методы аналитического определения витаминов групп A, D, Е и К 15
1.2.1. Химические и биологические методы 16
1.2.2. Оптические методы 16
1.2.3. Электрохимические методы 19
1.2.4. Хроматографические методы 20
2. Основные факторы, влияющие на разделение в обращенно- фазовой жидкостной хроматографии 31
2.1 Неподвижные фазы и адсорбция сорбатов 31
2.2. Подвижные фазы и их селективность 32
2.3. Закономерности и модели удерживания в ОФ ВЭЖХ 35
2.4. Методы оптимизации эксперимента 41
2.5. Задачи и этапы исследования 43
3. Экспериментальная часть 45
3.1. Объекты и методы исследования 45
3.2. Растворители и реактивы 46
3.3. Приборы и оборудование 48
3.4. Приготовление хроматографических колонок 50
3.5. Расчет параметров хроматографического разделения 51
4. Закономерности разделения жирорастворимых витаминов при элюировании бинарными водно-органическими элюентами 53
4.1. Структура и гидрофобность сорбатов 53
4.2. Применение универсальной квазихимической модели удерживания ЖРВ при элюировании водно-органическими смесями 54
4.3. Разделение на химически модифицированных сорбентах 62
4.4. Разделение на кремнеземах с привитыми алкильными группами 64
5. Много параметрическая оптимизация состава трехкомпонентной подвижной фазы 67
5.1. Выбор композиционных факторов и параметров оптимизации 67
5.2. Ограничение области факторного пространства на «главном» концентрационном треугольнике "состав-свойство" 67
5.3. Математическое планирование проведения эксперимента, расчет уравнений регрессий, проверка адекватности полученных уравнений, решение задач «максимина» и совместное решение системы неравенств 70
5.4. Экспериментальная проверка математического прогнозирования качества разделения смеси сорбатов 79
5.5. Схема выбора сорбента и элюента для разделения ЖРВ 83
6. Определение витаминов в лекарственных смесях, фармацевтических и ветеринарных препаратах 89
6.1. Характеристики селективности и эффективности разделения витаминов на сорбентах различной природы 89
6.2. Определение предела обнаружения и параметров уравнений регрессии 96
6.3. Определение витаминов в препаратах с водорастворимой основой 98
Выводы 111
Литература
- Методы аналитического определения витаминов групп A, D, Е и К
- Закономерности и модели удерживания в ОФ ВЭЖХ
- Приготовление хроматографических колонок
- Применение универсальной квазихимической модели удерживания ЖРВ при элюировании водно-органическими смесями
Введение к работе
Актуальность темы. Среди физиологически активных природных органических соединений - алкалоидов, гормонов, антибиотиков и других - витамины занимают особое место. Они представляют собой постоянные составные части живого функционирующего организма, незаменимы для питания и являются лечебными средствами, усиливающими защитные функции организма. Витамины находят широкое применение как пищевые добавки антиокислительного действия, используемые в здравоохранении и животноводстве /1/. Поэтому контроль содержания витаминов и уровня их сохранности очень важен для оценки пригодности фармацевтических препаратов, особенно пищевых продуктов и препаратов для животноводства.
Эффективным методом, позволяющим обеспечить количественный контроль содержания витаминов в многокомпонентных объектах, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - универсальный аналитический метод разделения и определения компонентов сложных смесей. Метод ВЭЖХ незаменим при анализе термически и химически лабильных жирорастворимых витаминов (ЖРВ) групп A, D, Е и К. Обычно применяемый вариант нормально-фазового (НФ) разделения синтетических жирорастворимых витаминов /2/ основан на элюировании их неполярными органическими растворителями после сорбции на полярных сорбентах (химически модифицированных кремнеземах (ХМ.К), модифицированных полярными функциональными группами). Однако такой вариант ВЭЖХ не обеспечивает эффективного разделения сложных смесей, с полным набором жирорастворимых витаминов (A, D, Е и Кч) в пробах с водосо-держащей матрицей, так как даже небольшие количества воды могут негативно влиять на воспроизводимость результатов. Такие препараты для НФ ВЭЖХ должны быть предварительно переведены методами щелочного гидролиза в форму, удобную для последующего хроматографирования. При проведении подобных операций изменяется состав биологически активной формы - эфиров. Поэтому определяется только суммарное содержание продуктов гидролиза.
Основным методом анализа ЖРВ без изменения их состава может стать об-ращенно-фазовая ВЭЖХ.
Цель работы. Изучение закономерностей удерживания жирорастворимых витаминов (A, D, Е, К-0 в условиях изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ, оптимизация условий их дифференцированного разделения и разработка аналитических методик определения содержания витаминов в готовой продукции.
Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2000-2004 г., утвержденный Президиумом Совета 21.08.2000 г., проблема "Применение хроматографических процессов для выделения и очистки биологически активных соединений", тема "Высокоэффективная жидкостная и высокоэффективная ионная хроматография биологически активных веществ", код 2.15.11.4.Х70.
Научная новизна. Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:
- рассчитаны характеристики полярности (Н) и индекс связываемости (х) витаминов;
- изучен характер изменения параметров удерживания витаминов на кремнеземах, химически модифицированных полярными (Silasorb-NH2, Si-lasorb-CN, Siiasorb-Diol) и неполярными (Silasorb-C2 Cix) функциональными группами,
- исследовано хроматографическое поведение витаминов при элюировании бинарными и трехкомпонентными водосодержащими подвижными фазами на основе изопропанола, //.-пропанола, ацетонитрила и 1,4-диоксана;
- показана возможность применения уравнения универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимо действий сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, модификатор-сорбат, модификатор-модификатор;
- предложена процедура оптимизации состава трехкомпонет ного элюента с использованием симплекс-решетчатых планов Шеффе {3,3}, которая включает проведение активного эксперимента и программу обработки полученных данных, разработанную в среде "Mathcad 2001"; установлен оптимальный состав трехкомпонентного элюента для анализа многокомпонентных смесей витаминов;
- разработана рациональная схема выбора ОФ хроматографических систем для анализа витаминов (до 6 компонентов) в различных сочетаниях;
- разработан комплекс методик определения жирорастворимых витаминов А (ацетат, пальмитат), Кд, р-каротин, D2 (D.0, Е (ацетат, токоферол) - в готовых продуктах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии.
Практическая значимость работы состоит в следующем:
- установлены закономерности удерживания витаминов от природы сорбентов и состава водно-органических подвижных фаз;
- показана возможность эффективного разделения смеси А-ацетат, А-пальмитат, Ку, р-каротин, D2 (Di), Е-ацетат (Е-токоферол) методом ОФ ВЭЖХ при изократическом элюировании подвижной фазой состава //.-пропанол:ацетонитрил:вода (59,76:5,66:34,58) на силикагеле с химически привитыми алкильными группами (-С/я).
- разработаны методики количественного определения ЖРВ методом ОФ ВЭЖХ с сокращением времени пробоподготовки без отделения матрицы в готовых водорастворимых формах медицинской промышленности ("Водный раствор витамина D/, "Сантевит", "Мультивитамин", "Веторон-Е"), фармацевтических препаратах ("Углекислотный экстракт пихты сибирской", "Натуральный биоэкстракт облепихи и пихты сибирской"), препара тах для ветеринарии ("Тривит", "Нитамин"). Методики внедрены на предприятиях Белгородского промышленного региона. Закономерности изменения хроматографического поведения, характеристики удерживания и приемы оптимизации разделения смесей ЖРВ могут быть включены в хроматографические базы данных. Положения, представляемые к защите: I). закономерности удерживания синтетических жирорастворимых витаминов (А-ацетат, Kt, D2, Е-ацетат) в условиях изократической ОФ ВЭЖХ.; 2). оценка роли сорбента и выбор его для разделения смеси жирорастворимых витаминов; 3). выводы о возможности описания удерживания жирорастворимых витаминов с позиций универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ; 4 4). процедура оптимизации состава трехкомпонентной подвижной фазы для разделения смеси витаминов;
5). методики хроматографического определения витаминов в готовых формах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на И Международном симпозиуме "Хроматография и спектроскопия в анализе объектов окружающей среды и токсикологии" (Санкт-Петербург, 1996); на Всероссийской конференции "Экоаналитика-96" (Краснодар, 1996); Российско-американском конгрессе "Экологическая инициатива" (Воронеж, 1996); Международных симпозиумах по хроматографии (ISC-96, Германия, Штутгарт; ISC-98, Италия, Рим); 10 Международном симпозиуме "Успехи и применение хроматографии в промышленности" (Чехия, Братислава, 1996); Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997); 1 Международной научно-технической конференции "Экология человека и природа" (Иваново, 1997); 28 Международном Симпозиуме по аналитической химии окружающей среды (1SEAC, Щвейцария, Женева, 1998); XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Моек ва, 1998); 23 Международном Симпозиуме по разделениям в ВЭЖХ (HPLS 99, Испания, Гранада, 1999); на VI конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Вос-тока-2000" (Новосибирск, 2000); Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003); Научно-технической конференции по хроматографии "Иони-ты" (Воронеж, 2003).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 40 печатных работ, из них 5 статей в "Журнале аналитической химии", "Заводская лаборатория. Диагностика материалов", "Ecological Congress", 7 статей в сборниках статей и трудов конференций; 28 тезисов докладов. Наиболее значимые публикации представлены в списке опубликованных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и характеристики метода, четырех разделов экспериментальной и расчетной части, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 159 страницах, содержит 27 рисунков и 26 таблиц. Список литературы включает 156 наименований, в том числе 68 иностранных источников.
Методы аналитического определения витаминов групп A, D, Е и К
Витамины группы D (кальциферолы) - производные 6-(3-окси-10-метиленциклогексан-5-илен) -7-(ІЗ-метиленгидриндан-8-илен) - этана, замещенные в положении 17 алифатической разветвленной цепью из 8-Ю атомов углерода/2, 3/. В молекуле витамина D условно выделяют 2 части - кольцевую систему и алифатическую боковую цепь.
Углеродный скелет, лежащий в основе молекулы витамина D, обладает значительным сходством с циклопентанпергидрофенантреновой кольцевой системой стеринов. Эта система из четырех конденсированных колец присутствует в животных и растительных стеринах (холестерин, эргостерин), стероидных гормонах. Основное отличие структуры витамина D от других стероидных соединений состоит в том, что в молекулах последних одно из колец разомкнуто. Сходство химического строения витаминов группы D и стеринов носит генетический характер, поскольку они образуются в результате изомеризации соответствующих стеринов. Основными представителями этой группы являются витамины Ог (кальциферол, или эргокальциферол), Di (холекальциферол), реже применяют D4 (дигидроэргокальциферол) /4-7/.
Эргокальциферол и холекальциферол представляют собой белые кристаллические вещества, чувствительные к действию света, кислорода воздуха и других окисляющих факторов, особенно при нагревании. Кальциферолы устойчивы к щелочам, но чувствительны к действию кислот, неустойчивы к действию УФ-света, происходящий при этом фотохимический процесс необратим. В органических растворителях, особенно в растительных маслах, витамины устойчивы; это связано с присутствием в маслах антиоксидантов, тормозящих окисление витамина D.
Витамин D} является активным антирахитическим средством, обусловливает правильный кальциево-фосфорный обмен организма. Он необходим для обеспечения нормальной функции околощитовидных желез. Надежный контроль за содержанием витамина Од в фармацевтических препаратах имеет важное значение в связи с его высокой биологической активностью
Токоферолы и их химические аналоги (витамины группы Е) представляют собой производные 2-метил-2,(4 ,8\12 -триметилтридецил)-6-хроманола, или токола. Токоферолы представляют собой прозрачные маслообразующие жидкое желто-зеленого цвета, легко образуют устойчивые эфиры с кислотами: уксусной, , пропионовой, янтарной, капроновой, пальмитиновой, стеариновой, фосфорной. Соединения хорошо кристаллизуются.
Наибольшей биологической активностью отличается а-токоферол с тремя метильными группами в ядре хроманола, который чувствителен к УФ-свету, устойчив к нагреванию до 200"С и действию минеральных кислот (даже при 100С), с гидроксидом натрия реагирует очень медленно, может быть получен из содержащих его эфирные формы растительных масел методом омыления.
Токоферолы - сильные восстановители. Способность изомерных токоферолов к легкому окислению лежит в основе их эффективности как антиоксидантов /4/. Витамин Е по сравнению с другими витаминами обладает очень высокой температурной устойчивостью: нагревание до 170С на воздухе и до 220-250С в вакууме не лишает его биологической активности.
Витамины группы К - производные нафтохинонов. К ним относятся производные 2-метил-1,4-нафтохинона (менадион, витамин К /4/). Нафтохиноны -кристаллические (менадион) или вязкие маслообразные вещества желтого цвета (филлохинон). Стойки при длительном кипячении в воде, но разлагаются щелочами при кипячении. Благодаря наличию двух асимметричных углеродных атомов оптически активны. Витамины группы К легко подвергаются фотоокислению, они неустойчивы к УФ и устойчивы к ИК-свету.
Рассмотренные свойства витаминов являются основополагающими в существующих методах их определения.
В технических и биологических объектах витамины присутствуют в составе сложных рецептур. В основу методов контроля содержания ЖРВ в сложных по составу смесях положены химические, биологические и инструментальные аналитические методы /8-13/.
Химические и биологические методы
Титриметрические методы, отличающиеся высокой точностью, но низкой избирательностью, применяются главным образом в анализе лекарственных веществ - субстанций. Однако эти методы малопригодны при анализе многокомпонентных смесей лекарственных форм, содержащих наряду со вспомогательными веществами и другие близкие по свойствам соединения. Титрование сульфатом церия нашло применение при определении менадиона, оценке чистоты сх-токоферола ацетата, а также определении витамина Е. Реакция с SbCb применяется для идентификации витаминов D и А в лекарственных формах /10/.
Биологические методы определения некоторых витаминов отличаются высокой чувствительностью и могут использоваться для исследования образцов с незначительным содержанием этих соединений /13-16/. Принцип биологических методов сводится к измерению сигнала биологической системы (клеток, растений или животных) на определяемый компонент. Так, кальциферолы и менадион определяют в микрограммовых количествах по их влиянию на рост некоторых микроорганизмов и проявлению соответствующего биологического действия; предел обнаружения метода составляет 0,01-0,02 мкг /1 5/. Но точность этих методов невелика, они требуют больших затрат времени /13-16/. Биологические методы дают представление лишь о суммарном содержании биологически активного вещества в исследуемом объекте без указаний на химическую природу соединений, ответственных за эту активность /16/.
Закономерности и модели удерживания в ОФ ВЭЖХ
Группы I, II, V и VIII имеют наиболее ярко выраженную селективность: в группу 1 входят акцепторы протонов (простые эфиры, амины), в группу VIII -доноры протонов (хлороформ, вода, л/-крезол), в группу II - доноры-акцепторы (спирты) и в группу V - растворители (метиленхлорид, дихлорэтан), предпочтительно взаимодействующие с веществами, имеющими большой дипольный момент. Растворители группы VII (ароматические соединения, нитроалканы) характеризуются повышенным взаимодействием с акцепторами электронов. Поэтому для решения каждой конкретной задачи состав подвижной фазы должен быть тщательно подобран с учетом физических и химических свойств ее компонентов/3, 102, 105, 109, ПО/.
Элюенты в ОФ ВЭЖХ должны отвечать следующим требованиям /3, 102, 103/: - оптическая «прозрачность», т.е. не должны обладать заметным светопоглощением в заданном для определяемого вещества диапазоне длин волн; - высокая растворяющая способность; - химическая инертность; - невысокая вязкость ( 0,6 сП).
Наибольшая селективность подвижной фазы достигается при проявлении специфических взаимодействий между элюентом и компонентами пробы. Замена растворителя в смеси в пределах одной группы приводит к небольшим изменениям селекгивности подвижной фазы. Гораздо сильнее изменяется селективность элюента при переходе растворителя от одной группы к другой. Получить оптимальные значения к на чистых (однокомпонентных) элюентах удается крайне редко. Как правило используют смеси растворителей, позволяющие расширить возможности жидкостной хроматографии /111-113/.
При целенаправленном выборе растворителей в качестве элюентов следуеі рассматривать весь комплекс их свойств /109, 114-118/. Априорный выбор состава подвижной фазы может быть выполнен по упрощенному критерию гидрофобности (Н) сорбата /3, 119, 120/. ЖРВ относятся к группе высоко- и среднеполярных соединений. Поэтому для их разделения на химически модифицированных силикагелях (ХМС) в режиме ОФ хроматографии в качестве базовых применяют подвижные фазы на основе изопропанола или ацетонитрила с добавками воды, способные к проявлению специфических взаимодействий с полярными группами сорбата/3/.
При использовании ОФ варианта ВЭЖХ из полярного элюента сильнее сорбируются на поверхности неполярного сорбента соединения с неполярными функциональными группами, при этом удерживание соединений происходит за счет адсорбции неполярных групп /112, 122-126/. Наличие полярных групп уменьшает удерживание, так как они взаимодействуют с полярными группами молекул элюента, и это взаимодействие стремится уменьшить взаимодействие молекулы с поверхностью сорбента и перевести ее в объем подвижной фазы. Таким образом, в ОФ хроматографии удерживание определяется, с одной стороны, неполярным неспецифическим взаимодействием сорбат-сорбент, а с другой - полярным специфическим взаимодействием сорбат-элюент(табл. 2.І.).
Единая теория удерживания в жидкостной адсорбционной хроматографии пока не разработана. Для сорбентов с привитыми неполярными группами (вариант ОФ ВЭЖХ) предложен механизм удерживания, основанный на представлениях сольвофобной (или гидрофобной) теории /119, 122/. Удерживание рассматривается как обратимый процесс ассоциации молекул растворенного вещества с углеводородными лигандами, ковалентно связанными с поверхностью неподвижной фазы. Поскольку взаимодействие между сорбатом и алкильной цепью неподвижной фазы осуществляется через растворитель, то взаимодействие сорбат-элюснт играет основную роль в удерживании сорбатов. Коэффициенты емкости зависят от свойств углеводородных цепей сорбата и сольвофобной способности элюента.
Вариант Компонент хроматографической системы Сорбат Сорбент (неполярный) Сорбент (неполярный) Элюент (полярный) Элюент (неполярный) НВ СВ НВ НВ НВ
Сорбция, в первую очередь, определяется гидрофобным взаимодействием хроматографируемых веществ с подвижной фазой и дисперсионным их взаимодействием с неподвижной фазой. Гидрофобное взаимодействие характеризуют как стремление системы иметь минимальную поверхность раздела между полярной подвижной фазой и неполярными фрагментами молекул сорбатов и неподвижной фазой /119/.
Возможны три варианта взаимодействия привитого слоя химически модифицированного кремнезема с молекулами органических соединений (рис. 2.2).
При рассмотрении алкильных сорбентов для ОФ пренебрегают I вариантом локализации: при синтезе подобных сорбентов для уменьшения полярности и повышения однородности поверхности снижают число доступных силанольных групп.
Взаимодействие между веществом пробы и неполярной поверхностью определяется в основном слабыми и неспецифичными дисперсионными силами. В этом случае трудно объяснить наблюдаемую зависимость удерживания и селективности от длины цепи. По-видимому, проникновение молекул сорбата из элюента внутрь привитого слоя связано со стремлением подвижной фазы уменьшить гидрофобную поверхность, возникающую вокруг растворенного вещества и привитых цепей /97/. II III
Взаимодействие веществ с кремнеземами, модифицированными алкилсиланами. Обозначения: I - адсорбция молекул сорбата ( ) на внешней поверхности привитого слоя; 11 - адсорбция молекул сорбата привитым слоем; III - взаимодействие молекул сорбата с остаточными силанольными группами поверхности.
В зависимости от вида взаимодействия механизмы удерживания различны /108-118/. Наибольшее распространение получили модели Снайдера /128/, Хорвата /129, 130/, Мураками /131/ и универсальная квазихимическая вытеснительная модель удерживания /132-135/.
Механизм адсорбции по Снайдеру носит вытеснительный характер. Модель, предложенная Снайдером, связывает удерживание в ОФ ЖХ с элюирующей силой растворителя, определяет необходимую элюирующую силу бинарной подвижной фазы и прогнозирует удерживание в таких хроматографических системах:
Приготовление хроматографических колонок
Используемые в работе насадочные хроматографические колонки заполнены по методу сбалансированной плотности: колонки упакованы устойчивой суспензией сорбента в растворителе с плотностью, близкой к плотности адсорбента. Растворителем для приготовления суспензии была смесь изопропиловый спирт-вода (1:1).
Суспензионное заполнение колонки состоит в следующем: конец хромато-графической колонки, закрытый тампоном хлопчатобумажной ваты толщиной 2-3 мм, соединяют со штуцером, содержащим металлокерамический фильтр и фторопластовую прокладку. Все соединительные элементы, фильтры, колонки, наполнительное устройство перед началом работы тщательно промывают изопропано-лом и ацетоном, сушат в потоке воздуха. Колонку заполняют растворителем, на основе которого готовится суспензия сорбента. Вытеканию растворителя из колонки препятствует загнутый вверх металлический капилляр, подсоединенный к штуцеру. Собранную колонку подсоединяют к наполнительному устройству. Готовят раствор суспензии с массовой долей сорбента в растворителе 5-30 %. Теоретически необходимую массу для упаковки колонки (г), рассчитывают согласно: ,60 (г), (3.1) где d - внутренний диаметр колонки, см; h - высота (длина) колонки, см; р -насыпная плотность сорбента, г/см .
Практически использовали массу сорбента в колонке m = 1,60+0,16 г.
Навеску адсорбента рекомендуется брать на 5-10 % больше рассчитанной. Объем суспензии не должен превышать суммы объемов наполнительного устройства и хроматографической колонки. После перемешивания на магнитной мешалке в течение 10-15 мин гомогенную суспензию выливают в наполнительное устройство, подсоединяют насос высокого давления и прокачивают суспензию в колонку при максимальном давлении элюента (24 МПа) при элюировании раствором w-пропанола в воде (1:1). Колонка считается заполненной, когда скорость ис течения элюента через нее становится постоянной, что наблюдается при пропускании 300-350 мл объема подвижной фазы. После заполнения колонки давление насоса плавно снижают до атмосферного. Через 1-2 мин отсоединяют колонку от наполнительного устройства, слой адсорбента закрывают ватным тампоном и закрепляют на колонке штуцер. Приготовленную колонку устанавливают в термостат хроматографа и кондиционируют прокачиванием 500 мл элюента.
Время удерживания сорбата (tr), мин рассчитывают по хроматограммам, согласно: где Ih - расстояние на диаграммной ленте от ввода пробы до выхода максимума пика, см; и - скорость движения диаграммной ленты, см/мин. Положение базовой линии находили интерполяцией значений ординат в начале и в конце пика. Ширину пика измеряли от внутренней фаницы одной линии до наружной фаницы другой при помощи окуляра-увеличителя с ценой деления 0,1 мм.
Фактор емкости определяют по временам удерживания сорбата (tr) и не-сорбируемого компонента (tro): время удерживания несорбируемого компонента, мин.
Количественную оценку качества хроматографического разделения проводят с помощью критерия разделения Rs, который учитывает влияние эффективности колонки и селективности сорбента на полноту разделения: ширина двух соседних пиков 1 и 2 соответственно.
Отклонение профиля хроматографической зоны анализируемого вещества от формы гауссовой кривой характеризуют с помощью коэффициента асимметрии (As), численное значение которого находят по формуле: где АВ - ширина фронтального участка пика на уровне 0,1 его высоты; ВС -ширина тылового участка пика на уровне 0,1 его высоты.
Полное разделение компонентов пробы регистрируется при Rs 1-1,5; 0,5 k 20;As=l,5/97, 104/.
Критерии гидрофобности (полярности) витаминов рассчитаны /97/ согласно; где пц - общее число атомов углерода; nf - число функциональных групп в молекуле витамина. Значения Н указаны в приложении 1. Индексы связываемости % рассчитаны согласно /125/: где 5xi поправки к индексу связываемости, соответствующие структурным фрагментам, повышающим гидрофильность соединения.
ВЭЖХ - многофакторный метод анализа. На селективность разделения влияют характеристики хроматографической системы: геометрические параметры колонки, тип и свойства сорбента, состав элюента, условия проведения эксперимента (температура, скорость подачи подвижной фазы); а также свойства молекул сорбатов: площадь поверхности, гидрофобность, дипольный момент и наличие функциональных полярных групп способных к специфическим взаимодействиям /97,114/.
В /125/ показано, что площадь поверхности сорбата может быть оценена с помощью индекса связываемое {% (Приложение 1). характеризующего топологию молекулы. Применительно к ВЭЖХ /97, 122, 127/, предложена условная оценка гидрофобности веществ по шкале упрощенного критерия гидрофобности И. ЖРВ относятся к группе высоко- (# 15) и среднегидрофобных (5 # 10) органических соединений (Приложение 1). Несмотря на достаточно высокую гидрофобность, наличие в структуре молекул ЖРВ функциональных полярных групп обусловливает проявления к специфической сорбции на полярных сорбентах. В приложении 1 приведен расчет индекса связываемости (х) и критерия гидрофобности (Н).
В ОФ ВЭЖХ наибольшее распространение получили алкилпривитые сили-кагели с длиной углеводородной цепи С1-С22, но наряду с этими сорбентами применяют ХМК с привитыми аминными (-NH2), нитрильными (-CN) и диольными (-Diol) группами /104/. По полярности (табл. 3.2) специфические неподвижные фазы подразделяют на слабополярные (-Diol), среднеполярные (-CN) и сильнополярные (-NH2).
Применение универсальной квазихимической модели удерживания ЖРВ при элюировании водно-органическими смесями
Оптимизация состава трехкомпонентной подвижной фазы проводилась с применением симплекс-решетчатых планов Шеффе, которые в настоящее время являются одним из наиболее распространенных, удобных и специально адаптированных методов математического планирования эксперимента при изучении диаграмм "состав-свойство" /140, 146, 148/. Эти планы обеспечивают равномерный разброс экспериментальных точек по (?-1)-мерному симплексу и составляют {q, /}-решетку (где q - число компонентов смеси, / - степень полинома). Данные планы являются насыщенными, т. е. по каждому компоненту имеется (/+1) одинаково расположенных уровней xw =0, 1 //,..., 1 и берутся все возможные комбинации с соответствующими значениями концентраций компонентов; и частично композиционными, что позволяет при минимальном дополнительном эксперименте перейти от планов низкого порядка к планам более высоких порядков при необходимости увеличения точности расчетов.
Поскольку математическое планирование эксперимента проводилось с привлечением симплекс-решетчатых планов Шеффе, то четырехстороннюю область KLMN произвольным образом разделили на два независимых локальных симплекса А\(К1М) и M(MNK), имеющих общую диагональ КМ.
Из практики жидкостной хроматографии известно/107, 149-156/, что параметры оптимизации сложным образом зависят от композиционных факторов хро-матографической системы. Поэтому при создании формально-математической модели хроматографического поведения смеси ЖРВ применяли полиномы полной третьей степени, т.е. использовали симплекс-решетчатое планирование
В применяемом методе планирования эксперимента используются безразмерные кодированные композиционные факторы (z .z2 :z3). Связь между концен трациями растворителей в координатах с соответствующими кодиро ваннымивеличинами(7, :z, z,) при условии описывается зависимостью (5.2) где х-, - содержание /-го компонента в вершине - номер вершины локального симплекса; (и) - искомая (любая) точка плана.
Выбранный план предусматривает проведение десяти экспериментов в факторном пространстве для установления уравнений связи между параметрами оптимизации и композиционными факторами хроматофафической системы. Матрицы планирования представлены в табл. 5.1.
В соответствии с рассматриваемыми планами экспериментально измерены факторы емкости (А), разрешения (Its) и критерии асимметрии (Лл) профилей хроматографических пиков жирорастворимых витаминов в каждом локальном симплексе (рис. 5.3, табл. 5.2). По результатам экспериментов рассчитаны уравнения регрессий полного третьего порядка/138/: которые связывают эмпирические оценки условного математического ожидания параметров оптимизации (у) с композиционными факторами. Расчет коэффициентов Л, (табл. 5.3) проводили по формулам /138/: где v, - экспериментальное значение отклика функции (табл. 5.2).
Проверку адекватности уравнений общего вида (5.3) проводили по критерию Стьюдента /138/. Поскольку при постановке эксперимента по симплекс-решетчатым планам пет степеней свободы для проверки адекватности полученных уравнений (т.к. планы насыщенные), то для этих целей ставили опыты в трех дополнительных (контрольных) точках, координаты которых выбирались так, чтобы предусмотреть возможность использования полученных данных для улучшения (переход к полиному более высокой степени) модели при ее неадекватности. Применяемые формулы, экспериментальные данные и результаты расчета приведены в приложении 4. Установлено, что уравнения (5.3) адекватно описывают результаты экспериментов с доверительной вероятностью 95%.
С помощью уравнений (5.3) рассчитали данные и построили проекции гиперповерхностей отклика в зависимости от составов трехкомпонентной подвижной фазы в кодированных координатах. Характерные примеры последних представлены на рис. 5.4. Графические зависимости .у = /( ,,z2,z3) имеют сложный характер, что указывает на правомерность применения для формально-математического описания хроматографического поведения ЖРВ уравнений полного третьего порядка.
На основании полученных уравнений (5.3) составляли систему неравенств, которая представляет собой формально-математическую модель хроматографического поведения ЖРВ в изученной области факторного пространства (табл. 5.1, рис. 5.1):
Поиск максимальных и минимальных значений параметров оптимизации (решение задачи "максимина") осуществляли в среде "Mathcad 2001" с помощью встроенных блоков Given...Maximize и Given...Minimize /145-147/, результаты представлены в Приложении 4.
Принятие гибких границ изменения параметров оптимизации (5.6-5.10) позволяет осуществлять поиск наилучшего локального оптимума при отсутствии глобального в рассматриваемом факторном пространстве,отвечающему условиям (5.1).
Совместное решение системы неравенств (5.5) в среде "Mathcad 2001" с применением блока Given...MinErr /143-145/ позволило рассчитать оптимальные составы трехкомпонентной подвижной фазы //.-пропанол-ацетонитрил-вода А1 (59,30:19,50:21,20 об. %) и Д2 (59,76:5,66:34,58 об. %).
