Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор CLASS литературных данных 12
1.1. Основные группы лекарственных препаратов 12
1.2. Общая характеристика биогенных и лекарственных кортикостероидов 12
1.3. Свойства нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) 19
1.4. Макроциклические агенты, используемые в хроматографии и капиллярном электрофорезе при определении лекарственных препаратов 20
1.4.1. Циклодекстрины 20
1.4.1.1. Комплексообразование щклодекстринов со стероидными гормонами 26
1.4.2. Глюкопешпидные антибиотики в качестве стационарной фазы в капиллярной электрохроматографии (КЭХ) 27
1.4.3. Резориинарен 29
1.4.4. Иммобилизованные белки 29
1.4.5. Циклимы 31
1.4.6. Использование краун-эфиров для разделения лекарственных препаратов 32
1.5. Методы определения кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в биологических жидкостях 33
1.5.1 Иммунологические методы анализа 33
1.5.1.1. Совместное использование методов капиллярного электрофореза и иммунологического исследования для определения стероидных гормонов 35
1.5.2. Газохроматографическое определение кортикостероидов 35
1.5.2.1. Дериеатизациястероидов 36
1.5.3. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в медико-биологических исследованиях 38
1.5.4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) для определения лекарственных препаратов .40
1.5.4.1. Подвижные фазы в ВЭТСХ. 42
1.5.4.2. Мицеллярный вариант высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ) 46
1.5.4.3. Сравнение методов МТСХи ТСХ. 47
1.5.5. Метод капиллярного электрофореза при анализе кортикостероидое и пестероидпых противовоспалительных средств 47
1.5.5.1. Основные варианты капиллярного электрофореза 50
1. 5. 5.1. 1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) 50
1. 5. 5. 1. 2, Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) 51
1. 5. 5, 2. Способы концентрирования, при вводе проб ("стэкинг", "свипинг ") в методах капиллярного электрофореза 54
1. 5. 5. 3. Эффективность, разрешение и селективность разделения в МЭКХ. 58
1. 5. 5. 4. Оптимизация разделения лекарственных препаратов методом капиллярного электрофореза 60
1. 5. 5. 4. 1. Тип цжлодекстрина, концентрация и структура определяемого компонента , 60
1. 5. 5. 4. 2. Влияние рН, концентрации буферного электролита и температуры капилляра на разделение органических соединений 63
1. 5. 5.4.3. Эффекты органических модификаторов, добавленных в буферный электролит.., 64
1. 5. 6. Сравнительная характеристика методов КЭ, ВЭЖХ и ВЭТСХ. 66
1.6. Пробо подготовка биологических жидкостей при определении стероидных гормонов и нестероидных противовоспалительных средств 67
1. 6. 1. Микродиализ, мембранная фильтрация 68
1. 6. 2. Твердофазная и жидкостная экстракции 69
1.6. 3. Специфика пробоподготовки биологических жидкостей для определения стероидных гормонов 70
2. Общая характеристика объектов и методов исследования 72
2.1. Аппаратура 72
2. 2. Реагенты 75
2.3. Методы исследования 78
2.3.1. Капиллярный электрофорез с УФ-детектированием 78
2. 3. 1. 1. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза 79
2.3. 2. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии 19
2. 3. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием 80
2.3. 4. Времяпролетная масс-спектрометр ия 81
3. Хроматографичгхкое и электрофоретйческое определение эндо- и экзогенных кортикостероидов 83
3.1. Использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для определениям эндо- и экзогенных кортикостероидов 83
3.1.1. Мииеллярная ОФ ВЭЖХ эндо- и экзогенных кортикостероидов. 84
3. 1. 2. Обращенно-фазовая ВЭЖХ с В-циклодекстрином в качестве компонента подвижной фазы 88
3.2. Метод капиллярного зонного электрофореза для определения эндои экзогенных кортикостероидов 91
3.3. Физико-химическая модель вторичных равновесий в системе «стероид-макроцикл» 103
3. 4. Использование мицеллярпой электрокинетической хроматографии для определения эндо- и экзогенных кортикостероидов 107
3. 4. 1. Оптимизация электрофоретического разделения стероидов методом МЭКХ. 108
3, 4. 2. Изучение возможностей циклодекстрии-модифицированиой мицеллярпой электрокинетической хроматографии для определения стероидов 114
3. 4. 3. On-line концентрирование эндо- и экзогенных кортикостероидов 117
3. 5. Определение эндо- и экзогенных кортикостероидов методом классической тонкослойной хроматографии 120
3. 6. Сравнительный анализ методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ при определении стероидных гормонов 124
3. 7. Определение эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллярпой тонкослойной хроматографии 124
3.8. Пробоподготовка биологических объектов к анализу 135
3. 8. 1 Пробоподготовка сыворотки крови 135
3.8. 2. Пробоподготовка мочи 135
4. Хроматографическое и электрофоретическое определение нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) 140
4.1. Определение нестероидных противовоспалительных средств методом капиллярного зонного электрофореза и высокоэффективной тонкослойной хроматографии 142
4.1. 1. Определение нестероидных противовоспалительных средств методом КЗЭ с использованием макроциклических агентов 147
5. Практические приложения 154
5. 1. Сравнительные оценочные характеристики методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХи МЭКХ при анализе реальных объектов 154
5. 2. Использование метода ОФ ВЭЖХ для разработки информативных критериев лабораторной диагностики заболеваний коры надпочечников 159
5. 2. 1. Исследования при проведении пробы с дексаметазоном 159
5. 2. 2. Лекарственная терапия с применением кортизон ацетата или преднизалона 164
5. 3. Установление структуры неидентифицированного соединения 165
5. 4. Определение иестероидных противовоспалительных средств в сыворотке крови методом капиллярного электрофореза 169
Выводы 171
- Общая характеристика биогенных и лекарственных кортикостероидов
- Методы определения кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в биологических жидкостях
- Реагенты
- Сравнительный анализ методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ при определении стероидных гормонов
Введение к работе
Контроль за остаточным содержанием лекарственных препаратов (стероидной и нестероидной природы) в биологических жидкостях (кровь, моча) крайне важен при оценке эффективности проводимой лекарственной терапии. Так, одновременное определение стероидов эндо- и экзогенного происхождения позволяет обсудить причину нарушения стероидогенеза при различных эндокринных патологиях. В свою очередь, анализ нестероидных лекарственных средств, применяемых с терапевтическими целями, способствует выявлению требуемой дозы препарата.
Среди опубликованных методов определения лекарственных средств наиболее широкое распространение получили иммунологические и хроматографические. При этом иммуноферментные - имеют существенное ограничение, позволяя за один аналитический цикл определять лишь одно соединение.
Традиционный вариант решения подобных задач - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) [1 - 14]. Появление отечественных систем капиллярного электрофореза., (системы «Капель» и «Нанофор»), позволяющих с высокой эффективностью анализировать биологические объекты, требуют разработки новых методик электрофоретического определения лекарственных препаратов.
Недостаточная селективность капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) может быть «скомпенсирована» использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), где в качестве псеедостацгюнарной фазы (мицелл) используют поверхностно-активные вещества. Метод МЭКХ обеспечивает определение соединений ионной и нейтральной природы. При этом необходимо преодолеть еще один барьер: низкую концентрационную чувствительность УФ-детектирования метода капиллярного электрофореза для снижения предела обнаружения.
Изучение отечественной и зарубежной литературы показало, что в таком аспекте (одновременный анализ стероидов экзо- и эндогенного происхождения) ранее задача не ставилась.
Аналитические методы, используемые для определения лекарственных соединений нестероидной природы, включают ВЭЖХ, капиллярный электрофорез (КЭ) и капиллярную электрохроматографию [8, 15 - 27], высокоэффективную тонкослойную (ВЭТСХ) [28] и газовую хроматографию (ГХ) [29].
Применение организованных сред (краун-соединепий, цикламов, циклодекстринов, мицелл) в составе подвижной фазы и буферного электролита позволяет увеличивать селективность энантиомерного разделения [6, 16, 25, 26].
Термин «организованные среды» широко используется в последние годы в области аналитической химии и является одним из основных понятий супрамолскулярнои химии - науки, в основе которой лежит образование комплексов типа «гость-хозяин» с участием невалентных взаимодействий (диполь-дипольные, ион-ионные и водородные связи) [30 -- 34]. В качестве «хозяина» могут выступать различные макроциклические агенты (циклодекстрины, краун-эфиры, криптанды) - жестко организованные системы. В свою очередь, примерами нежестких систем могут служить мицеллы поверхностно-активных веществ.
Используя хроматографические и электрофорстические методы с применением макроциклических агентов (МА) в составе рабочего буфера, возмолшо осуществить не только разделение лекарственных препаратов, но и определение их энантиомерной чистоты [1 - 4, 15 - 17].
В последнее время широко развивающимся направлением является применение циклодекстринов (ЦД) и краун-эфиров в методах разделения: ОФ ВЭЖХ [1 - 4, 35 - 39] и КЭ [15, 16, 19, 20, 25, 26]. Их используют для анализа природных объектов, ферромоиов, летучих компонентов ароматов [1], в качестве хиральных селекторов для энантиоселективного разделения оптически активных соединений [1 - 4, 15, 16, 19, 20, 25, 26, 40 - 43]. Производные полисахаридов (эфиры и карбаматы целлюлозы, карбаматы амилозы) достаточно широко используются в качестве хиральных стационарных фаз в ВЭЖХ [3, 9 - 11].
Цель работы: получить оценочные характеристики методов хроматографического и электрофоретического определения остаточных лекарственных препаратов в биологических жидкостях с использованием комплексообразующих агентов в составе подвижной фазы и рабочего буфера и различных вариантов on-line концентрирования.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
На модельных системах соединений, близких по химической структуре (природные и синтетические стероиды), установить закономерности их одновременного хроматографического (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ) и электрофоретического (КЗЭ и МЭКХ) определения.
Выявить влияние мицелл и комплексообразующих агентов (Р-цикл о декстрин (р-ЦД), сульфо-р-циклодекстрин, 4,13-диаза-18-краун-6, циклам) па эффективность и селективность разделения стероидов эндо- и экзогенной природы.
3. Предложить физико-химическую модель и основные количественные соотношения, описывающие процессы комштексообразования в системе комплексообразующий агент - лекарственный препарат.
Отработать процедуру пробоподготовки и выяснить возможности on-line концентрирования для снижения предела обнаружения.
Предложить схемы хроматографического и электрофоретического определения лекарств стероидной и нестероидной природы в реальных биологических объектах (моча, сыворотка крови).
На защиту выносятся следующие положения: і. Результаты исследования влияния органических растворителей (метанол, диметилсулвфоксид) и компонентов организованных сред (ПАВ - додецилсульфат натрия, р-циклодекстрии, сульфо-|3-циклодекстрин, 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан, 4,13-диаза-18-краун-6, мочевина) в качестве составляющих рабочего буфера, на эффективность и селективность электрофоретического и хроматографического разделения природных стероидных гормонов и синтетических стероидных лекарств в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).
Данные о влиянии добавок комплексообразующих агентов (р-циклодекстрин, сульф о-р-цикл о декстрин, 4,13~диаза-18-краун-6) в составе буферного электролита на электрофоретические характеристики нестероидных противовоспалительных средств.
Пробои одготовка биологических жидкостей (сыворотки крови и мочи) при определении кортикостероидов (преднизолои, дексаметазон, кортинефф, кортизон ацетат) и нестероидных противовоспалительных средств (аспирин, парацетамол) хроматографическими и электрофоретическими методами с использованием твердофазной и жидкостной экстракций.
Способы on-line концентрирования (стэкинг с обращеныо-мигрирующими мицеллами; стэкинг с усилением поля при вводе с обращенно-мигрирующими мицеллами; стэкинг с высокопроводящей матрицей; свипинг; сбипйнг с добавкой мочевины или |3-ЦД в матрицу пробы) для снижения предела обнаружения эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).
Обоснование возможностей и преимуществ классического и мицеллярного вариантов ВЭТСХ-разделения эндо- и экзогенных кортикостероидов, а также нестероидных противовоспалительных средств. 6. Практическое приложение выявленных закономерностей: - изучение особенностей стероидогенеза больных с компенсацией, декомпенсацией и передозировкой лекарственными препаратами; сопоставление возможностей и ограничений определения кортикостероидов в биологических жидкостях с использованием хроматографических и электрофоретических методов. * ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
1.1. Основные группы лекарственных препаратов
Проблема оценки химической и/или энантиомерной чистоты лекарственных средств, а также определения остаточных лекарственных препаратов в биологических объектах широко обсуждается в литературе [1 -8, 15 - 17, 22, 23, 26, 37, 44 - 49]. Биологически активные вещества присутствуют в организме в виде единственных энантйомериых форм, которые имеют различные токсикологические и фармакокинетические свойства [3].
При определении лекарственных препаратов методами КЭ и ВЭЖХ в биологических жидкостях (включая энантиомерное разделение) активно используют макроциклические агенты [1, 3,4 - 8].
В табл. 1.1 представлены основные группы лекарственных препаратов, содержание которых контролируется хроматографическими и 9 электрофоретическими методами.
Табл. 1 и 2 (см. Приложение) включают лекарственные препараты и условия их энантиомерного разделения методами КЭ и ВЭЖХ.
1.2. Общая характеристика биогенных и лекарственных кортикостероидов
Кора надпочечников млекопитающих и человека вырабатывает большое количество стероидных гормонов, которые называются кортикостероидами.
Они являются производными прегнана и по химическому строению могут быть разделены на 11-дезокси-, 11-гидрокси- и 11,17-гидрокси-стероиды (рис. 1.1).
Таблица 1.1. Основные группы лекарственных препаратов, определяемых методами КЭ и ВЭЖХ
Рис. 1.1. Общая структура стероидных гормонов
К первой группе относится 11 -дезоксикортикостерон, не имеющий гидроксильной группы в положении 11 стероидного ядра. К группе 11,17-гидроксистероидов относятся кортизол (гидрокортизон) и кортизон. Эти вещества выделены из коры надпочечников в кристаллическом виде.
Для применения в качестве лекарственных средств кортикостероиды получают в настоящее время синтетическим путем [50].
Эндогенные гормоны коры надпочечников необходимы для жизни человека и животных. Острая недостаточность надпочечников сопровождается сгущением крови, понижением артериального давления, желудочно-кишечными расстройствами, наблюдаются потеря ионов Na и задержка ионов К+, гипогликемия и т.д.
По влиянию на обмен веществ кортикостероиды делятся на две группы: ми нерало корти ко иды и глюкокортикоиды.
Главными представителями первой группы являются альдостерон и 11-дезоксикортикостерон. Эти гормоны оказывают воздействие на обмен электролитов и воды и относительно мало - на углеводный и белковый обмен.
Основными эндогенными (природными) глюкокортикостероидами являются кортизол и кортизон. Они менее активны в отношении водного и солевого обмена; способствуют накоплению гликогена в печени, повышают содержание глюкозы в крови; оказывают противовоспалительное и антиаллергическое действие.
кортизол (F) кортизон (Е) 11-дезоксикортикостерон (DOC)
холестерин дегндр оэпиандростерон прегненолон
17-гидроксипрегненолон
11-дезоксикортикостерон прогестерон 17-гидроксипрогестерон дегидроэпиандростерон сульфат
кортикостерон
И -дезоксикортиз о л андростендион холестерол сульфат альдостерон кортизон
Схема 1. Биосинтез стероидов
Из природных глюкокортикостероидов практическое применение в качестве лекарственных средств нашли синтетические препараты: кортизон, гидрокортизон (кортизол) и 11-дезоксикортикостерон.
Получен ряд синтетических аналогов кортизона и кортизола (преднизон, преднизолон, дексаметазон и др.), используемых при заместительной терапии. Эти соединения активнее природных глюкокортикостероидов и действуют в меньших дозах. Некоторые из них (главным образом, фторированные производные) более удобны для местного применения, так как меньше всасываются. В настоящее время синтетические аналоги почти полностью заменили кортизон.
Глюкокортикостероиды применяются при лечении болезни Аддисона, острой гормональной недостаточности коры надпочечников, гемолитической анемии и других заболеваниях. Их назначают для профилактики и лечения шока (посттравматического, операционного, токсического, ожогового и др.) [50].
Иммуноденрессивное действие глюкокортикостероидов позволяет использовать их при трансплантации органов и тканей для подавления реакций отторжения, а также при различных т.н. аутоиммунных заболеваниях.
Глюкокортикостероиды - важные терапевтические средства. Тем не менее они могут вызывать ряд побочных эффектов, в том числе симптомоколтлекс Иценко-Кушинга (задержка ионов натрия и воды в организме с появлением отеков, усиление выведения калия, повышение артериального давления), возмояшы нервные и психические нарушения. Некоторые побочные явления менее выражены при применении синтетических глюкокортикостероидов (дексаметазона и др.) вследствие их меньшего минералокортикоидного действия.
Кортизон ацетат (Cortisonum acetate).
Прегнен-4-гидрокси-17а-триона-3,11,20,21 -ацетат:
Синонимы: adreson, cortadren, cortelan, cortisate, cortisone acetate, cortistab, cortistal, cortisyl, cortone, rincorten и др.
Белый или белый со слабым желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, очень мало растворим в спирте. Гидрокортизон (Hydrocortisonum). 17- Гидроксикортикостерон:
По химическому строению гидрокортизон отличается от кортизона наличием гидроксильной группы при углеродном атоме в положении СП.
Синонимы гидрокортизона: гидрокорт, hydrocort, cobadex, cortef, Cortisol, hydrocortal, hydrocortone и др. По действию на организм гидрокортизон близок кортизону, но несколько более активен. Количество препарата при приеме внутрь и введении в мышцы составляет 2/3 дозы кортизона. Возможные побочные явления, меры предосторожности и противопоказания такие же, как для кортизона. Преншолон (Prednisolonum).
Прегнандиен-1,4-тригидрокси-11 р, 17а,21 -дион-3,20, или
Д'-дегидрокортизол:
Синонимы: aniisolon, codelcortone, cordex, dacortin, decorin H, dehydrocortisol, delta-Cortef, mecortolon, nisolone, prednisolone, prenolone, sterolone, idtracorten H я др.
Белый или белый со слабым желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, растворим в спирте. Преднизолон является дегидрированным аналогом гидрокортизона, Выпускавшийся ранее препарат преднизон исключен из номенклатуры лекарственных средств как относительно малоактивный. Дексаметазон (Dexamethasonum).
9а-Фтор-1113,17а,21 -триги дрокси-16а-метил-преша-1,4- диен-3,20-дион, или 9а-фтор-16а-метшшреднизолон:
Синонимы: даксин, дексазоп, дексафар, максидекс, amradexone, arcodexan, cortadex, deason, decacortin, decadin, decasterolone, dekacort, dexason, dexone, prednisolone F, resticort и др.
Белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, трудно растворим в спирте. Характерной особенностью химического строения дексаметазона является наличие в его молекуле атома фтора. По действию на организм он близок к другим гдюкокортикостероидам, но более активен, оказывает сильное противовоспалительное и антиаллергическое действие. Кортинефф (Fludrocortisone acetate).
9а-Фтор гидрокортизон:
Синонимы: флоринеф, alfanondrone, cortinef, florinef, fludronil и др.
По действию сходен с гидрокортизоном. Вызывает сильный противовоспалительный и антиаллергический эффект, вместе с тем обладает высокой минералокортикоидной активностью.
1. 3. Свойства нестероидных противовоспалительных средств (НПВС)
НПВС представляют собой обширную и разнообразную по химическому строению группу лекарственных средств, широко применяющуюся в клинической практике. Её изучение началось в первой половине прошлого столетия. В 1827 г. из коры ивы, жаропонижающее действие которой было известно с давних пор, был выделен гликозид салицин. Позднее из него получена салициловая кислота, а затем (1860 г.) осуществлен ее синтез. Синтез аспирина впервые был осуществлен немецким химиком Ш. Герхардом в 1853 г. ацетилированием салициловой кислоты уксусным ангидридом.. Ацетилсалициловая кислота мало
АСПИРИН растворима в воде и хорошо в спирте, эфире, хлороформе, сероуглероде. Является жаропонижающим и противовоспалительным средством, которое эффективно при лечении ревматизма, улучшает кровоток.
Салициловая кислота также принадлежит к числу противолихорадочных средств [51].
САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА
Антипирин ~ «родоначальник» многочисленного семейства пиразолонов, {ацетопирин, толипирин, везипирин и др.). Широкую известность получил салипирин [52].
Производное пирамидона — анальгин (метамизол натрия) — было
синтезировано в 1921 г. [51, 53]. Благодаря активному противовоспалительному действию, анальгин сразу стал широко доступным препаратом; в СССР его выпуск был налажен в 1938 г., однако уже к 1970 г. выявлены серьезные побочные эффекты анальгина, прежде всего агранулоцитоз, что привело к резкому ограничению его
АНАЛЬГИН применения.
В подгруппу фенитидинов входят фенацетин и парацетамол. В Британской фармакопее ацетаминофен известен как парацетамол [52].
Большинство представителей группы НҐ1ВС относится к кислотным противовоспалительным ПАРАЦЕТАМОЛ препаратам.
За последние 30 лет количество НВПС значительно возросло и включает соединения, отличающиеся но химической структуре, особенностям действия и применению (табл. 1.2).
1. 4, Макроциклические агенты, используемые в хроматографии и капиллярном электрофорезе при определении лекарственных препаратов
1. 4.1. Циклодекстрины
Циклодекстрины - первые макроциклы, для которых была обнаружена и детально исследована способность к образованию комплексов включения с органическими молекулами [1 - 4, 15, 16, 19,20, 25,26,29],
Таблица 1.2. Классификация нестероидных противовоспалительных средств * Примечание: в скобках даны коммерческие названия лекарственных средств.
Возможность получения подобных ассоциатов зависит от пространственных факторов, гидрофобных и специфических взаимодействий, сольватационных эффектов. Необычные свойства р-ЦД определяются уникальной структурой: его молекула имеет форму усеченного конуса, внутренняя полость которого гидрофобна. Расположенные вне этой полости гидроксильные группы обеспечивают гидрофильные взаимодействия с аналитами. Распознавание основано на включении объемных гидрофобных групп определяемых веществ в полость циюіодекстрина и взаимодействии с внешними гидроксильными группами, в первую очередь, с участием водородных связей.
Циклодекстрины, являясь неионными циклическими хиральными соединениями, построены из остатков В(+)-глюкопиранозы, каждая из которых находится в конформации "кресло".
В табл. 1.3. представлены свойства а-, р\ и у-циклодекстринов.
Таблица 1.3. Характеристики циклодекстринов
Молекулы [3-циклодекстрина (рис. 1.2) состоят из 7 остатков глюкозы. Молекулы "гостя" могут образовывать диастереоизомерные комплексы с этим хиральным макроциклом [1, 40 - 42].
Рис. 1.2. Структура (3-циклодекстрина |3-ЦД имеет 14 вторичных и 7 первичных групп ОН и пригоден для разделения оптических изомеров, широкого спектра диастереоизомеров, структурных и геометрических изомеров, а также стероидных эпимеров. Циклодекстрины обычно получают при расщеплении крахмала с помощью фермента амилазы либо при его многократном замораживании и оггаивании - криолизе [43]. В табл. 1.4. представлена растворимость a-, J3-, и у-циклодекстринов в воде.
Неполярные лекарственные препараты становятся растворимыми в воде за счет их включения в полость циклодекстринов [54, 55]. Гидроксильные группы макроциклов могут быть замещены, что сказывается на изменении растворимости ЦД в воде и в других растворителях [2].
Таблица 1.4. Растворимость в воде в г/100 мл
Производные циклодекстринов (заряженные и цвиттерионные) широко используются в капиллярном электрофорезе (КЭ) для хирального разделения (табл. 1.5)[15]
Таблица 1.5. Типы циклодекстринов
Полость ЦЦ гидрофобна, а расположенные вне этой полости гидроксильные группы обеспечивают гидрофильные взаимодействия с разделяемыми компонентами [18].
Использование циклодекстршов (ЦП) в хроматографии и капиллярном электрофорезе
Циклодекстрины могут быть компонентами хроматографических и электрофоретических систем. Для ЦД-содержащих стационарных фаз основной вклад в удерживание обусловлен образованием комплексов включения. Такие фазы, используемые в ВЭЖХ, совместимы с высокополярными элюентами, например, водным раствором метанола; ЦД-модифицированные сорбенты используются также и в газовой хроматографии [29]. Образование диастереоизомеров предполагает энергетические различия, между ними, что позволяет осуществить энантио дискриминацию. Непосредствепное разделение энантиомеров может быть достигнуто взаимодействием их с хиральным селектором, входящим в состав неподвижной хиральной фазы или независимо введенным в подвижную фазу (рис. 1.3).
Рис. 1.3. Взаимодействие лекарственного препарата тримипрамина с у-циклодекстрином [16]
Модифицированные ЦД могут проявлять свойства, отличные от свойств обычных ЦД, и успешно использоваться для увеличения селективности энантиомерного разделения [16, 18, 20, 25, 26]. Заряженные/незаряженные заместители в молекуле ЦД могут существенно повлиять на оптимизацию условий разделения в КЭ. Так, незаряженные энантиомеры мигрируют к детектору подобно ионным аналитам благодаря образованию комплексов включения с модифицированными ЦД.
1.4.1.1. Комплексообразование циклодекстринов со стероидными гормонами
Первая работа по изучению взаимодействия стероидов с различными циклодекстринами была опубликована в 1982 г. [2]. Было показано, что более прочные комплексы ЦД образуют с более гидрофобными стероидами, причем комплексообразование происходит главным образом по А - В кольцам стероида (рис. 1,1).
Позднее, в 1989 г. Shimada [2] установил, что стабильность образованных комплексов может быть связана и с наличием заместителя при третьем углеродном атоме. Константы комплексообразования стероидов увеличиваются в ряду 3~р-ОН > 3-а-ОН > 3-оксо.
В [2] описан процесс комплексообразования в системе ЦД-стероидный гормон, где на одну молекулу стероида приходится две -комплексообразующего агента. Такая система может иметь место, когда концентрация макроцикла по отношению к стероиду высока. Авторы предположили, что в данном случае С и D кольца стероида включаются в структуру первой молекулы Рщиклодекстрина, а А и В - во вторую.
Большинство работ по взаимодействию стероидов с комплексообразующими агентами посвящено характеристикам получающихся комплексов включения ЦД со стероидными лекарственными препаратами [1, 2, 4, 42]. Факторы удерживания последних уменьшаются при добавлении ЦД в подвижную фазу. Комплексообразование увеличивает растворимость аналитов в элюенте и, таким образом, уменьшает время их пребывания в хроматографической колонке. В связи с тем, что размер полости р-ЦД и его производных недостаточно велик (размер молекулы типичного стероида ~ 12 А, а диаметр полости р-ЦД ~ 6.5 А), силы взаимодействия с объемными молекулами стероидов незначительны.
Нейтральные субстраты имеют более высокие константы устойчивости с обычными циклодекстринами, чем их заряженные аналоги [56].
В [2] рассматривается влияние заместителей в молекулах стероидов на процесс комплексообразования. Установлено, что заместители при 11- и 17-углеродных атомах молекул стероидов участвуют в комплексообразовании, а функциональная группа при 11-углеродном атоме влияет на стабильность комплекса и его стехиометрию. Присутствие в молекуле стероида гидроксильной группы рядом с 11-углеродным атомом (как в случае преднизолона) способствует образованию прочного комплекса состава 1:1с Р-ЦД, в то время как карбонильная группа в этом положении (молекула преднизона) приводит к образованию комплекса того же состава, но менее прочного. HOHjC
преднизолон преднизон
При увеличении содержания ацетонитрила в подвижной фазе, растворимость р-цикло декстрина возрастает, а величина констант комплексообразования в системе макроцикл-аналит уменьшается. Факторы удерживания соединений увеличиваются при уменьшении температуры, как и следовало ожидать для типичной обращенно-фазовой системы [57].
Более высокие константы комплексообразования получены для у-циклодекстрина, что связано с большим диаметром внутренней полости этого макроцикла по сравнению с р-циклодекстрином.
1.4.2, Глюкопептидные антибиотики в качестве стационарной фазы в капиллярной электрохроматографии (КЭХ)
Наряду с множеством хиральных селекторов, традиционно используемых в КЭХ, появились сообщения и о группе глюкопептидных антибиотиков, имеющих высокую способность к энантиомерному разделению большого числа основных (ванкомицин и текопланин) и кислотных соединений (антибиотик Hepta-Tyr) [22, 23, 27].
Стационарная фаза на основе ванкомицина впервые была использована в 2000 г. при разделении некоторых основных соединений методом КЭ [27]. Позднее на этой же фазе проведено энантиомерное разделение кислотных соединений [22]. Наилучшие результаты получены при рН 2,5 - 3,5 (формиат аммония 5 мМ и 90 % ацето нитрил а). В этих условиях были разделены энантиомеры нестероидных противовоспалительных препаратов (кетопрофен, индопрофен, супрофен и др.).
Рис. 1.4. Структура антибиотика Hepta-Tyr [22]
Проведена серия опытов по хиральному разделению кислотных нестероидных противовоспалительных препаратов с использованием капиллярной колонки, содержащей в качестве неподвюкной фазы антибиотик Hepta-Tyr (рис. 1.4). Факторы разделения энантиомеров оказались выше, чем в случае стационарной фазы на основе ванкомицина [22].
1. 4. 3. Резорцинарен
Резорцинарен применяется для энантиомерного разделения нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов в ВЭЖХ и ГХ [29]. В газовой хроматографии этот селектор прививают к поли(гидроксиметил)диметилсилоксану (рис. 1.5).
Рис. 1,5. Структура резорцинарена, привитого к стационарной фазе. Данный хиральный селектор позволяет разделять энантиомеры этиловых эфиров ]^(0)-трифторацетил-дх-аминокислот методом ГХ [29].
1. 4. 4. Иммобилизованные белки
В 1973 г. впервые были разделены энантиомеры дх-триптофана методом ВЭЖХ при использовании бычьего альбумина сыворотки крови на агарознои подложке. Благодаря высокой энантиомерной селективности белки широко используются в качестве иммобилизованных хиральных селекторов (ИХС) (табл. 1.6).
Стационарные фазы с иммобилизованными белками активно используются в ВЭЖХ для прямого разделения энантиомеров лекарственных препаратов без предварительной стадии дериватизации.
Таблица 1.6. Белки, используемые в качестве хиральных селекторов в
ВЭЖХ и КЭ [8]
Высокая энантиосел активность в данном случае объясняется внутримолекулярными взаимодействиями между хиральным соединением и поверхностью белка.
Некоторые из этих стационарных фаз позволяют одновременно разделять основные, нейтральные и кислотные лекарственные препараты, в то время как другие - пригодны для разделения лишь конкретного типа аналита [8].
Установлено, что при анализе [3-блокаторов (например, пропранолола) наилучшим хиральным селектором является целлобиогидролаза (СВН I),
В КЭ хиральное разделение осуществляется также путем добавления белков в буферный электролит. Такой метод, называемый аффинной электрокинетической хроматографией. Он используется для разделения хиральных лекарственных препаратов. В некоторых случаях белки иммобилизуют непосредственно на стенки капилляра (капиллярный аффинный гель-электрофорез). В виде геля обычно наносят бычий альбумин (для разделения триптофана, лсуковорина, бензодиазепинов), авидин (для разделения кетопрофена, ибупрофена, флурбипрофена) [8].
1. 4. 5. Циклами
Цикламы - 14-членные тетрааминные макроциклы, которые образуют прочные связи с большим числом ионов металлов. Интерес вызывают клинические испытания бициклама при лечении СПИДа и образование аддуктов макроциклических агентов с радионуклидами Тс и Си для диагностики и терапии [58].
N ""> N
"N
3: R = Н, 2: -СН3, 3: -СН2СООН, 4: -СН2СН2ОН, 5: -СН2(СН2)2ОН? 6: -СН2Р03Н2, 7:-СН2Р(0)(С6Н5)ОН
Циклам (1) (1,4,8,11 -тетраазациклотетрадекан) - один из наиболее используемых макроциклических полиаминов. Он способен образовывать комплексы с различными катионами металлов. Широко распространены производные циклама 2-7.
Селективное связывание циклонами катионов металлов (Си +, N1 +, Со ж др.) привело к тому, что они стали использоваться как переносчики молекул и ионов в биологических системах, в качестве металлических катализаторов и имитаторов металлоэнзимов, агентов, расщепляющих эфиры фосфатов, содержащихся в ДНК и РЫК, а также - анти-ВЙЧ агентов.
Высокоселективными ингибиторами ВИЧ являются бицикламы - новый класс азотистых макроциклов [58]. В капиллярной электрохроматографии циклами используются в качестве дополнения к і щклодекстрин-содержащей стационарной фазе для энантиомерного разделения лекарственных препаратов, причем в этом случае достигается лучшее разделение, чем с краун-эфирами [23,59].
1. 4. 6. Использование крауи-эфиров для разделения лекарственных препаратов
Краун-эфиры представляют собой макроциклические соединения, в которых атомы кислорода связаны этиленовыми мостиками. Если один или несколько атомов кислорода заменены на атомы азота, соответствующие соединения называют аза-краун-эфирами [60 - 64]. о.0 о
О СГ >о о н 18-крауи-б 4,13-диаза-18-краун-6
В отличие от ЦД полости краун-эфиров гидрофильны, поэтому роль гидрофобных взаимодействий становится существенно меньше, уступая место ион-ионным, диполь-дипольным взаимодействиям и образованию водородных связей [59, 61, 62]. Описана методика энантиомерного разделения первичных аминосоединении в кислой среде, где в качестве макроциклического комплексообразующего агента используется хиральный краун-эфир - ((+)-18-краун-6 тетракарбоновая кислота) [65].
Имеются сообщения о добавлении краун-эфиров к системе, содержащей циклодекстрин, что позволяет осуществлять более эффективное энантиомерное разделение лекарственных препаратов [15, 66].
Таким образом, циклодекстрины применяют при хроматографическом разделении некоторых стероидных гормонов, в то время как цикламы и краун-эфиры - при электрофоретическом. определении катионов металлов и органических соединений с протонированными аминогруппами. При этом остается неясным, как введение этих агентов могло бы повлиять на одновременное разделение эндо- и экзогенных стероидов, а также нестероидных лекарственных препаратов при их электрофоретическом определении.
1. 5. Методы определения кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в биологических жидкостях
I. 5.1. Иммунологические методы анализа
До недавнего времени для количественного анализа кортикостероидов в основном применяли такие высокоспецифичные и чувствительные методы, как радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный анализы (ИФА) [50, 67 -70]. Они позволяют проводить определение стероидных гормонов на уровне пикограмм. В основе метода - специфическая реакция антиген-антитело, осуществляемая по принципу молекулярного распознавания [67 - 69].
Используется несколько вариантов иммунологического определения стероидных гормонов: иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунологический (РИА), флюоро- и хемилюминесцентный.
Реализуется следующая схема:
1. Антисыворотку к определяемому гормону смешивают с раствором меченого гормона, определенной концентрации, в результате чего образуется комплекс: ґ* Аг" + Ат 4 * Аг*Ат, где Аг - меченый гормон, Ат - антисыворотка.
Вытеснение меченого стероида тождественным ему не меченным: Аг*Ат + Аг » АгАт + Аг*
Установление равновесия между различными формами аналита.
Разделение свободных и связанных форм определяемого стероида.
5. Расчет количества аналита в пробе с использованием калибровочного графика.
После осаждения комплексы антиген-антитело отделяют и в осадке определяют концентрацию метки. В случае имму но ферментного анализа регистрируют активность фермента, которым был помечен гормон. При этом, чем ниже концентрация определяемого вещества в пробе, тем выше концентрация метки в осадке. Происходит как бы "обращение" порога обнаружения. Это делает иммунологические методы очень чувствительными т (- пг/мл).
Однако они имеют и ряд недостатков: можно определить лишь ограниченное количество стероидных гормонов (кортизол, тестостерон, дегидроэпиандростерон, А -андростен-дион, альдостерон); селективность реакции антитела с конкретным стероидом не абсолютна: в присутствии гормонов, имеющих близкое строение, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции. Таким образом, результаты анализа при радиоиммунологическом определении часто завышены [68 -70]. Пример перекрестных реакций представлен в табл. 1.7 .
В связи с этим изучение особенностей стероидогенеза и метаболизма кортикостероидов с помощью хроматографических методов представляется особенно актуальным [4, 35 - 39,71 - 79].
Табл. 1.7. _ Перекрестная реакция антител к тестостерону с другими стероидами [68]
1. 5.1.1. Совместное использование методов капиллярного электрофореза и иммунологического исследования для определения стероидных гормонов
Для некоторых лекарственных препаратов концентрация в образце ниже предела их обнаружения в КЭ и ВЭЖХ. В связи с этим предложено для увеличения чувствительности детектирования объединять иммунологические методы и КЭ [80, 81].
В [81] обсуждаются возможности одновременного электрофоретического разделения комплексов антиген-антитело, антитела и свободного антигена. Так, приготовленный конъюгат «лекарство-флуоресцентиая метка» смешивается с антителом и неизвестным образцом сыворотки крови или мочи. После завершения реакции свободная форма лекарственного препарата отделяется от связанной методом КЭ.
1. 5. 2. Газохроматографическое определение кортикостероидов
Первая работа, посвященная ГХ-определению стероидов, была опубликована в 1960 г., в которой обсуждалась возможность разделения смеси стероидов на неподвижной фазе SE-30 [82]. Позднее были разработаны методы разделения этих веществ и их количественное определение с различными вариантами дериватизации. В этот же период ГХ нашла применение как перспективный метод контроля за функциональным состоянием надпочечников. Для разделения стероидных гормонов [83] и их производных [82, 84 - 88] использовались стеклянные и металлические насадочные колонки [82]. Неподвижная фаза наносилась на специально подготовленный белый диатомитовый носитель. Наибольшее применение нашли силоксаны (обычно диметилсилоксаны):
Н-яС
Лучшими разделяющими свойствами обладают капиллярные колонки (~17-30 метров) [83, 85]. ГХ-определеиию подвергаются стероидные гормоны после дериватизации. В клинической диагностике в основном применяют метокситриметилсилильные производные (МО-ТМС) [82 - 86]. Выбор производного определяется методом детектирования.
Детектор электронного захвата (ДЭЗ) селективен на галогепосодержащне вещества, фотопламенный - на фосфорорганические [89]. Это позволило снизить предел обнаружения до нескольких десятков пикограмм, что крайне важно в биоклиыическом анализе. В современных исследованиях для анализа кортикостероидов обычно применяют хромато-масс-спектрометрические методы [82,83,85, 87,88].
1. 5. 2.1. Дериватизация стероидов
Недостатком газовой хроматографии при определении стероидов является то, что они термичесіси нестабильны, и поэтому требуется дополнительная трудоемкая стадия получения производных. Предварительную дериватизацию (бисметилендиоксипентафторпропиоиат-ные [12], триметилсюшльные производные, метилоксимтриметилсилильные эфиры [84, 90 - 92], производные гептафтормасляной кислоты [84]) осуществляют для увеличения летучести и термической стабильности аналитов.
Самый распространенный метод дериватизации стероидов триметилсилилирование гидроксильиых групп:
0~SiMe3 Me.SiX где X = -CI ТМХС - триметилхлорсшіан, -NHSiMc3 ГМДС- (гексамстилдисилазан) Me I -0-C=N-SiMe3 БСА - Ы.О-бис-(триметилсилил)ацетаммд Y\ ^=/ ТМСИМ (тримстилсилилимидазол) -NEt2 ТМСДЭА М-(триметилсилил)дютюіамин -N-C-CF3 МС'ГФА (Ы-Метил-К-триметилсилилтрифторацетамид) I II СН30 -"Ч=С-СЬ\ БС'ГФА (К,0-бис-(триметилсилил)трифторацетамид)
0-Si(CH3)
Стероиды, содержащие З^-ОН группу, легко силилируют N,0-6hc- (триметилсилил)ацетамидом или М,0-бис-(триметилеилил)трифтор- ацетамидом, содержащими 1 % триметилхлорсилана [91].
Проведение дериватизации ОН-групп в положениях 11(3- и 17а-стерически затруднено. В этом случае используют более сильный агент -триметилсилилимидазол (ТМСИМ). MeSI-OH,C
МСТФА,ТМСИМ
Описано получение производных ряда кортикостероидов по 17а-гидроксильной группе с участием смеси >Т-Метил-К- триметилсилилтрифторацетамид - триметилйодсилан - 1,4-дитиоэритриол [91].
Другой вид дериватизации гидроксигрупп стероидов для последующего ГХ-анализа ~ реакция ацетилирования [84]. Нашли применение трифторацетаты, отличающиеся высокой летучестью. Из многочисленных производных предпочтение обычно отдают гептафторбутиратам:
F7C3- (C3F7CO)20
,CH2OCOC3F7
1. 5. 3. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в медико-биологических исследованиях
ВЭЖХ является основным методом разделения аналитов в медико-биологических и фармацевтических исследованиях [14, 35 - 39, 45, 46, 72 -79,93-103].
Ранее в качестве сорбента в ВЭЖХ широко применялся немодифицированный силикагель. Элюентами служили смеси растворителей: хлороформ:метанол; хлороформ:этанол:вода; дихлорметан: метанол; н -гексан: изо пропило вый спирт [13, 94].
В настоящее время применяются сорбенты с привитыми октадецилсшшльными или диольными труппами (рис. 1.6), обеспечивающие наилучшее разделение стероидов [94]. Диольные фазьт предпочтительнее при определении малополярных стероидов.
Использование градиентного режима элюирования [45, 46, 93, 94, 96, 100, 101, 104] значительно сокращает время анализа, однако, при этом возникает проблема точного воспроизведения параметров удерживания.
д_ zo ЗО 40
Рис. 1.6. Хроматограмма стероидных гормонов. ] - прогестерон, 2 - андростеыдион, 3 - преднизолоп, 4 - тестостерон. 5 - 11-дезокси-кортикостерон, 6 - 17-гидроксипрогестерон. 7 - 17-ГИДрОКСШЇрЄДЇШЗОЛОН, 8-11 -дєзоксіь кортизол, 9 - 18-гидрокси-1 ]-дезоксикортикостерон, 10 - кортикостерои, 11 - альдостерон. 12-кортизол, 13- 18-гидроксикортикостерон.
Условия анализа: колонка с паривитыми диольными группами, элюент: н-гексан - изопропиловыи спирт (40:60, по объему), УФ-детектирование (А.= 254нм).
Имеется немало работ по использованию хиральных стационарных фаз [9-11, 22, 59]. Обычно при определении лекарственных препаратов и их метаболитов в качестве детекторов используются ультрафиолетовый [1, 4, 45, 93 - 96], флуориметрический [94] и масс-спектрометрический (электроспрей [6, 7, 46, 100, 101, 104], термоспрей [94, 102] и химическая ионизация [103, 105]).
Имеются сообщения об определении нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) в биологических объектах с использованием сложных элюирующих систем [106, 107]. Так, для определения препарата кеторолак оптимальной является подвижная фаза вод а: ацето нитрил :дибутил амин фосфат (рН 2,5) (30:20:1, объемы.); предел детектирования кеторолака составил 0,05 мкг/мл [106], а для мелоксикама ~ 0,029 мкг/мл [107].
СИ О 5--
КЕТОРОЛАК
МЕЛОКСИКАМ
В [108] изучено влияние концентраций метанола, ацетонитрила, природы буферного раствора и рН на параметры удерживания двух нестероидных противовоспалительных препаратов - нимесулида и ибупрофена. Линейный диапазон концентраций составил 0,5 -100 мкг/мл.
В качестве модификаторов подвижной фазы чаще всего используют поверхностно-активные вещества и соли [109].
Имеется большое число публикаций по В ЭЖХ-олределению различных классов антибиотиков и пестицидов в объектах окружающей среды, например, в питьевой воде [110 - 113].
Добавки мицеллярных растворов поверхностно-активных веществ (ПАВ) в подвижную фазу способны увеличивать разделение близких по химической структуре антибиотиков [114 - 116]. Простой и чувствительный, метод мицеллярной ОФ ВЭЖХ, позволяет проводить оценку чистоты фармакологических препаратов.
1. 5. 4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) для определения лекарственных препаратов
Тонкослойная хроматография (ТСХ) (планарная) - один из вариантов хроматографических методов, основанных на избирательном распределении компонентов анализируемой смеси между двумя несмешивающимися фазами.
Современная высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ), как правило, не уступает другим хроматографическим методам по точности и воспроизводимости.
Основные характеристики ВЭТСХ: доступность и относительная дешевизна оборудования; малое время проведения анализа; возможность одновременного анализа нескольких образцов; легкая и быстрая смена растворителей, что является необходимым условием при оптимизации разделения; возможность идентификации и количественного покомпонентного состава анализируемого объекта; возможность сохранения хроматограммы с разделенными образцами и последующим их детектированием [28].
Количественное определение кортикостероидов в ТСХ проводят после их десорбции методами колориметрии [28, 69, 117], флуориметрии [28, 117], масс-спектрометрии [118], газовой [118] и жидкостной хроматографии [37].
В [37] предложен вариант аналитического контроля содержания салициловой кислоты (СК) в таблетках аспирина (АСК), выпускаемого различными фирмами с использованием метода ТСХ. В качестве подвижной фазы использовался раствор циклогексан:пропанол-2:хлороформ:уксусная кислота (6:0,5:0,5:1, по объему).
Параметры удерживания в ТСХ, эффективном и селективность
Общая характеристика биогенных и лекарственных кортикостероидов
Кора надпочечников млекопитающих и человека вырабатывает большое количество стероидных гормонов, которые называются кортикостероидами. Они являются производными прегнана и по химическому строению могут быть разделены на 11-дезокси-, 11-гидрокси- и 11,17-гидрокси-стероиды (рис. 1.1). К первой группе относится 11 -дезоксикортикостерон, не имеющий гидроксильной группы в положении 11 стероидного ядра. К группе 11,17-гидроксистероидов относятся кортизол (гидрокортизон) и кортизон. Эти вещества выделены из коры надпочечников в кристаллическом виде. Для применения в качестве лекарственных средств кортикостероиды получают в настоящее время синтетическим путем [50]. Эндогенные гормоны коры надпочечников необходимы для жизни человека и животных. Острая недостаточность надпочечников сопровождается сгущением крови, понижением артериального давления, желудочно-кишечными расстройствами, наблюдаются потеря ионов Na и задержка ионов К+, гипогликемия и т.д. По влиянию на обмен веществ кортикостероиды делятся на две группы: ми нерало корти ко иды и глюкокортикоиды. Главными представителями первой группы являются альдостерон и 11-дезоксикортикостерон. Эти гормоны оказывают воздействие на обмен электролитов и воды и относительно мало - на углеводный и белковый обмен. Основными эндогенными (природными) глюкокортикостероидами являются кортизол и кортизон. Они менее активны в отношении водного и солевого обмена; способствуют накоплению гликогена в печени, повышают содержание глюкозы в крови; оказывают противовоспалительное и антиаллергическое действие. Из природных глюкокортикостероидов практическое применение в качестве лекарственных средств нашли синтетические препараты: кортизон, гидрокортизон (кортизол) и 11-дезоксикортикостерон. Получен ряд синтетических аналогов кортизона и кортизола (преднизон, преднизолон, дексаметазон и др.), используемых при заместительной терапии. Эти соединения активнее природных глюкокортикостероидов и действуют в меньших дозах. Некоторые из них (главным образом, фторированные производные) более удобны для местного применения, так как меньше всасываются. В настоящее время синтетические аналоги почти полностью заменили кортизон. Глюкокортикостероиды применяются при лечении болезни Аддисона, острой гормональной недостаточности коры надпочечников, гемолитической анемии и других заболеваниях. Их назначают для профилактики и лечения шока (посттравматического, операционного, токсического, ожогового и др.) [50].
Иммуноденрессивное действие глюкокортикостероидов позволяет использовать их при трансплантации органов и тканей для подавления реакций отторжения, а также при различных т.н. аутоиммунных заболеваниях. Глюкокортикостероиды - важные терапевтические средства. Тем не менее они могут вызывать ряд побочных эффектов, в том числе симптомоколтлекс Иценко-Кушинга (задержка ионов натрия и воды в организме с появлением отеков, усиление выведения калия, повышение артериального давления), возмояшы нервные и психические нарушения. Некоторые побочные явления менее выражены при применении синтетических глюкокортикостероидов (дексаметазона и др.) вследствие их меньшего минералокортикоидного действия. По химическому строению гидрокортизон отличается от кортизона наличием гидроксильной группы при углеродном атоме в положении СП. Синонимы гидрокортизона: гидрокорт, hydrocort, cobadex, cortef, Cortisol, hydrocortal, hydrocortone и др. По действию на организм гидрокортизон близок кортизону, но несколько более активен. Количество препарата при приеме внутрь и введении в мышцы составляет 2/3 дозы кортизона. Возможные побочные явления, меры предосторожности и противопоказания такие же, как для кортизона. Преншолон (Prednisolonum). Синонимы: aniisolon, codelcortone, cordex, dacortin, decorin H, dehydrocortisol, delta-Cortef, mecortolon, nisolone, prednisolone, prenolone, sterolone, idtracorten H я др. Белый или белый со слабым желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, растворим в спирте. Преднизолон является дегидрированным аналогом гидрокортизона, Выпускавшийся ранее препарат преднизон исключен из номенклатуры лекарственных средств как относительно малоактивный. Дексаметазон (Dexamethasonum). Синонимы: даксин, дексазоп, дексафар, максидекс, amradexone, arcodexan, cortadex, deason, decacortin, decadin, decasterolone, dekacort, dexason, dexone, prednisolone F, resticort и др. Белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в воде, трудно растворим в спирте. Характерной особенностью химического строения дексаметазона является наличие в его молекуле атома фтора. По действию на организм он близок к другим гдюкокортикостероидам, но более активен, оказывает сильное противовоспалительное и антиаллергическое действие. Кортинефф (Fludrocortisone acetate). Синонимы: флоринеф, alfanondrone, cortinef, florinef, fludronil и др.
По действию сходен с гидрокортизоном. Вызывает сильный противовоспалительный и антиаллергический эффект, вместе с тем обладает высокой минералокортикоидной активностью. 1. 3. Свойства нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) НПВС представляют собой обширную и разнообразную по химическому строению группу лекарственных средств, широко применяющуюся в клинической практике. Её изучение началось в первой половине прошлого столетия. В 1827 г. из коры ивы, жаропонижающее действие которой было известно с давних пор, был выделен гликозид салицин. Позднее из него получена салициловая кислота, а затем (1860 г.) осуществлен ее синтез. Синтез аспирина впервые был Возможность получения подобных ассоциатов зависит от пространственных факторов, гидрофобных и специфических взаимодействий, сольватационных эффектов. Необычные свойства р-ЦД определяются уникальной структурой: его молекула имеет форму усеченного конуса, внутренняя полость которого гидрофобна. Расположенные вне этой полости гидроксильные группы обеспечивают гидрофильные взаимодействия с аналитами. Распознавание основано на включении объемных гидрофобных групп определяемых веществ в полость циюіодекстрина и взаимодействии с внешними гидроксильными группами, в первую очередь, с участием водородных связей. Циклодекстрины, являясь неионными циклическими хиральными соединениями, построены из остатков В(+)-глюкопиранозы, каждая из которых находится в конформации "кресло".3-ЦД имеет 14 вторичных и 7 первичных групп ОН и пригоден для разделения оптических изомеров, широкого спектра диастереоизомеров, структурных и геометрических изомеров, а также стероидных эпимеров. Циклодекстрины обычно получают при расщеплении крахмала с помощью фермента амилазы либо при его многократном замораживании и оггаивании - криолизе [43]. В табл. 1.4. представлена растворимость a-, J3-, и у-циклодекстринов в воде. Неполярные лекарственные препараты становятся растворимыми в воде за счет их включения в полость циклодекстринов [54, 55]. Гидроксильные группы макроциклов могут быть замещены, что сказывается на изменении растворимости ЦД в воде и в других растворителях [2]. Циклодекстрины могут быть компонентами хроматографических и электрофоретических систем. Для ЦД-содержащих стационарных фаз основной вклад в удерживание обусловлен образованием комплексов включения. Такие фазы, используемые в ВЭЖХ, совместимы с высокополярными элюентами, например, водным раствором метанола; ЦД-модифицированные сорбенты используются также и в газовой хроматографии [29]. Образование диастереоизомеров предполагает энергетические различия, между ними, что позволяет осуществить энантио дискриминацию. Непосредствепное разделение энантиомеров может быть достигнуто взаимодействием их с хиральным селектором, входящим в состав неподвижной хиральной фазы или независимо введенным в подвижную фазу (рис. 1.3).
Методы определения кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в биологических жидкостях
До недавнего времени для количественного анализа кортикостероидов в основном применяли такие высокоспецифичные и чувствительные методы, как радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный анализы (ИФА) [50, 67 -70]. Они позволяют проводить определение стероидных гормонов на уровне пикограмм. В основе метода - специфическая реакция антиген-антитело, осуществляемая по принципу молекулярного распознавания [67 - 69]. Используется несколько вариантов иммунологического определения стероидных гормонов: иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунологический (РИА), флюоро- и хемилюминесцентный. Реализуется следующая схема: 1. Антисыворотку к определяемому гормону смешивают с раствором меченого гормона, определенной концентрации, в результате чего образуется комплекс: ґ Аг" + Ат 4 Аг Ат, где Аг - меченый гормон, Ат - антисыворотка. 2. Вытеснение меченого стероида тождественным ему не меченным: Аг Ат + Аг » АгАт + Аг 3. Установление равновесия между различными формами аналита. 4. Разделение свободных и связанных форм определяемого стероида. 5. Расчет количества аналита в пробе с использованием калибровочного графика. После осаждения комплексы антиген-антитело отделяют и в осадке определяют концентрацию метки. В случае имму но ферментного анализа регистрируют активность фермента, которым был помечен гормон. При этом, чем ниже концентрация определяемого вещества в пробе, тем выше концентрация метки в осадке. Происходит как бы "обращение" порога обнаружения. Это делает иммунологические методы очень чувствительными т (- пг/мл). Однако они имеют и ряд недостатков: - можно определить лишь ограниченное количество стероидных гормонов (кортизол, тестостерон, дегидроэпиандростерон, А -андростен-дион, альдостерон); - селективность реакции антитела с конкретным стероидом не абсолютна: в присутствии гормонов, имеющих близкое строение, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции. Таким образом, результаты анализа при радиоиммунологическом определении часто завышены [68 -70]. Пример перекрестных реакций представлен в табл. 1.7 . В связи с этим изучение особенностей стероидогенеза и метаболизма кортикостероидов с помощью хроматографических методов представляется особенно актуальным [4, 35 - 39,71 - 79]. Для некоторых лекарственных препаратов концентрация в образце ниже предела их обнаружения в КЭ и ВЭЖХ. В связи с этим предложено для увеличения чувствительности детектирования объединять иммунологические методы и КЭ [80, 81]. В [81] обсуждаются возможности одновременного электрофоретического разделения комплексов антиген-антитело, антитела и свободного антигена. Так, приготовленный конъюгат «лекарство-флуоресцентиая метка» смешивается с антителом и неизвестным образцом сыворотки крови или мочи.
После завершения реакции свободная форма лекарственного препарата отделяется от связанной методом КЭ. 1. 5. 2. Газохроматографическое определение кортикостероидов Первая работа, посвященная ГХ-определению стероидов, была опубликована в 1960 г., в которой обсуждалась возможность разделения смеси стероидов на неподвижной фазе SE-30 [82]. Позднее были разработаны методы разделения этих веществ и их количественное определение с различными вариантами дериватизации. В этот же период ГХ нашла применение как перспективный метод контроля за функциональным состоянием надпочечников. Для разделения стероидных гормонов [83] и их производных [82, 84 - 88] использовались стеклянные и металлические насадочные колонки [82]. Неподвижная фаза наносилась на специально подготовленный белый диатомитовый носитель. Наибольшее применение нашли силоксаны (обычно диметилсилоксаны): Лучшими разделяющими свойствами обладают капиллярные колонки ( 17-30 метров) [83, 85]. ГХ-определеиию подвергаются стероидные гормоны после дериватизации. В клинической диагностике в основном применяют метокситриметилсилильные производные (МО-ТМС) [82 - 86]. Выбор производного определяется методом детектирования. Детектор электронного захвата (ДЭЗ) селективен на галогепосодержащне вещества, фотопламенный - на фосфорорганические [89]. Это позволило снизить предел обнаружения до нескольких десятков пикограмм, что крайне важно в биоклиыическом анализе.
В современных исследованиях для анализа кортикостероидов обычно применяют хромато-масс-спектрометрические методы [82,83,85, 87,88]. 1. 5. 2.1. Дериватизация стероидов Недостатком газовой хроматографии при определении стероидов является то, что они термичесіси нестабильны, и поэтому требуется дополнительная трудоемкая стадия получения производных. Предварительную дериватизацию (бисметилендиоксипентафторпропиоиат-ные [12], триметилсюшльные производные, метилоксимтриметилсилильные эфиры [84, 90 - 92], производные гептафтормасляной кислоты [84]) осуществляют для увеличения летучести и термической стабильности аналитов. Стероиды, содержащие З -ОН группу, легко силилируют N,0-6HC- (триметилсилил)ацетамидом или М,0-бис-(триметилеилил)трифтор- ацетамидом, содержащими 1 % триметилхлорсилана [91]. Проведение дериватизации ОН-групп в положениях 11(3- и 17а-стерически затруднено. В этом случае используют более сильный агент -триметилсилилимидазол (ТМСИМ). Описано получение производных ряда кортикостероидов по 17а-гидроксильной группе с участием смеси Т-Метил-К- триметилсилилтрифторацетамид - триметилйодсилан - 1,4-дитиоэритриол [91]. Другой вид дериватизации гидроксигрупп стероидов для последующего ГХ-анализа реакция ацетилирования [84]. Нашли применение трифторацетаты, отличающиеся высокой летучестью. Из многочисленных производных предпочтение обычно отдают гептафторбутиратам: ВЭЖХ является основным методом разделения аналитов в медико-биологических и фармацевтических исследованиях [14, 35 - 39, 45, 46, 72 -79,93-103]. Ранее в качестве сорбента в ВЭЖХ широко применялся немодифицированный силикагель. Элюентами служили смеси растворителей: хлороформ:метанол; хлороформ:этанол:вода; дихлорметан: метанол; н -гексан: изо пропило вый спирт [13, 94]. В настоящее время применяются сорбенты с привитыми октадецилсшшльными или диольными труппами (рис. 1.6), обеспечивающие наилучшее разделение стероидов [94]. Диольные фазьт предпочтительнее при определении малополярных стероидов. Использование градиентного режима элюирования [45, 46, 93, 94, 96, 100, 101, 104] значительно сокращает время анализа, однако, при этом возникает проблема точного воспроизведения параметров удерживания. Имеется немало работ по использованию хиральных стационарных фаз [9-11, 22, 59]. Обычно при определении лекарственных препаратов и их метаболитов в качестве детекторов используются ультрафиолетовый [1, 4, 45, 93 - 96], флуориметрический [94] и масс-спектрометрический (электроспрей [6, 7, 46, 100, 101, 104], термоспрей [94, 102] и химическая ионизация [103, 105]). Имеются сообщения об определении нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) в биологических объектах с использованием сложных элюирующих систем [106, 107]. Так, для определения препарата кеторолак оптимальной является подвижная фаза вод а: ацето нитрил :дибутил амин фосфат (рН 2,5) (30:20:1, объемы.); предел детектирования кеторолака составил 0,05 мкг/мл [106], а для мелоксикама 0,029 мкг/мл [107].
Реагенты
Для приготовления буферных электролитов, эшоентов для ТСХ, проведения пробоподготовки использовались: гексан (о.с.ч., Криохром), гептан (о.с.ч., Криохром), ацетонитрил (о.с.ч., Криохром), уксусная кислота, этанол, ацетон (о.с.ч., Реактив), оксид алюминия кислый (Sigma, for column chromatography, activity grade I, type WA-1), вода дистиллированная, ацетат аммония {«GR for analysis», Merck); тетраборат натрия (ТУ В Т OHiO) (х.ч), мочевина (х.ч., «Нева Реактив»), 18-краун-6 (ТОО «НІЖ Реактив-Сервис»), 4,13-диаза-18-краун-6 (ТОО «НІЖ Реактив-Сервис»), Р-циклодекстрин («Сигма»), натриевая соль сульфо-р-циклодекстрина («Сигма»), метанол (Merck, extra pure), метанол (ч.д.а. Реахим), соляная кислота (х.ч. «Экрос»), гидрохлорид диэтиламина, к-бутиламин, триэтаноламин, изопропиловый спирт (х.ч., Реахим), гидроксид натрия (Merck, «GRfor analysis»), гидроксид натрия (ч.д.а. «Лахема»), сульфит натрия, додецилсульфат натрия (Merck, «GR for analysis»), дигидрофосфат калия (чда «Экрос»), хлороформ ч.д.а. («Реахим»), дихлорметан (х.ч. «Реактив»), этилацетат (х.ч. «Реахим»), натрий сернокислый (х.ч. «Реактив»), ЭДТА (трилон Б), ортофосфорная кислота (х.ч. «Реахим»), мочевина (х.ч. «Нева Реактив»), циклам («Сигма»),кортизол («Сигма», США), кортизон («Сигма»), кортикостерон («Сигма»), 11-дегидро-кортикостерон («Сигма»), 11-дезоксикортикостерон («Сигма»), 11-дезокси-кортизол («Сигма»), преднизолон (ОАО Ай Си Эн Томскхимфарм, Россия), аналог преднизолона - «Декортин Н» (Merck КсаА), кортизон ацетат (ОАО Химфармкомбинат «Акрихим»), кортинсфф (Polfa, Польша), дексаметазои (KRKA, Словения), парацетамол (АО Белвитамины), ибупрофен (Orion Pharma, Финляндия), дшспофенак (Ратиофарм, Германия), мелоксикам (Boehringer Ingelheim, Испания), аспирин (Медисорб, Пермь), анальгин (Медисорб, Пермь), кеторол (Ранбакси, Индия). Подготовка стандартных растворов к анализу Стандартные растворы кортизола, кортизона, 11-дегидро-кортикостерона, кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона, 11-дезокси-кортизола, концентрацией 1 мг/мл готовили растворением точных навесок по 1 мг каждого из стероидов в 1 мл ацетонитрила во фторопластовых пробирках. Стандартные растворы лекарственных стероидных препаратов готовили растворением точных навесок по 1 мг каждого препарата в 1 мл спирта (для преднизолона и кортинеффа), дистиллированной воды (для кортизон ацетата), а для определения дексаметазона использовался уже готовый раствор (глазные капли в виде суспензии с концентрацией 1 мг/мл). Рабочие растворы готовили разбавлением стандартных в необходимое количество раз (до концентрации 10 и 1 мкг/мл) с помощью микрошприца и автоматического дозатора.
Полученные растворы до анализа хранили в морозильной камере при — 20С. Стандартные растворы нестероидных противовоспалительных средств (1 мг/мл) готовили растворением точных навесок каждого (масса активного вещества 1 мг) в 1 мл дистиллированной воды и хранили при 20С. Приготовление буферных растворов боратный буфер, 0,025 М, рН9,3. Для приготовления 10 мл буфера в 5 мл дистиллированной воды растворяли 47,6 мг Na2B4O7 10 Н20. В раствор тетрабората натрия добавляли 1,5 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и 3,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивали. фосфатный буфер, 25 мМ, с добавкой 15 мМ додецгшсулъфата натрия и 7 М мочевины, рН 2,5. Для приготовления буфера брали 17 мкл 15 М фосфорной кислоты, 0,3 мл 0,5 М водного раствора додецилсульфата натрия, 7 мл 10 М водного раствора мочевины, доводили водой до 10 мл и тщательно перемешивали. Приготовление раствора матрицы для MALDIOF Voyager DE а) Точную навеску матрицы - о.-циано-4-гидроксикоричной кислоты растворяли в специально приготовленном растворе (50 %-ный раствор ацетонитрила в 0,1 %-ном растворе трифторуксусной кислоты), так что конечная концентрация матрицы составила 20 мг/л (или 1,6 мМ). б) Точную навеску матрицы - 2-(4-гидроксифенилазо)бензойной кислоты растворяли в специально приготовленном растворе (50 %-ный раствор ацетонитрила в воде), так что конечная концентрация матрицы составила 1,3 г/л . Отбор пробы Суточный объем мочи собирали в сосуд, который в течение всего периода сбора охлаждался до + 5 С. Отбор крови производился из вены в 9 часов утра. Венозную кровь в течение 15 мин центрифугировали, сыворотку получали путем отбора надосадочной жидкости. До анализа сыворотку хранили в холодильной камере при-20 С. 2.3. Методы исследования 2. 3.1. Капиллярный электрофорез с УФ-детектированием Система капиллярного электрофореза («Капель 103») оснащена фотометрическим детектором (254 нм). Стероидные гормоны поглощают в области 240 нм, нестероидные противовоспалительные средства -преимущественно в области 210 нм. Детектирование проводилось в режиме реального времени непосредственно в капилляре. Использовался кварцевый капилляр с внешним нолиимидным покрытием (внутренний диаметр 75 мкм, внешний 365 мкм, общая длина 60 см, эффективная длина 50 см). При подборе условий электрофоретического определения модельной смеси стероидных гормонов, содержащей кортизол, кортизон, 4» кортикостерон, 11-дезоксикортикостерон, П-дезоксикортизол, преднизолон, кортизон-ацетат, кортинефф, дексаметазон, использовались различные режимы капиллярного электрофореза (зонный и мицеллярный), варьровались условия ввода пробы, напряжение, концентрации макроциклов, способы online концентрирования {стэкинг, сеипииг). Нами применялся гидродинамический вариант ввода пробы. При гидродинамическом вводе объем вводимой пробы увеличивался с повышением времени ввода (от 2 до 140 с) при постоянном давлении 30 мбар (максимальное давление, достигаемое в системе капиллярного электрофореза «Капель»). Максимальное приложенное напряжение в ходе анализа на приборе «Капель» составляет 25 кВ. Во избежание сильного тока при использовании некоторых буферных систем работали с напряжением 20 кВ. Так как содержание определяемых компонентов (эндо- и экзогенных кортикостероидов) в реальных объектах (моча, сыворотка крови) невелико ( несколько нг), то необходимо было отработать способы концентрирования компонентов пробы. В режимах капиллярного электрофореза существует несколько решений данной проблемы. При вводе пробы давлением в герметичном узле ввода создается небольшое избыточное давление воздуха, которое вдавливает пробу в капилляр. Объем вводимой пробы, в среднем составляющий сотые доли мкл, регулировали изменением давления (30 мбар) и временем ввода (15 - 100 с). Предел обнаружения стероидных гормонов при использовании гидродинамического ввода составил 50 мкг/л.
Сравнительный анализ методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ при определении стероидных гормонов
Был проведен сравнительный анализ параметров разделения лекарственных стероидных препаратов методом МЭКХ, ОФ ВЭЖХ и ВЭТСХ (табл.3.7). По эффективности мицеллярный вариант капиллярного электрофореза превосходит ВЭТСХ и ВЭЖХ, но уступает последнему по линейному диапазону. При этом общее время анализа при использовании метода МЭКХ меньше, однако подобных результатов можно добиться и в ВЭЖХ, применяя вариант градиентного элюирования. Поскольку предел обнаружения в методе ВЭЖХ составляет всего 3-5 нг/мл, общее количество биологического образца при определении кортикостероидов значительно меньше, чем при использовании МЭКХ или ВЭТСХ. Одним из существенных преимуществ ВЭТСХ является возможность одновременного анализа нескольких образцов (до 70 проб) [37]. 3.7. Определение эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллнрной тонкослойной хроматографии Прежде чем приступить к анализу стероидов в режиме мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии, было проведено предварительное исследование поведения выбранного стероида -преднизолоиа в условиях традиционной тонкослойной хроматографии - на пластинках "Silufol". Для исследования элюирующих свойств водного раствора додецилсульфата натрия из всего набора эндо- и экзогенных стероидных гормонов был выбран именно этот лекарственный препарат, поскольку он - наиболее гидрофильный, а, значит, и прочнее удерживаемый на силикагеле. Отмечено, что в отсутствии ДДСН преднизолон движется с фронтом водной подвижной фазы с образованием сильно размытого пятна вплоть до стартовой линии. При дальнейшем увеличении его содержания в составе подвижной фазы зона пятна становится более компактной. Оптимальный вариант соответствует концентрации 15 мМ ДДСН в подвижной фазе (рис. 3.34). Для изучения свойств водно-мицеллярных подвижных фаз в режиме ВЭТСХ были использованы стандартные ацетонитрильные растворы эндогенных (кортизол, кортизон) и экзогенных (преднизолон, дексаметазон, кортизон-ацетат) стероидных гормонов (рис. 3.35). Анализ проводился на высокоэффективных хроматографических пластинках "ПТСХ-АФ-В-УФ" X = 254 нм («ЛенХром»). В процессе проведения экспериментов (подвижная фаза - вода) обнаружено, что наиболее гидрофобные лекарственные стероидные препараты - дексаметазон и кортизон ацетат - остаются на старте, в отличие от преднизолона и кортизола.
При введении в элюент додецилсульфата натрия (3 мМ) значение параметра Rf дексаметазона увеличивается (растет сродство к подвижной фазе), а кортизон ацетат по-прежнему остается на старте. При этом на пластине после проведения анализа отмечается двойной слой подвижной фазы: первый - водный, второй (чуть ниже) - раствора мономеров ДДСН (рис. 3.36). Величина параметра Rf кортизон ацетата растет при добавлении 12 мМ ДДСН, что оказалось оптимальным при разделении стероидных гормонов: все соединения регистрируются в области между стартовой линией и линией фронта (рис. 3.36). В этом случае содержание ДДСН в подвижной фазе больше, чем критическая концентрация мицеллообразования (ККМ), и основными переносчиками разделяемых веществ являются мицеллы ПАВ, избирательно взаимодействующие с гидрофильными и гидрофобными аналитами. Если концентрация ДДСН составляет 17-20 мМ, преднизолон, дексаметазон и кортизол перемещаются с водным фронтом. Когда концентрация ПАВ достигает 20 мМ, преднизолон, дексаметазон и кортизол переходят в зону между фронтом подвижной фазы и мономеров ДДСН, а кортизон и кортизон ацетат распределяются в области между фронтами мономеров и мицелл ПАВ (рис. 3.36). Проведена серия экспериментов по изучению влияния мицеллярных водно-органических систем: ацетонитрил - вода (1:4, по объему) и диэтиловый эфир - вода (1:9, по объему) на хроматографические характеристики стероидных препаратов. Отмечено, что при увеличении концентрации ДДСН до 5 мМ наблюдается линейная зависимость для всех стероидов, кроме кортизон ацетата (рис. 3.38, б). Вид линейных уравнений и соответствующие им коэффициенты детерминации представлены в табл. 3.9. Наибольшая эффективность достигается при использовании подвижной фазы ацетонитрил - вода (1:4, по объему) и концентрации ДДСН 5 мМ. Использование больших концентраций детергента приводит к тому, что кортизон ацетат, преднизолон, дексаметазон и кортизол «сливаются» в одно пятно. Таким образом, при определении остаточных лекарственных препаратов в биологических жидкостях (моча), в случае проведения лекарственной терапии, перспективным, является использование метода мицеллярной ВЭТСХ (подвижная фаза - 5 мМ еодно-ацетонитрилъный (4:1, по объему) раствор ДДСН). Данный вариант может быть пригоден как для идентификации лекарственных препаратов, так и для оценки их чистоты. Стероидные гормоны в биологических объектах содержатся на уровне мкг/л, поэтому для снижения предела обнаружения обычно проводят предварительное концентрирование определяемых соединений. Стадия пробоподготовки предполагает выделение фракции только свободных стероидных гормонов. Нами был проведен сравнительный анализ двух вариантов пробоподготовки: жидкостной и твердофазной экстракций. 3. 8.1. Пробоп од готовка сыворотки крови Жидкостная экстракция Жидкостная экстракция кортикостероидов сыворотки проводилась пятикратным объемом метиленхлорнда. Затем органический экстракт промывали щелочью (0,1 н. водный раствор NaOH) для отделения более полярных, чем кортикостероиды, соединений (фенольные эстрогены, нестероидные лилиды и др.), окрашенных веществ, присутствующих в образце сыворотки крови. Далее экстракт промывали дистиллированной водой, сушили в течение получаса над безводным сульфатом натрия и выпаривали током воздуха. Ыа рис. 3.39. представлена хроматограмма образца сыворотки, подготовленного к анализу методом жидкостной экстракции. 3. 8. 2. Пробоподготовка мочи Жидкостная экстракция 2 мл мочи экстрагировали пятикратным объемом хлороформа, после чего экстракт дважды промьгвали 1 мл 0,1 н. водного раствора гидроксида натрия (для удаления более полярных примесей и пигментов, присутствующих в пробе) и 2 мл дистиллированной воды. Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, а затем выпаривали экстракт под током воздуха досуха. Для анализа методом ОФ ВЭЖХ выпаренный остаток растворяли в 60 мкл 10 %-ного водного раствора ацетонитрила. На рис. 3.40 представлена Процесс твердофазной экстракции, как правило, включает 4 основные стадии: кондиционирование патрона метанолом (7 мл) и дистиллированной водой (14 мл); пропускание через сорбент 2 (1) мл аналита или дистиллированной воды (холостая проба); промывка патрона 12 %-ным водным раствором метанола и 5 мл дистиллированной воды; элюирование сорбированных стероидов этанолом. Предварительно был осуществлен подбор элюента для экстракции стероидных гормонов с использованием водных растворов кортикостероидов (концентрация 10 мкг/мл). Были испытаны: метанол, дихлорметан, этилацетат, этанол. Последний вариант оказался оптимальным. В выбранных условиях проведен хроматографический анализ мочи и сыворотки после экстракции (рис. 3.42).
