Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Свойства и роль гистамина и ссротонина в биологических объектах 13
1.1.1. Физико-химические свойства и способы получения гистамина и серотонина 13
1.1.2. Гистамин и серотонин в живых организмах 14
1.1.3. Гистамин как индикатор качества продуктов питания 18
1.1.4. Сопутствующие аминокислоты и биогенные амины 19
1.2. Методы определения гистамина и серотонина 20
1.2.1. Биологические и биохимические методы 20
1.2.2. Химические методы 22
1.2.3. Прочие методы 56
Глава 2. Экспериментальная часть 58
2.1. Реактивы 58
2.2. Аппаратура и техника измерений 62
2.3. Методики измерений и расчетов 63
2.3.1. Расчёт предела обнаружения аминов 63
2.3.2. Методика хроматографирования 64
2.3.3. Проведение измерений поляризации флуоресценции 66
2.3.4. Расчет аналитических характеристик метода ПФИА 69
Глава 3. Флуориметрическое определение гистамина 74
3.1. Флуориметрическое определение гистамина с ОФА 74
3.1.1. Условия взаимодействия гистамина с ОФА, влияние ПАВ 74
3.1.2. Условия проведения реакции аминов с ОФА в присутствии различных нуклеофильных агентов, влияние ПАВ 83
3.2 Флуориметрическое определение гистамина с флуорескамином 95
3.2.1. Выбор оптимальных условий проведения реакции 95
3.2.2. Влияние ПАВ 100
3.2.3. Влияние ЦЦ 102
3.2.4. Градуировочные графики 102
Глава 4. Флуориметрическое определение серотонина 107
4.1. Флуориметрическое определение серотонина по собственной флуоресценции 107
4.1.1. Выбор оптимальных условий определения серотонина по собственной флуоресценции 107
4.1.2. Влияние ПАВ 110
4.1.3. Градуировочные графики 112
4.2. Флуориметрическое определение серотонина с ОФА 113
4.2.1. Выбор оптимальных условий взаимодействия серотонина с ОФА 113
4.2.2. Влияние ПАВ 117
4.2.3. Градуировочные графики 118
4.3. Флуориметрическое определение серотонина с флуорескамином 119
4.3.1. Выбор оптимальных условий взаимодействия серотонина с флуорескамином 120
4.3.2. Влияние организованных сред 123
4.3.3. Градуировочные графики 124
Глава 5. Разработка методик определения аминов методом пфиа 128
5.1. Получение иммунореагентов и оптимизация условий определения аминов методом ПФИА 129
5.1.1. Синтез конъюгатов гистамина и серотонина с белками 129
5.1.2. Синтез флуоресцеин-меченных антигенов (трейсеров) 130
5.2. Разработка метода ПФИА для определения гистамина 133
5.2.1. Иммунореагенты для определения гистамина 133
5.2.2. Титрование антител (определение степени связывания антител антигеном) 134
5.2.3. Градуировочные графики 137
5.3. Разработка метода ПФИА для определения серотонина 139
5.3.1. Иммунореагенты для определения серотонина 139
5.3.2. Титрование антител (определение степени связывания антител антигеном) 139
5.3.3. Градуировочный график 140
5.4. Разработка метода ПФИА для определения эфедрина 141
5.4.1. Синтез иммунореагентов 141
5.4.2. Определение степени связывания (титрование) антител 143
5.4.3. Градуировочный график 143
5.5. Разработка метода ПФИА для определения имазалила 145
5.5.1. Определение степени связывания антител (кривые титрования) 145
5.5.2. Градуировочный график 146
Глава 6. Пробоподготовка биообъектов и методики определения гистамина и серотонина 150
6.1. Разделение и количественное определение гистамина и серотонина методом тонкослойной хроматографии 150
6.1 1. Выбор оптимальных условий хроматографирования 150
6.2. Практическое использование организованных сред для определения гистамина и серотонина 158
6.2.1. Флуориметрическое определение гистамина в пищевых продуктах 158
6.2.2. Флуориметрическое определение гистамина и серотонина в моче 158
Выводы 165
Список Литературы 167
Приложение 213
- Методы определения гистамина и серотонина
- Расчёт предела обнаружения аминов
- Флуориметрическое определение гистамина с флуорескамином
- Выбор оптимальных условий определения серотонина по собственной флуоресценции
Введение к работе
Актуальность темы. Биогенные амины играют ключевую роль во многих физиологических и биохимических процессах, протекающих в живых организмах. Среди биогенных аминов наиболее активными и известными являются гистамин и серотонин, влияние которых на организм человека чрезвычайно многообразно. Они являются тканевыми гормонами, медиаторами нервной системы, стимуляторами и ингибиторами внутриклеточных, тканевых, органных превращений. Реакции, вызываемые биогенными аминами, нередко выходят за пределы гомеостаза и сопровождаются патологическими нарушениями, как в отдельных органах, так и в целом организме.
В организме животных, растениях и пищевых продуктах биогенные амины присутствуют и оказывают основное физиологическое действие, как правило, на наномолярном уровне. Необходимую чувствительность, а в ряде случаев и селективность определения тех или иных биогенных аминов может обеспечить флуоресцентный анализ, который широко используется в клинических лабораториях. Дополнительно улучшить чувствительность имеющихся методик можно при использовании организованных сред, в частности мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) и циклодекстринов. Второе направление, резко упрощающее определение при одновременном улучшении его селективности, связано с разработкой методик определения биогенных аминов иммунохимическими методами, например методом поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА).
Цель работы состояла в выявлении особенностей влияния организованных сред на флуориметрическое определение гистамина и серотонина с различными органическими реагентами и оценке возможностей аналитического применения изученных реакций.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: Оптимизировать и сравнить условия флуориметрического определения гистамина и серотонина с различными реагентами;
9 изучить способы увеличения интенсивности и стабилизации аналитического сигнала при флуориметрическом определении гистамина и серотонина, основанные на введении нуклеофильных агентов и организованных систем; разработать методики экспрессного определения гистамина и серотонина, основанные на сочетании флуориметрического определения с предварительным разделением методом тонкослойной хроматографии (ТСХ); оценить возможность применения метода ПФИА для определения гистамина, серотонина и родственных азотсодержащих биологически активных веществ; оптимизировать пробоподготовку и разработать методики флуориметрического определения гистамина и серотонина в рыбных продуктах и биологических жидкостях. Связь диссертации с научными программами., темами Диссертационная работа является частью госбюджетных исследований кафедры аналитической химии и химической экологии (per. № 01.960.005200), а также выполнялась в соответствии с проектами РФФИ 01-03-32649а, 04-03-32946а, а также программой Федерального агентства по науке, проект №45166. Научная новизна
Проведен сравнительный анализ метрологических характеристик и условий флуориметрического определения гистамина и серотонина с о-фталевым альдегидом и предложенным нами флуорескамином и выявлены достоинства и недостатки каждой реакции; показана возможность увеличения интенсивности и устойчивости флуоресценции продукта взаимодействия аминов с органическими реагентами во времени, а также изменения интервала кислотности взаимодействия при использовании нуклеофильных агентов и организованных сред; выявлено влияние природы мицелл ПАВ и
10 циклодекстринов на флуориметрическое определение гистамина и серотонина; синтезированы иммуногены и трейсеры - антигены, меченные флуоресцеином, специфические для определения гистамина, серотонина, эфедрина и имазалила и оценена их аналитическая пригодность; предложены подходы к экспрессному определению биогенных аминов, основанные на использовании ТСХ и денситометрии, ТСХ и флуориметрии и метода ПФИА
Практическая значимость
Предложены способы увеличения чувствительности флуориметрического определения и снижения предела обнаружения гистамина и серотонина, основанные на использовании нуклеофильных агентов, мицелл ПАВ и циклодекстринов.
Разработаны методики экспрессного определения гистамина и серотонина в рыбных продуктах, винах и моче.
Показана возможность определения гистамина и серотонина методом ПФИА и разработаны методики определения эфедрина в моче и имазалила в воде методом ПФИА.
На защиту автор выносит
Результаты исследования влияния природы реагента, природы и рН буферного раствора, времени образования и устойчивости флуорофора, природы и концентрации нуклеофильных агентов на флуориметрическое определение гистамина и серотонина; влияние природы мицелл ПАВ и циклодекстринов на чувствительность определения и предел обнаружения гистамина и серотонина; способы получения иммунореагентов и оптимизацию условий определения биологически активных аминов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа; методики определения биогенных аминов.
Личный вклад автора Экспериментальные данные, представленные в диссертационной работе, получены автором лично или при его личном участии. Постановка задач, обзор литературы, интепретация и обсуждение результатов осуществлялись при непросредственном личном участии диссертанта под руководством научного руководителя.
Апробация работы Основные результаты работы доложены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2003» (Москва, 2003), IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003),. Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы химического анализа» (Саратов, 2004), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, 2005), International conference "Analytical Chemistry and Chemical analysis" (Kyiv, Ukraine. 12-18 September, 2005), VIII-th International conference on Agri-Food Antibodies. (Chester, England, 6-9 September, 2005), Международной конференции Saratov Fall Meeting (SFM-05) and IV Russian Photobiology Congress: Workshop on Luminescence.- Saratov 27-30 Sept., 2005.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 15 работ в виде 2 статей в журналах, 5 статей в сборниках и 8 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работ изложена на страницах, включая введение, 6 глав, выводы, список литературы (380 источника) и приложения. Работа содержит 67 рисунков и 22 таблицы.
Во введении сформулированы цель и задачи исследования, обоснована актуальность темы, изложены новизна и практическая значимость полученных результатов и основные положения, выносимые на защиту. В первой главе представлен анализ литературы, в котором обсуждаются физико-химические
12свойства и физиологическая роль гистамина и серотонина, их содержание и пути поступления в биологические объекты, основные этапы пробоподготовки и методы определения биологически активных аминов. Во второй главеописаны используемые реактивы, методы и техника измерений, методики расчёта основных параметров. В третьей главе оптимизированы условия флуориметрического определения гистамина с флуорескамином и ОФА в присутствии и отсутствие нуклеофильных агентов, а также влияние организованных сред на эти системы. В четвёртой главе представлены результаты изучения оптимальных условий флуориметрического определения сеотонина по собственной флуореценции, с ОФА и флуорескамином в присутствии и отсутствие организованных сред. В пятой главе рассматривается получение иммунореагентов и трейсеров для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа биологически активных веществ, а также исследуются оптимальные условия их определения. В шестой главе изучены особенности пробоподготовки для определения гистамина и серотонина в зависимости от объекта исследования и экспресс определение аминов методом ТСХ. Представлены примеры практического использования флуориметрического метода определения гистамина и серотонина в присутствии и отсутствие нуклеофильных агентов и организованных сред в рыбе, вине и моче.
Методы определения гистамина и серотонина
Биологические методы анализа основаны на влиянии аминов на уровень кровяного давления кошек и собак, сократительную способность гладкой мускулатуры отрезка кишки или матки, сосудов перфузированного уха кролика и свиньи, способность вызывать бронхоспазм у морских свинок [3, 80]. Биологические методы достаточно чувствительны, в некоторых случаях селективны. Применение этих методов связано с использованием большого количества биологического материала, высокой погрешностью определения, вследствие зависимости от различных биологических условий. В связи с этим, в последнее время биологические методы для определения гистамина и серотонина практически не используются. Радиоэнзимный метод Радиоэнзимный метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако для определения гистамина [81, 82] и серотонина [83, 84] используется сравнительно редко. Это связано со сложностью предварительных химических операций, трудоемкостью, высокой стоимостью ферментов [85]. Кроме того, на воспроизводимость и чувствительность определения влияет источник получения фермента [81], а при анализе крови на воспроизводимость определения большое влияние оказывает антикоагулянт [82]. Иммунохимические методы
Иммунохимические методы очень удобны для рутинного анализа вследствие своей простоты, быстроты и возможности анализа большого числа образцов. В отличие от других методов иммуноанализ, не требует сложной пробоподготовки образца. Главное требование — наличие специфичных к определяемому амину антител [86-88]. Поскольку гистамин и серотонин имеют небольшую молекулярную массу и, как правило, не являются иммуногенами, для получения антител их конъюгируют с высокомолекулярными молекулами, обычно протеинами [89, 90]. Существует два подхода к получению конъюгатов. Первый основан на взаимодействии аминогруппы амина с реагентом, связывающим его с белком [87]. При получении конъюгата вторым способом амин непосредственно связывается с белком через атом азота, находящийся в кольце [91]. В этом случае мешающее влияние оказывают структурно похожие компоненты. Следует отметить, что при некоторых заболеваниях в организме человека могут вырабатываться аутоантитела на амины. Так, аллергические заболевания различного типа сопровождаются выработкой аутоантител на гистамин [92, 93]; для больных наркоманией или при различных психических расстройствах характерно повышенное содержание антител на серотонин [92, 94-97]. Самым распространенным иммунохимическим методом определения аминов является твердофазный гетерогенный иммуноферментный анализ (ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay) [98, 99]. Метод основан на конкурентном связывании исходного амина и амина меченого пероксидазой с ограниченным количеством моноклональных антител. В качестве мостика для образования конъюгата амин-белок используют р-бензохинон или эфиры пропионовой кислоты [16]. Антитела, полученные на такой конъюгат, не реагируют с исходным веществом, поэтому перед анализом необходима химическая дериватизация амина. Эта стадия требует дополнительного времени, а в случае n-бензохинона связана с применением токсичных реагентов [16]. С недавнего времени в некоторых тест-наборах стали применять поликлональные антитела, распознающие амин без дериватизации [16].
Усовершенствовать иммунохимический анализ можно также использованием меченого антитела вместо меченого антигена, поскольку его легче приготовить с высоким выходом продукта [98]. Сигнал можно увеличить с помощью вторичных антител, используя их для детектирования первичных, специфичных к данному гаптену [98]. Сделана попытка увеличения чувствительности определения гистамина с помощью покрытия плашки коньюгатами гистамина с яичным альбумином и антимышиными IgG антителами, меченными пероксидазой [98]. С помощью иммунохимических методов гистамин определяют в пищевых продуктах, крови, тканях. По результатам определения гистамина рассчитывают количество базофилов [100], HI и Н2 рецепторов, а также изучают циркадные ритмы [101]. Иммунохимические методы определения серотонина используют при анализе крови [99] (см приложение табл. 2). химические методы определения гистамина и серотонина, как правило, включают несколько следующих операций: 1. Выяснение способов хранения стандартных растворов и исследуемого биологического или другого анализируемого материала. 2. Предварительную очистку анализируемого объекта от белков и липидов (д епротеинизацию). 3. Отделение гистамина и серотонина от родственных аминов, мешающих их определению. 4. Количественное определение тем или иным методом. Таким образом, видно, что определению аминов различными методами предшествует стадия пробоподготовки. Поскольку биологические объекты, как правило, являются сложными многокомпонентными системами, эта стадия наиболее длительная и трудоемкая и может являться главной причиной искажения результатов [50]. Как уже показано выше, пробоподготовка включает несколько стадий: измельчение и гомогенизацию образца, отделение белков и жиров и отделение сопутствующих азотсодержащих компонентов. Число стадий и повторных операций при пробоподготовке зависит от природы анализируемого образца и используемого метода. Для образцов консервированных продуктов стадии измельчения предшествует удаление заливки, жира и наполнителей. При анализе жидких образцов, таких как алкогольные напитки и биологические жидкости, стадия измельчения и гомогенизации не требуется.
Расчёт предела обнаружения аминов
Расчёт предела обнаружения аминов Для построения градуировочного графика и расчёта предела обнаружения (ПрО) амина готовили серию растворов с различной концентрацией последнего. Предел обнаружения амина был определен по методике, предложенной Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК), учитывающей дисперсию колебаний холостого сигнала около среднего значения [371]. Для определения ПрО проводят несколько измерений «нулевого» стандарта (стандартного раствора, не содержащего аналит), рассчитывают стандартное отклонение и определяют предел обнаружения -концентрацию определяемого вещества, соответствующую минимальному значению аналитического сигнала: где ymin - значение флуоресценции, соответствующее пределу обнаружения, Уо — среднее значение флуоресценции для «нулевого» стандарта, S- стандартное отклонение. графической пластине карандашом проводили линию старта на расстоянии 15 мм от нижнего края и линию финиша на расстоянии 7-10 см от линии старта.
При помощи микрошприца на линию старта наносили 1-5 мкл анализируемых веществ. В хроматографический стакан наливали 5 мл подвижной фазы и опускали подготовленную пластину таким образом, чтобы пятна были выше уровня жидкости. Пластину выдерживали в закрытой камере до достижения фронтом растворителя линии финиша, затем вынимали из камеры и сушили на воздухе до полного удаления влаги. Подвижность реагентов Rf определяли как отношение расстояния от стартовой линии до центра зоны определяемого вещества / к расстоянию, пройденному растворителем от линии старта до линии финиша L: Поскольку измерение поляризации флуоресценции и характерные для метода ПФИА аналитические и метрологические параметры, известны достаточно узкому кругу специалистов, нами дается их подробное описание. Суть измерения поляризации флуоресценции сводится к следующим процедурам: 1.Выбор оптимальной концентрации трейсера 2. Выбор оптимальной концентрации антител, соответствующей 50%-ному связыванию трейсера 3. Построение градуировочного графика
Концентрацию трейсера выбирали с учетом интенсивности флуоресценции нулевого раствора. Для получения кривых титрования антител проводили серийное разведение растворов тестируемых антител, к которым добавляли фиксированное количество трейсера и измеряли поляризацию флуоресценции. В качестве контроля неспецифического связывания тестировали антисыворотку неиммунизированного животного. По результатам измерений строили графическую зависимость разведения антител (логарифмическая шкала) от величины поляризации флуоресценции (тР), и по этому графику определяли разведение антител, вызывающее 50%-ное связывание трейсера (титр) (рис. 2.2). Для получения градуировочных графиков в измерительную пробирку вносили образец, раствор трейсера и раствор антител в оптимальном разведении (или концентрации). Проводили измерение поляризации флуоресценции в соответствии с программами приборов. На основании параллельных результатов измерения растворов со стандартными концентрациями вещества строили градуировочный график — зависимость величины поляризации флуоресценции (тР) от концентрации стандартных растворов вещества (логарифмическая шкала) (рис. 2.3), которая имела S-образный вид. Поляризацию флуоресценции измеряли на приборах в ручном и автоматическом режимах. В зависимости от прибора, время измерения аналитического сигнала одного образца составляло 5-7 с. При измерении на приборе ТДх в полуавтоматическом режиме предусмотрено ручное дозирование иммунореагентов в пробирки и автоматическое измерение по программе Photo Check. Общее время измерения 10 образцов около 7 мин.
Флуориметрическое определение гистамина с флуорескамином
В качестве реагента для определения аминов флуорескамин был предложен достаточно давно, но не получил широкого распространения. Однако некоторые его свойства и особенности протекания реакции с аминами делают интересным рассмотрение флуорескамина в качестве реагента для определения гистамина. Для определения оптимальных условий проведения реакции были сняты спектры поглощения и флуоресценции флуорескамина и продукта его взаимодействия с гистамином. Спектр поглощения флуорескамина имеет полосу в области 235 нм и 270-320 нм (рис. 3.20). Спектр поглощения продукта взаимодействия ГА с флуорескамином имеет полосу в области 380-400 нм (рис.3. 21). Раствор флуорескамина в ацетонитриле не флуоресцирует, то есть избыток реагента не мешает определению. Спектр флуоресценции продукта взаимодействия ГА-флуорескамин имеет максимум при 520 нм (рис. 3.22). В качестве растворителя для приготовления раствора флуорескамина апробировали ацетонитрил и ацетон. Показано, что интенсивность флуоресценции комплекса ГА-флуорескамин выше при использовании ацетонитрила и максимальна при следующем порядке сливания компонентов: ГА-флуорескамин-боратный буферный раствор. Это связано с тем, что флуорескамин неустойчив в щелочных водных средах и при добавлении его в реакционную смесь после боратного буферного раствора при недостаточном перемешивании не успевает полностью прореагировать с гистамином.
Для определения оптимального значения кислотности среды была получена зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ГА флуорескамин от рН буферного раствора (рис. 3.23). Из рис. 3.23 видно, что интенсивность флуоресценции максимальна в интервале рН (9.5 - 10.5). Для выбора оптимального количества флуорескамина, необходимого для определения гистамина использовали метод молярных отношений (рис. 3.24). Максимум интенсивности флуоресценции достигается при трехкратном избытке флуорескамина, но поскольку избыток реагента не мешает определению, то концентрация, выбранная для дальнейших исследований, составила 5-10" моль/л. Еще одним преимуществом флуорескмина является то, что реакция с гистамином протекает при комнатной температуре мгновенно и интенсивность флуоресценции постоянна в течении нескольких часов (рис. 3.25). Таким образом, отсутствие фоновой флуоресценции, мгновенное взаимодействие с гистамином при комнатной температуре, устойчивость комплекса во времени, а также отсутствие резкого, неприятного запаха делает флуорескамин подходящим реагентом для определения гистамина. 100 3.2.2. Влияние ПАВ Главным недостатком флуорескамина является его быстрое разрушение в водных растворах. Этот недостаток можно устранить с помощью поверхностно-активных веществ.
Показано, что в водных растворах в присутствие мицелл анионных и неионных ПАВ флуорескамин не разрушается и продолжает взаимодействовать с гистамином в течение нескольких минут, в то время как в водных растворах в отсутствие ПАВ и, как показано нами, особенно в мицеллах кПАВ он разрушается практически сразу (рис. 3.26). Из этого рисунка видно, что мицеллы неионных и анионных ПАВ в значительной мере стабилизируют водный раствор флуорескамина. Рис. 3.26. Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ГА-флуорескамин от времени нахождения флуорескамина в боратном буферном растворе в отсутствие ПАВ и в мицеллярных растворах ПАВ различной природы до взаимодействия с гистамином (Сфл 5-Ю"3 М, СПАВ 4-Ю"3 М, рН 10, Хвоз$ 360 нм, л-фл 520 нм).
Выбор оптимальных условий определения серотонина по собственной флуоресценции
Выбор оптимальных условий определения серотонина по собственной флуоресценции Для выбора оптимальных условий определения серотонина по собственной флуоресценции были сняты спектры поглощения и флуоресценции данного амина. Как следует из рисунка 4.1, в ближнем ультрафиолете в спектре поглощения серотонина имеется полоса с Хтах = 275 нм. В батохромной части спектра имеется плечо с максимумом в области 295-300 нм. При этом значении длины волны молярный коэффициент поглощения составляет 7.0-103 108 л/(моль-см)} что позволяет отнести ее к л л: электронному переходу в молекуле серотонина. В сильнокислой среде серотонин обладает собственной флуоресценцией, максимум которой находится при 570 нм (рис. 4.2). Согласно литературным данным, флуоресценция серотонина наблюдается в сильнокислой среде, но оптимальные значения кислотности в разных работах различаются.
В связи с этим, было рассмотрено влияние кислотности среды на интенсивность флуоресценции серотонина. Видно (рис.4.3), что максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается в интервале 2-5 М НС1. Для последующих исследований была выбрана концентрация соляной кислоты, равная ЗМ. Интенсивность флуоресценции серотонина зависит не только от кислотности среды, но и времени хранения исходного стандартного раствора. Показано, что в замороженном состоянии раствор серотонина сохраняет свою активность в течение 10 дней. Интенсивность флуоресценции серотонина достигает своего максимального значения через 10 минут после подкисления раствора и остается постоянной более суток (рис. 4.4). Таким образом, определение серотонина по собственной флуоресценции следует проводить в среде ЗМ соляной кислоты через 10 минут после сливания реактивов. 4.1.2. Влияние ПАВ Известно, что введение мицелл поверхностно-активных веществ часто позволяет значительно увеличить интенсивность флуоресценции органических соединений.
В связи с этим, в растворы серотонина вводились ПАВ различной природы и концентрации. I Влияние катионных ПАВ на флуоресценцию серотонина рассматривался на примере цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ), додецилсульфата натрия (ДДС) и Бридж-35 при концентрации ПАВ ниже и выше ККМ. Как видно из табл. 4.1 присутствие мицелл ПАВ не приводит к заметному увеличению интенсивности флуоресценции, а в некоторых случаях снижает ее. Однако, мицеллы ПАВ оказывают влияние на оптимальный для флуоресценции серотонина диапазон кислотности среды.) На примере ДДС показано, что в присутствии мицелл аПАВ интенсивность флуоресценции постоянна в более широком диапазоне, чем в их отсутствие и концентрацию соляной кислоты можно снизить до 0.1 М, т.е. в 30 раз. Этот факт можно объяснить известным эффектом локального повышения концентрации протонов на отрицательно заряженной поверхности мицелл ДДС [377]. Интервал определяемых концентраций серотонина в отсутствие и присутствии ПАВ одинаков и составляет (0,3-30 мкг/мл). Предел обнаружения без ПАВ равен 9.3-10"7 моль/л, в присутствии ДДС - 9.1-10"7 моль/л, т.е. практически тот же. Таким образом, введение ПАВ при определении серотонина по собственной флуоресценции не увеличивает чувствительность определения, однако позволяет использовать менее агрессивные среды. Флуориметрическое определение, основанное на взаимодействии с ОФА, является более чувствительным, чем определение серотонина по собственной флуоресценции. Расхождение в литературных данных по параметрам оптимальных условий протекания этой реакции привели нас к необходимости ее более детального изучения. 4.2.1. Выбор оптимальных условий взаимодействия серотонина с ОФА Спектр поглощения продукта взаимодействия серотонина с ОФА имеет максимум в диапазоне длин волн 320 - 420 нм (рис, 4.7).
