Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературных данных 8
1.1. Общая характеристика нейротрансмиттеров 8
1.2. Методы определения нейротрансмиттеров в биологических объектах 14
1.2.1. Иммунологические и радиохимические методы анализа 14
1.2.1.1. Иммунологический анализ 14
1.2.1.2. Радиоферментный анализ 15
1.2.2. Газовая хроматография 15
1.2.2.1.Силилирование 16
1.2.2.2. Алкилирование 16
1.2.2.3. Ацилирование 16
1.2.3. Определение биогенных аминов и аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 17
1.2.3.1. УФ-и флуориметрическое детектирование 17
1.2.3.2. Электрохимическое детектирование 22
1.2.4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) 24
1.2.5. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) при определении нейротрансмиттеров 26
1.2.5.1. Основы метода капиллярного электрофореза 27
1.2.5.2. Основные варианты капиллярного электрофореза (КЭ) 30
1.2.5.2. 1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) 30
1.2.5.2.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) 31
1.2.5.3. Методы детектирования в капиллярном электрофорезе 34
1.2.5.3.1. УФ-детектирование в капиллярном электрофорезе.34
1.2.5.3.2. Флуоресцентное детектирование 34
1.2.5.3.3. Электрохимическое детектирование 35
1.2.5.3.4. Масс-спектрометрическое детектирование 35
1.2.5.4. Возможности on-line концентрирования в КЭ 37
1.2.5.5. Эффективность, разрешение и селективность разделения в методе капиллярного электрофореза 43
1.2.5.6. Характеристика макроциклических реагентов, используемых в капиллярном электрофорезе 46
1.3. Пробоподготовка биологических объектов к электрофоретическому определению биогенных аминов и аминокислот 49
1.3.1. Твердофазная экстракция 50
1.3.2. Жидкостная экстракция катехоламинов 53
1.3.3. Жидкостная экстракция аминокислот 54
2. Общая характеристика объектов и методов исследования 56
2.1. Аппаратура 56
2.2. Реагенты 59
2.3. Методы исследования 63
2.3.1. Метод капиллярного электрофореза с УФ-детектированием 63
2.3.2. Метод капиллярного электрофореза с МС-детектированием 64
2.3.3. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза 66
2.3.4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии 67
2.3.5. Использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием при определении катехоламинов 68
2.3.6. Масс-спектрометрическиЙ анализ реальных объектов и индивидуальных нейротрансмиттеров 69
2.3.7. Пробоподготовка биологических объектов к анализу 72
3. Выявление доминирующих факторов, определяющих электрофоретическое разделение нейротрансмиттеров 73
3.1. Нейротрансмиггеры. Задачи и проблемы их определения в биологических жидкостях 73
3.2. Установление факторов, влияющих на электрофоретическое разделение биогенных аминов 78
3.2.1. Оптимизация электрофоретического разделения биогенных аминов методом капиллярного электрофореза с УФ- детектированием 81
3.2.1.1. Оценка констант устойчивости комплексов биогенных аминов с 18-краун-6 86
3.2.1.2. Сравнительные оценочные характеристики влияния макроциклов, ион-парного агента и органического растворителя на электрофоретическое разделение аналитов 92
3.2.2. Влияние р-циклодекстрина на электрофоретические характеристики нейротрансмиттерных ароматических кислот 101
3.2.2.1. Оценка констант устойчивости комплексов ароматических кислот с р-циклодекстрином 105
3.2.3. Определение ароматических кислот методом МЭКХ с УФ- детектированием 110
3.2.4. Выяснение возможностей электрофоретического определения алифатических аминокислот методом капиллярного электрофореза с УФ-детектированием без предварительной дериватизации и с использованием фенилтиокарбамоильных производных 110
3.2.5. Изучение кинуренинового пути метаболизма триптофана методами капиллярного электрофореза 113
3.2.6. Определение биогенных аминов методом капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием 116
3.2.1. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза 120
3.3. Хроматографическое определение нейротрансмиттеров 124
3.3.1. Анализ катехоламинов методом ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием 124
3.3.2. Определение триптофана и его метаболитов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии 126
3.4. Масс-спектрометрическое определение неиротрансмиттеров на приборе MALDI-TOF "Voyager DE" 129
3.5. Пробоподготовка биологических жидкостей к анализу 136
3.5.1. Оптимизация условий пробоподготовки биологических объектов для масс-спектрометрического анализа 136
3.5.2. Пробоподготовка биологических жидкостей для электрофоретического и хроматографического определения 138
3.5.2.1. Твердофазная экстракция катехоламинов на активированном оксиде алюминия 140
3. 5. 2. 2. Твердофазная экстракция катехоламинов на силикагеле 147
3.5.2.3. Твердофазная экстракция катехоламинов на модифицированном С18 150
4. Практические приложения 153
4.1. Определение лекарственного препарата «Алкеран» 153
4.1.1. Определение мелфалана в режиме капиллярного зонного электрофореза 153
4.2. Определение 3-гидроксикинуренина в структурах мозга Дрозофил 156
4.2.1. Кинурениновый путь метаболизма триптофана 156
4.2.2. Оптимизация условий определения и разделения метаболитов кинуренинового пути триптофана в режиме капиллярного электрофореза 157
4.2.3. Определение 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в реальном образце методом капиллярного электрофореза 158
4.3. Определение катехоламинов в биологических жидкостях при сердечно-сосудистых заболеваниях 162
Выводы 164
- Методы определения нейротрансмиттеров в биологических объектах
- Пробоподготовка биологических объектов к электрофоретическому определению биогенных аминов и аминокислот
- Масс-спектрометрическиЙ анализ реальных объектов и индивидуальных нейротрансмиттеров
- Хроматографическое определение нейротрансмиттеров
Введение к работе
Актуальность проблемы. Нейротрансмиттеры (катехоламины и их метаболиты, нейротрансмиттерные гидрокси- и аминокислоты) играют важную роль в регуляции деятельности сердечно-сосудистой и эндокринной систем, процессах обучения и памяти [1]. Измерение их содержания в биологических образцах имеет важное практическое значение для клинической диагностики различных заболеваний (болезнь Паркинсона, Альцгеймера, феохромоцитома, нейробластома и др.) [2].
Поскольку концентрации биогенных аминов и аминокислот в биологических жидкостях находятся на уровне нанограммовых количеств, требуются высокочувствительные и селективные методы их определения [3].
Традиционно используют иммунологические методы и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с УФ-, флуоресцентным и электрохимическим детектированием [3]. При этом иммунологические методы позволяют с высокой специфичностью определять только один компонент в ходе анализа, а для ВЭЖХ часто требуется проведение дериватизации. Основные методы анализа нейротрансмиттеров без перевода в производные — ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием [4] и капиллярный электрофорез, характеризующийся высокой эффективностью и обеспечивающий разделение ионных и нейтральных аналитов [5-7].
Цель диссертационного исследования. Разработка стратегии электрофоретического разделения и определения биогенных аминов и их метаболитов в биологических объектах с использованием off-line и on-line концентрирования.
Научная новизна. Выявлены факторы (состав, рН и концентрация рабочего буфера, органические растворители и комплексообразователи в составе электролита, условия ввода пробы), определяющие закономерности щ, электрофоретического разделения нейротрансмиттеров различной природы и позволяющие прогнозировать пути оптимизации анализа сложных смесей.
Обнаружен эффект влияния макроциклов (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6, р-циклодекстрина) и ион-парного реагента (додецилсульфата натрия) на эффективность и селективность электрофоретического разделения нейротрансмиттеров.
Определены возможности off-line и on-line концентрирования (стэкинга) нейротрансмиттеров из биологических объектов для снижения предела обнаружения аналитов в режиме КЭ.
Практическая значимость работы. Разработан метод электрофоретического определения (КЗЭ и МЭКХ) нейротрансмиттеров в плазме крови, моче, структурах мозга, слезной жидкости с УФ-детектированием.
Предложены пути снижения пределов обнаружения при электрофоретическом определении биогенных аминов и их метаболитов в 10 - 1000 раз с использованием твердофазной экстракции (оксид алюминия и С18, модифицированный додецилсульфатом натрия) и on-line концентрирования.
Показана возможность выявления и контроля различных патологий, связанных с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями, посредством электрофоретического анализа биологических жидкостей (моча, плазма и сыворотка крови).
Разработан вариант капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) для количественного анализа смесей триптофана и его метаболитов (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, кинуреновая кислота) в биологических образцах.
Положения, выносимые на защиту
Результаты исследования влияния концентрации и рН буферного электролита, органических модификаторов и комплексообразователей в составе рабочего буфера на электрофоретическое разделение нейротрансмиттеров в режиме КЗЭ и МЭКХ.
Влияние макроциклов как компонентов буферных систем (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6, Р-циклодекстрина) на эффективность и селективность электрофоретического разделения катехоламинов и их метаболитов и количественная оценка комплексообразования в системе «макроцикл-субстрат».
Оптимизированный регламент пробоподготовки биологических жидкостей с использованием твердофазной и жидкостной экстракции.
Способы on-line концентрирования (электростэкинг; стэкинг с большим вводом пробы; стэкинг с усилением поля) для увеличения УФ-чувствительности электрофоретического определения биогенных аминов.
Обоснование возможности и преимуществ электрофоретического определения нейротрансмиттеров в биологических объектах.
Практические приложения выявленных закономерностей: определение биогенных аминов методом КЗЭ в сыворотке крови и моче; определение триптофана и его метаболитов в структурах мозга.
Методы определения нейротрансмиттеров в биологических объектах
Для определения биогенных аминов достаточно широко распространены иммунологические методы анализа [3, 5], позволяющие селективно определять макромолекулярные вещества (протеины и полисахариды) и малые молекулы (гормоны и лекарственные вещества) в составе биологических объектов. Их высокая специфичность основана на г/ис-диолспецифичном сродстве геля к экстрагируемым из реальных объектов катехоламинам. Количество фермент-связанных антигенов обратно пропорционально концентрации катехоламинов [2]. Метод основан на введении в молекулу катехоламинов радиоактивной метки. Фермент переносит радиоактивную группу (обычно [ Н]метил или [14С]метил) в молекулу катехоламинов [3] В основе радиоферментного анализа лежит специфическая реакция антиген — антитело. Все они используют одну общую схему: антисыворотку к определяемому биогенному амину смешивают с раствором меченого амина определенной концентрации: происходит специфическое и обратимое комплексообразование между последним и антисывороткой; вытесняют меченный биогенный амин тождественным ему не меченым; рассчитывают количество аналита в пробе. Основными недостатками иммунологических и радиохимических методов являются: - невозможность за один цикл анализа определять более одного компонента; - антитело способно вступать в перекрестные реакции с соединениями, имеющими сходные функциональные группы или близкими по строению, что приводит к завышенным результатам. 1. 2.2. Газовая хроматография В настоящее время этот метод для определения катехоламинов в лабораторной практике не используют. Однако в 1960 — 1970 гг. он был достаточно распространен [3, 5, 7]. При этом возможно анализировать только смеси летучих и термостабильных соединений, поэтому для определения аминокислот требуется проводить предварительную дериватизацию. Если газовый хроматограф снабжен масс-спектрометрическим детектором, то дериватизацию обычно проводят (для дофамина и норадреналина) с использованием в качестве реагента дериватизации трет-бутилдиметилхлорсилана [12] или пентафторпропионового ангидрида (для метоксикатехоламинов) [3]. Существуют и другие способы получения производных [12 - 15]. Удобным методом дериватизации является получение эфиров ациламинокислот с этерификацией карбоксильной группы. Наибольшее распространение получили N-трифторацетильные производные [3]. 1. 2. 2.1. Силилирование Получение производных осуществляется при 75 С в течение 30 мин [13, 15]. Для последующего газохроматографического анализа обычно используется капиллярная колонка CPSIL 5 СВ (100% диметилполисилоксана, 0.25-мкм).
В [13] определяли силильные производные аминокислот, найденные в метеоритах (аланин (Ala), валин (Val), серии (Ser), пролин (Pro), аспарагиновая кислота (Asp) и глутаминовая кислота (Glu)). /. 2. 2. 2. Алкилирование Алкилирующим реагентом может выступать метанол, алкилгалогенид, диметилформамид. Используют также соли тетраалкиламмония [15]. Реагент не чувствителен к присутствию воды, что позволяет проводить экстракцию в образцах, содержащих влагу. Элюирование производных аминокислот достигается менее чем за 10 мин, а выход реакции составляет 70 - 80%. Преимущества данного метода: простота, легкость автоматизации, хорошая растворимость аминокислот в реагенте. Однако воспроизводимость получаемых результатов недостаточна. 1. 2. 2. 3. Ацилирование Алкилхлорформиаты могут реагировать с первичной и вторичной аминогруппой в водной среде [13, 14, 15]. Реакция аминокислот с хлорформиатом при комнатной температуре идет с высоким выходом ( 93%). 1.2.3. Определение биогенных аминов и аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Известно, что чувствительность метода ВЭЖХ зависит от многих факторов: типа детектирования и природы неподвижных фаз, состава биологической жидкости, характеристик и свойств аналитов или их производных [16-20]. Ионообменная хроматография. Метод традиционно применяется для разделения аминокислот с 1958 г. В качестве неподвижных фаз обычно используют катионообменные смолы в режиме градиентного элюирования. Предел обнаружения зависит, в основном, от типа используемого реагента при постколоночной дериватизации аминокислот [3, 5, 7]. Обращенно-фазовая ВЭЖХ. Большое различие в полярности отдельных аминокислот и низкие коэффициенты поглощения в УФ-области требуют проведения пред- или постколоночной модификации аналитов [3, 5, 7,18-27]. 1. 2. 3.1. УФ- и флуориметрическое детектирование Биологические объекты содержат большое число соединений, поглощающих в УФ-области спектра [1, 7]. К ним относятся катехоламины и их метаболиты. Чувствительность такого детектирования невелика, поскольку их содержание в биопробах очень мало.
Для этого предварительно в молекулу аналита вводят хромофорные группы. Наибольшее применение в качестве реагентов при данном способе детектирования получили арилхлориды, альдегиды и изоцианаты [26]. В качестве реагента дериватизации предложен 4-фтор-7-нитробензо-1,2,3-оксадиазол (I), позволяющий определять амины на уровне 5-20 пмоль [28]. Широко распространен для пост-колоночной дериватизации дофамина и норадреналина о-фталевый альдегид (ОФА)(П), дающий хорошо флуоресцирующие производные (Хвозб = 365 нм, МИсс = 455 нм); предел обнаружения в этом случае составляет 5 пмоль. Дериватизацию с ортофталевым альдегидом проводят также в присутствии тиольной компоненты [6, 18, 29, 30, 31], в качестве которой может выступать 2-меркаптоэтанол [31], 1-ацетил-Ь-цистеин [6, 30], сульфит натрия, 3-меркаптопропионовая кислота и др. Получаемые производные определяют электрохимически и флуориметрически 36 11 337/454 нм [31]. Я Флуоренилметилхлорформил взаимодействует с первичной и вторичной аминогруппами аминосоединений, образуя стабильные карбаматы. Несмотря на то, что данный реагент вступает также и в реакцию с имидазольным кольцом аминосоединений, он популярен из-за простоты самой реакции [28]. Кроме того, хлорформилы могут быть использованы для разделения энантиомеров [33]. 1,2-Дифепилэтилендиамин (V) применяется для получения производных с нор адреналином, адреналином, дофамином и ДОФА при их определении в плазме, моче и слюне. Реакцию проводят в присутствии катализатора глицерина и гексацианоферрата калия в качестве окислителя [34, 35]. Полученные производные разделяют методом ОФ ВЭЖХ, используя в качестве подвижной фазы систему: ацетонитрил /10 мМ ацетатный буфер (рН 6.0) (35:65, по объему), и детектируют спектрофлуориметрически (Ь = 480нм)[3б]. Реакция конденсации катехоламинов с 2-циапоацетамидом (постколоночная дериватизация) также применима для флуориметрического детектирования [37]. Фенилизотиоцианат используется как реагент для получения производных аминокислот, поглощающих в УФ-области спектра [38, 39]. Реакция проходит с первичной и вторичной аминогруппами. Образующиеся фенилтиокарбамоильные производные (ФТК) аминокислот устойчивы и могут храниться в растворе при температуре 2 - 6 С не менее двух недель [38]. При рН 9 - 10 реакция проходит более чем на 70% в течение 40 - 45 мин с любой аминокислотой (кроме аспарагиновой и глутаминовой):
Пробоподготовка биологических объектов к электрофоретическому определению биогенных аминов и аминокислот
Измерение содержания катехоламинов необходимо для диагностики многих заболеваний мозга, поражения центральной нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний (феохромоцитома, нейробластома, болезнь Паркинсона, стрессы) [27]. Но поскольку их уровень в биологическом объекте низок (десятки мкг/л), необходимо выделение их из реального объекта с предварительным концентрированием. Биогенные амины в моче и крови находятся в свободной и сульфоконъюгированной формах, однако, биологической активностью обладает только свободная фракция. Поэтому обычно гидролиз конъюгатов катехоламинов при пробоподготовке не проводят. В качестве одного из основных этапов пробоподготовки предлагается использование твердофазной [9, 16, 17, 22, 23 - 27, 39, 49, 81, 83, 115, 123, 124, 125, 127] и / или жидкостной экстракций [3, 82, 85, 86, 126]. 7. 3.1. Твердофазная экстракция Выделение катехоламинов (КА) из реального объекта (кровь, моча) можно проводить методом твердофазной экстракции с участием слабых и сильных катионитов [25, 26, ПО] оксида алюминия, сорбентов Cig [11, 22, 39], боронатных гелей. При этом необходимо многократное промывание колонки, и проведение повторной экстракции. Часто для экстракции биогенных аминов из матрицы реального объекта используют коммерческие картриджи, заполненные полимерным сорбентом [И, 23,25,26,127]. В [25, 26] для экстракции биогенных аминов применяли сорбционный патрон, заполненный катионообменной смолой в форме Na+ с размером пор 19 - 40 мкм. Элюирование аналитов осуществляли раствором 0.6 М КС1/ацетонитрил. Степень экстракции катехоламинов составила 85%. В [115] для экстракции КА использовали катионит, который позволил одновременно выделять КА и их метаболиты (метанефрины). Элюирование аналитов проводили 5%-ным раствором гидроксида аммония в метаноле. Для твердофазной экстракции КА в [17, 49] предложен сорбент, представляющий собой сополимер N-винилпирролидона и дивинилбензола. Сорбция катехоламинов проводилась из фосфатного буфера (рН 7.0). Повышение ионной силы фосфатного буфера приводило к снижению сорбции более полярных аналитов. Наличие вицинальных групп "ОН" в катехоламинах обеспечивает им достаточно гидрофобный характер, что объясняется образованием внутримолекулярных водородных связей.
В дофамине помимо этого, возможно образование внутримолекулярных связей между амино- и гидроксигруппами. Чем гидрофобнее аналит, тем сильнее он сорбируется на неполярном сорбенте. Катехоламины элюировали с данного сорбента метанолом. В [16] предложена твердофазная экстракция катехоламинов с использованием сорбента Cjg и эфира дифенилборной кислоты с добавкой этаноламина. Катехоламины, содержащиеся в моче, слабо удерживаются на обращенно-фазовом сорбенте Cjg. Дифенилборонат образует устойчивый отрицательно заряженный комплекс с г/ис-гидроксигруппами катехоламина, который в щелочной среде сильно сорбируется. Экстракция проводилась в аммиачном буфере (рН 8.5) с добавкой ЭДТА. Примеси удалялись 20%-ным раствором метанола в аммиачном буфере, а катехоламины элюировали 1 М раствором уксусной кислоты. Предложенный способ экстракции имеет ряд преимуществ перед обычно используемыми ТФЭ сорбентами, а именно: высокая степень экстракции ( 85%); низкие потери аналитов в щелочной среде за счет образования ковалентных связей между гидроксильными группами борат-иона и ис-диольными группами катехоламинов Недостатками этого метода является зависимость эффективности экстракции от рН и трудность удаления мешающих компонентов, структурно сходных с катехоламинами. Аналогично варианту, описанному выше, авторы [124] предлагают использовать коммерческую колонку, заполненную фенилборной кислотой. При подготовке мочи к ВЭЖХ-анализу катехоламинов в образец добавляют ЭДТА; далее проводится кислотный (0,5 М НС1, 100 С, 45 мин) или щелочной (0,5 М NaOH, 100 С, 45 мин) гидролиз, анализируемый объект центрифугируют, осаждая белки, и затем фильтруют через политетрафторэтиленовую мембрану (0.45 мкм), а фильтрат подвергают электрофоретическому анализу. Для выделения катехоламинов из сыворотки крови используют различные варианты, некоторые из которых приведены ниже. К 1 мл плазмы добавляют раствор Na2S205, трис-ЭДТА буфер (рН 8.8) и 10 мг оксида алюминия. Смесь интенсивно встряхивают в течение 10 мин, трижды промывают дистиллированной водой и катехоламины смывают 0,2 М раствором СНзСООН [125]. Либо 1мл плазмы добавляют к 200 мг оксида алюминия, рН смеси доводят с помощью 1 М раствора карбоната калия до 8.5 и тщательно перемешивают. Элюируют катехоламины 0,3 М НС1 [125]. Экстракцию биогенных аминов из мочи обычно проводят иначе: Так, в [61] с помощью фосфатного буфера сначала доводят рН мочи до 7, смесь вводят в колонку (Bio-Rex) (3 0,7 см), и далее колонку промывают водой, пропуская через нее 0,7 М раствор H2SO4. Осевшие катехоламины смывают 2 М раствором (NH4)2S04 в пробирку, содержащую 50 мг оксида алюминия. К элюату добавляют трис-ЭДТА буфер (рН = 8.6) и перемешивают. Удалив водный слой, промывают оксид алюминия водой и элюируют катехоламины 0,1 М раствором хлорной кислоты.
Полученный экстракт далее подвергают ВЭЖХ-анализу [125]. При попытке одновременного определения катехоламинов и их метаболитов японские ученые столкнулись со следующей проблемой [34]. На оксиде алюминия сорбируются адреналин, норадреналин, дофамин и дигидроксифенилаланин, а метанефрин, норметанефрин и 3-метокситирамин остаются в надосадочной жидкости. Последние выделяют отдельно, используя политетрафторэтиленовую мембрану. Экстракция катехоламинов может быть представлена следующей схемой: Описан и другой вариант, когда к 5 мл мочи добавляют 4%-ный раствор тиогликолевой кислоты, трис - буфер (рН 8,6) и 100 мг AI2O3 [25], интенсивно перемешивают, аккуратно сливают жидкость с сорбента и промывают его водой. Катехоламины элюируют 1 М раствором уксусной кислоты [ПО], либо подщелачивают раствором аммиака и десорбируют их 0,3 М раствором уксусной кислоты [37]. Для анализа мочи методом капиллярного электрофореза ТФЭ проводят с использованием картриджа, заполненного полимерным сорбционным материалом [17]. К 1 мл мочи, предварительно гидролизованной, добавляют фосфатный буфер (рН 7.0), и образец вводят в ТФЭ-картридж, который перед использованием кондиционируют (1 мл метанола и 1 мл 0.5 М фосфатного буфера). После адсорбции образцов, колонку промывают водой и высушивают под вакуумом с последующим элюированием катехоламинов метанолом. Для одновременного определения катехоламинов и их метаболитов в моче предложена двухступенчатая пробоподготовка, включающая экстракцию этилацетатом и адсорбцию на оксиде алюминия [83]. Для экстракции катехоламинов из мочи и дальнейшего их определения методом КЭ-МС [34] проводят ТФЭ на картридже с катионитом [ПО]. Для этого к моче добавляют ЭДТА и аскорбиновую кислоту, которая предотвращает окисление катехоламинов. Затем с помощью раствора NaOH доводят рН до 7 и пропускают полученный раствор через картридж, который предварительно кондиционируют метанолом и дистиллированной водой. Далее патрон промывают соляной кислотой и метанолом, аналиты элюируют 5%-ным раствором аммиака в метаноле в пробирку, содержащую ледяную уксусную кислоту. Элюат высушивают и растворяют в воде. 1. 3. 2. Жидкостная экстракция катехоламинов Жидкостную экстракцию раньше широко использовали для выделения биогенных аминов из мочи и плазмы [3]. При этом катехоламины сначала переводили в органическую фазу, а затем уже в подкисленный водный раствор. В [82] предложено ион-парное взаимодействие с дифенилборатом в щелочной среде. Жидкостная экстракция катехоламинов из мочи описана в [126]; рН доводят до 8 с помощью боратного буфера и вводят в раствор флуоресцирующую метку и хлороформ, а затем смесь центрифугируют.
Масс-спектрометрическиЙ анализ реальных объектов и индивидуальных нейротрансмиттеров
нейротрансмшптеров Возможности масс-спектрометра MALDIOF «Voyager РЕ» Л. Диапазон анализируемых масс составляет: 100 - 20 кДа.; ЛІ регистрация катионов и анионов; 5lJ количество исследуемого вещества (нмоль). Прибор может работать в режиме задержки (Delay Extraction), т. е. ионы формируются в слабом электрическом поле и после определенного времени ( не) задержки извлекаются в канал дрейфа приложенным импульсом высокого напряжения. Этот режим позволяет добиться более высокого разрешения сигнала. Характеристики прибора: длина волны лазера Х = 337 нм; длительность импульса лазера 3 не; частота повторения 20 имп/с; давление в вакуумной камере 10" Тор; ускоряющее напряжение до 25 кВ; интенсивность лазера от 0 до 3000 отн.ед.; напряжение на сетке 95% (от ускоряющего); фокусирующее напряжение 0,1 - 0,3%. Были независимо сняты масс-спектры стандартных катехоламинов на времяпролетном масс-спектрометре MALDI. Ионизация осуществлялась лазером (337 нм), в качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксикоричную кислоту [24, 133]. Кроме того, с помощью метода масс-спектрометрии контролировались процессы окисления и димеризации аналита. Известно, что метаболит триптофана - 3-гидроксикинуренин (ЗОНК) легко окисляется с образованием димеров [134]. Были получены спектры свежеприготовленного образца 3-гидроксикинуренина и образца, который хранился при комнатной температуре в течение нескольких дней (Рис. 2. 6). При работе с реальным объектом (моча, плазма крови, структуры мозга) помимо других классов диагностически важных веществ, анализ осложняется присутствием примесных компонентов (липиды, жирные кислоты, соли, буферные растворы, поверхностно-активные вещества) [24]. В связи с этим особую сложность и важность представляет процедура пробоподготовки, включающая обезжиривание (жидкостно-жидкостная экстракция гексаном), обессоливание (эти две стадии необходимы для такого сложного объекта как структуры мозга) и разделение образца на фракции (по химическим свойствам и по массам) с последующим электрофоретическим и масс-спектрометрическим анализами [135]. Предлагаемая нами схема 2.1 представлена ниже. Нейротрансмиттеры участвуют в регуляции психомоторной активности отклика на стресс, процессах обучения и памяти [7]. Содержание нейротрансмиттеров в различных биологических объектах (моче, плазме и сыворотке крови, спинномозговой жидкости, структурах мозга) изменяется (возрастает либо уменьшается) при различных расстройствах функций мозга, кардиологических, нервных и психических заболеваниях [7, 136].
Молекулы нейротрансмиттеров содержат гидрокси-, амино- и карбоксигруппы. Это - катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин) их предшественники (3,4-дигидроксифенилаланин, тирозин, триптофан) и метаболиты (ванилилминдальная, гомованилиновая, гамма-аминомасляная, 5-гидроксииндолуксусная кислоты, метанефрин, норметанефрин, серотонин), и некоторые нейропептиды (лей-энкефалин, субстанция Р). Основные нейротрансмиттеры и их структурные формулы представлены в Табл. 3.1. Поскольку содержание этих соединений в биологических жидкостях очень низко (на уровне нг/мл), необходимы высокочувствительные методы их определения. В связи с этим встает проблема выбора метода. С помощью иммунохимических методов возможно за один цикл анализа определять только один компонент в пробе [2, 3, 5]. Газовая хроматография (ГХ), как и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в большей степени требует проведение предварительной дериватизации: перевод в летучие производные в ГХ (реакции силилирования, алкилирования, ацилирования [13 - 15]) или получение аналитов, содержащих хромофорные группы для ВЭЖХ-определения с флуориметрическим детектированием. Широко распространенными реагентами для дериватизации являются о-фталевый альдегид, дансилхлорид, 1,2-дифенилэтилендиамин, фенилизотиоцианат и др. [29 — 47]. Проведение дериватизации значительно усложняет анализ, делая его более трудоемким, дорогим и длительным. К тому же на каждый класс соединений необходим определенный реагент. Наиболее часто используемый и не требующий получения производных - метод ОФ ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Он является высокочувствительным и селективным, однако, его применение возможно лишь для соединений, содержащих электрофорные группировки (адреналин, норадреналин, дофамин) [4,49 - 54, 57, 70, 71, 114,137].
В последнее время стал активно развиваться метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ), обеспечивающий проведение качественного и количественного анализа с использованием видеоденситометров [58, 59, 61]. Этот метод недорогой, не требует высококвалифицированных операторов, поэтому он был бы наиболее предпочтителен для использования в биохимических лабораториях поликлиник и диагностических центров. Однако ВЭТСХ не позволяет решать задачи определения компонентов на уровне нано- и пикограммовых концентраций, и его использование, по-видимому, не оправдано при анализе реальных биологических объектов. Таким образом, необходим поиск универсального и сравнительно недорогого метода для решения поставленной задачи. Свой выбор мы остановили на методе капиллярного электрофореза. Различные его варианты (капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ)) позволяют определять как ионные, так и нейтральные аналиты [6, 11, 17, 49, 67, 70, 71, 73,74,77-79, 81 -87, 91 -97, ПО, 117,123, 125, 138-140]. Легкость смены условий электрофоретического анализа (замена буферного электролита, его концентрации и рН; введение различных добавок - макроциклов, ион-парных реагентов и органических модификаторов); малый расход реактивов и объем образца; наличие отечественной аппаратуры - все это делает метод КЭ перспективным при разделении сложных смесей органических соединений различных классов. При этом мы отдавали себе отчет и в ограничениях данного метода, которые могли бы затруднить решение поставленной задачи. Концентрационная чувствительность УФ-детектирования в режиме капиллярного электрофореза значительно уступает методу ВЭЖХ, что потребовало разработки новых эффективных вариантов концентрирования следовых количеств биологически активных соединений в процессе пробоподготовки: off-line (жидкостной или твердофазной экстракции) и online [72, 75 - 77, 89,112, 113 - 116]. 3.2. Установление факторов, влияющих на электрофоретическое разделение биогенных аминов Аналиты в капиллярном зонном электрофорезе могут разделяться в виде анионов или катионов, что, в существенной степени, определяется значением рН рабочего электролита. Исследуемые нами соединения (Табл. 3.1) имеют в своем составе различные функциональные группы (амино- и карбокси-группы, фенольные и спиртовые гидроксилы). Химическая структура аналита в существенной степени диктовала выбор рабочего буфера с определенным значением рН. Так, смеси биогенных аминов определяли в буфере с рН 7 (в форме катионов), а кислоты и аминокислоты - с рН 7 (в форме анионов). Помимо рН буферного электролита на электрофоретические характеристики влияет и множество других факторов (концентрация буферного электролита, наличие - органических модификаторов и макроциклических реагентов (Схема 3.1)). При оптимизации условий электрофоретического разделения аналитов варьировали состав и рН рабочего буфера от 3 до 9.8; природу и концентрацию органического модификатора (метанол, ацетонитрил); добавки комплексообразующих агентов (18-краун-6, бензо-18-краун-6, 4,13диаза-18-краун-6, 15-краун-5, Р-циклодекстрин). В Табл. 3.2. представлены конкретные условия оптимизации факторов, влияющих на эффективность и селективность разделения.
Хроматографическое определение нейротрансмиттеров
В качестве референтного метода для подтверждения правильности получаемых нами количественных данных был выбран метод ОФ высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием [130, 132] (Табл. 3.14). Элюент: ЗО мМ КН2РО4, 1,44 мМ октилсульфонат натрия, 40 мМ монохлоруксусная кислота, ацетонитрил (рН 3.0) (Рис. 3.35). С увеличением процентного содержания ацетонитрила в подвижной фазе уменьшается время выхода определяемых компонентов. Так, при изменении количества ацетонитрила с 20% до. 25% общее время анализа уменьшилось с 17 до 10 мин. По сравнению с капиллярным электрофорезом в режиме обращенно-фазовой ВЭЖХ порядок выхода катехоламинов другой: первым на амперограмме выходит норадреналин, затем — адреналин и дофамин, что определяется различным сродством аналитов к подвижной и неподвижной фазам. Ионная пара дофамина с октилсульфонатом натрия по стерическим причинам образуется достаточно легко. Гидрофобный ассоциат прочнее удерживается неполярной неподвижной фазой. В случае норадреналина образование ионной пары наиболее затруднено из-за возможного образования внутримолекулярных водородных связей (для адреналина -вторичного амина - это тенденция выражена слабее), поэтому он и элюируется первым. Чувствительность амперометрического детектирования определяется способностью компонентов пробы к окислению. Катехоламины содержат несколько функциональных групп, способных окисляться: амино- и гидрокси- (фенольные и спиртовые) группы. При потенциале рабочего электрода + 1 В происходит, в первую очередь, окисление фенольных и спиртовых гидроксилов. Кроме того, возникающие затруднения при амперометрическом детектировании могут быть обусловлены загрязнением рабочего электрода из-за сорбции исходных соединений и продуктов окислительно-восстановительной реакции. К тому же работа этого детектора в некоторых случаях зависит от рН элюента, ионной силы, температуры, присутствия в элюенте электрохимически активных компонентов. 3.3. 2. Определение триптофана и его метаболитов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) Развитие метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и возможность количественной видеоденситометрическои обработки результатов позволяет надеяться на применение его при решении многих задач клинической медицины. Основной проблемой его использования является низкая чувствительность.
Тем не менее, для соединений содержащихся в достаточно высоких концентрациях в биологических жидкостях ( 500 мкг/л) метод ВЭТСХ может быть рекомендован в качестве экспрессного их определения при некоторых патологиях. В режиме ВЭТСХ была проведена серия экспериментов по определению триптофана и его метаболитов по кинурениновому пути с использованием пластин на основе силикагеля, модифицированных макроциклами (Р-циклодекстрином и 18-краун-6). В качестве подвижных фаз использовали различные полярные и неполярные растворители с добавкой либо отсутствием макроциклических агентов. Пластины выдерживали горизонтально в течение 5 — 10 мин в водном растворе 18-краун-6 либо р-циклодекстрина (3-15 мМ). Контроль за содержанием макроцикла на пластине осуществляли взвешиванием пластины на аналитических весах до модификации и после. Поверхность силикагеля содержит активные геминальные и вицинальные силанольные группы, являющиеся донором протонов. Кроме силанольных групп на поверхности силикагеля имеются силоксановые группы, обладающие протоноакцепторными свойствами. Максимального разделения компонентов удалось добиться при соотношении компонентов подвижной фазы: уксусная кислота / вода / этилацетат (1:1:3, объемн.), что привело к снижению сродства полярных аналитов к подвижной фазе. Значения факторов Rf оказались следующие: Rf (триптофан) = 0.40; Rf (кинуренин) = 0.26; Rr (3-гидроксикинуренин) = 0.26; Rf (кинуреновая кислота) = 0.29. Видно, что кинуренин и 3-гидроксикинуренин в данных условиях не разделяются, поскольку их химические структуры достаточно близки. Следующим этапом было проведение эксперимента с такой же подвижной фазой, но на пластинах, модифицированных Р-циклодекстрином. Модификация пластин (З-циклодекстрином при использовании подкисленного элюента привела к снижению селективности разделения. Детектирование веществ на немодифицированых пластинах проводили с использованием УФ-лампы. Р-Циклодекстрин сам поглощает УФ-излучение в области 254 нм, поэтому в случае модифицированных пластин детектирование осуществляли, обрабатывая пластину анисовым альдегидом (и-метоксибензальдегид). Введение р-циклодекстрина в подвижную фазу ограничивалось его низкой растворимостью в водных растворах, поэтому было проведено несколько экспериментов с элюирующими системами состава: вода -уксусная кислота - диметилсульфоксид с концентрацией Р-циклодекстрина 3 мМ Наибольшего различия в параметрах удерживания кинуренина и 3-гидроксикинуренина удалось добиться с использованием подвижной фазы ДМСО - 12.5 мМ боратный буфер (рН 8.4) (3 : 7) с концентрацией р-циклодекстрина 3 мМ: Rf (триптофан) = 0.83; Rf (кинуренин) = 0.77; Rf (3-гидроксикинуренин) = 0.85; Rf (кинуреновая кислота) = 0.92. Модификация пластин 18-краун-6 и независимое введение его в подкисленную подвижную фазу (уксусная кислота / вода / этилацетат, 1:1:3) также позволило разделить эти аналиты (Рис. 3.36).
Доминирующую роль в селективности разделения в данном случае сыграло комплексообразование по типу «гость-хозяин» между макроциклом и протонированными аминогруппами 3-гидроксикинуренина и кинуренина, причем для последнего это взаимодействие слабее. Результаты разделения следующие: Rf (триптофан) = 0.58; Rf (кинуренин) = 0.54; Rf (3-гидроксикинуренин) = 0.47; Rf (кинуреновая кислота) = 0.45. Кинуренин и 3-гидроксикинуренин отличаются наличием в молекуле последнего лишь фенольного гидроксила, который, скорее всего, дополнительно стабилизирует комплекс с 18-краун-6 за счет водородных связей. Таким образом, в данном ВЭТСХ-эксперименте удалось разделить триптофан, кинуренин и кинуреновую кислоту; 3-гидроксикинуренин и кинуреновая кислота не делятся. Полученные результаты показали возможность контроля кинуренинового пути метаболизма триптофана методом ВЭТСХ на пластинах, модифицированных р-циклодекстрином и 18-краун-6, поскольку концентрации их в биологических жидкостях достаточно высоки (больше 1 мг/л). 3. 4. Масс-спектрометрическое определение нейротрансмиттеров на приборе MALDIOF «Voyager DE» MALDIOF - масс-спектрометрический метод, используемый для контроля чистоты стандартных образцов, наличия примесных соединений, в том числе для контроля за процессами разложения компонентов биологических систем. Полученные спектры стандартов катехоламинов показали, что в условиях масс-спектрометрического анализа (Рис. 3.37 - 3.39) катехоламины в основном не фрагментируют. Масс-спектры адреналина и дофамина помимо пиков матрицы имеют только пики их молекулярных ионов (184 и 154, соответственно). Норадреналин при бомбардировке лазером фрагментирует с потерей молекулы аммиака: его масс-спектр содержит кроме пика молекулярного иона (170) пик [М-17]+ 152. На Рис. 3.40 представлен масс-спектр модельной смеси нейротрансмиттеров (дофамин, адреналин, серотонин, тирозин, 5-гидрокситриптофан). На спектре отчетливо видны пики молекулярного иона каждого из компонентов смеси. Основная проблема анализа низкомолекулярных соединений в режиме масс-спектрометрии на приборе MALDIOF «Voyager DE» - это наличие пиков матрицы (а-циано-4-гидроксикоричной кислоты) в области до 400 дальтон.
