Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературных данных 10
1.1. Общая характеристика витаминов 10
1.2. Методы определения водо- и жирорастворимых витаминов 18
1.2.1. Газохроматографическое определение витаминов 19
1.2.2. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при определении витаминов 19
1.2.2.1. ВЭЖХ определение жирорастворимых витаминов 19
1.2.2.2. ВЭЖХ определение водорастворимых витаминов 21
1.2.3. Определение витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) 24
1.2.3.1. Методы детектирования в высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) 26
1.2.3.2. Инструментальное оформление количественного анализа в ВЭТСХ 27
1.2.3.3. Параметры удерживания в ТСХ, эффективносъ и селективность разделения 28
1.2.3.4. Мицеллярная тонкослойная хроматография (МТСХ) 30
1.2.3.5. Определение жирорастворимых витаминов методом тонкослойной хроматографии 33
1.2.3.6. Определение водорастворимых витаминов методом тонкослойной хроматографии 34
1.2.3.7. Электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ) 38
1.2.4. Определение витаминов электрофоретическими методами 42
1.2.4.1. Способы концентрирования при вводе проб ("стэкинг", "свипинг") в методах капиллярного электрофореза 47
1.2.4.2. Эффективность, разрешение и селективность разделения в МЭКХ 51
1.2.5. Капиллярная электрохроматография 52
1.3. Пробоподготовка биологических объектов при хроматографическом определении витаминов 57
1.3.1. Пробоподготовка при определении жирорастворимых витаминов 57
1.3.2. Пробоподготовка при определении водорастворимых витаминов 58
ГЛАВА 2. Общая характеристика объектов и методов исследования 63
2.1. Аппаратура 63
2.2. Вспомогательные устройства и материалы 64
2.3. Подготовка стандартных растворов к анализу 66
2.4. Методы исследования 67
2.4.1. Капиллярный электрофорез с УФ-детектированием 67
2.4.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детектированием 68
2.4.3. Электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ) 69
2.4.4. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) 70
2.4.5. Проточная твердофазная микроэкстракция с последующим газохроматографическим анализом 71
2.4.6. Капиллярный электрофорез и капиллярная электрохроматография на микрочипе 72
2.4.6.1. Процедура изготовления полимерного микрочипа 73
2.4.6.2. Изготовление колонок для электрохроматографии на микрочипе 77
2.4.6.3. Получение монолитных акриламидных сорбентов в канале микрочипа 80
ГЛАВА 3. Хроматографическое и электрофоретическое определение водорастворимых витаминов 82
3.1. Определение водорастворимых витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) 85
3.2. Разделение водорастворимых витаминов в режиме электроосмотнческой тонкослойной хроматографии (ЭОТСХ) 92
3.3. Определение водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 97
3.4. Определение водорастворимых витаминов методоми капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии 100
3.4.1. On-line концентрирование водорастворимых витаминов при их электрофоретическом определении 104
3.5. Определение рибофлавина и его коэнзимов методом капиллярного зонного электрофореза на микрочипе с флуоресцентным детектированием 108
3.5.1.Сорбенты для капиллярной электрохроматографии 113
3.5.2. Капиллярная электрохроматография на микрочипе. 118
3.6. Проточная твердофазная микроэкстракция никотинамида и никотиновой кислоты с последующим газохроматографическим анализом 119
ГЛАВА 4. Хроматографическое и электрофоретическое определение жирорастворимых витаминов 122
4.1. Определение жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) 123
4.2. Определение жирорастворимых витаминов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) 124
4.3. Определение жирорастворимых витаминов мнцеллярной электрокинетической (МЭКХ) и мнцеллярной микроэмульсионной хроматографией (МЭЭКХ) 127
4.4. Одновременное определение водо- и жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 129
4.5. Сравнительный анализ методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ при определении водо- и жирорастворимых витаминов 133
ГЛАВА 5. Практические приложения 137
5.1. Количественное определение водорастворимых витаминов (Ві, В2, В3, В6 и С) в фармацевтических препаратах методом ВЭТСХ 137
5.2. Количественное определение водорастворимых витаминов (Bi, В2, Вз, В6 и С) в пищевых продуктах методом МЭКХ 141
5.3. Количественное определение жирорастворимых витаминов (А, Е, D3) в пищевых продуктах методом ВЭЖХ 144
Выводы 146
Приложение 148
Принятые сокращения 156
Список литературы 158
- Определение витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)
- Способы концентрирования при вводе проб ("стэкинг", "свипинг") в методах капиллярного электрофореза
- Проточная твердофазная микроэкстракция с последующим газохроматографическим анализом
- Определение водорастворимых витаминов методоми капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии
Введение к работе
Контроль содержания витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях крайне важен, т.к. нарушения регуляции процессов обмена и развитие различных патологий (гипо- и гипервиталшнозы) часто связаны с недостаточным или избыточным их поступлением в организм.
Для обнаружения витаминов наибольшее распространение получили хроматографические, спектроскопические и иммунологические методы, а в последние годы - и электрофоретические.
Несмотря на значительное количество опубликованных работ в этом направлении, остается нерешенным ряд проблем:
определение водо- и жирорастворимых витаминов из одной пробы в одном аналитическом цикле;
выяснение возможностей капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии в чип-формате для решения этой задачи;
поиск и характеристика сорбентов для капиллярной электрохроматографии при определении витаминов;
использование различных путей on-line концентрирования при их совместном определении.
Ответы на эти вопросы позволили бы определить стратегию выбора аналитического метода при анализе витаминов в природных объектах в зависимости от конкретно решаемой задачи. Этому и посвящено диссертационное исследование.
Работа поддержана грантом «Развитие научного потенциала высшей школы» (подпрограмма «Исследование новых сорбционных материалов для хроматографии и электрохроматографии методом твердофазной микроэкстракции») и гранта РФФИ № 07-03-01001-а.
Цель работы: Выяснение возможностей и ограничений хроматографического и электрофоретического определения водо- и жирорстворимых витаминов.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
На модельных смесях водо- и жирорастворимых витаминов установить закономерности их раздельного и совместного хроматографического (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ, ЭОТСХ) и электрофоретического (КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ) определения.
Выявить влияние мицелл додецилсульфата натрия (ДДСН) на селективность разделения витаминов методами мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Осуществить on-line концентрирование для снижения пределов обнаружения водорастворимых витаминов при их групповом определении методом МЭКХ.
Исследовать возможности капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на микрочипе с флуориметрическим детектированием для селективного определения рибофлавина и его производных.
Получить сорбционные характеристики неподвижных фаз для капиллярной электрохроматографии методом твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ).
Предложить схемы хроматографического и электрофоретического определения водо- и жирорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах (соки, пиво) и биологических объектах (моча) методами МЭКХ, ВЭТСХ и ВЭЖХ.
В работе использовались следующие методы: газовая хроматография (ГХ) и обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ); высокоэффективная и
электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ), капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и капиллярная электрохроматография (КЭХ), в том числе на микрочипе, а также мицеллярная (МЭКХ) и микроэмульсионная электрокинетическая хроматографии (МЭЭКХ).
На защиту выносятся следующие положения:
Результаты исследования влияния органических растворителей (метанол, ацетонитрил) и поверхностно-активного вещества (додецилсульфата натрия) в качестве составляющих рабочего буфера и подвижной фазы на эффективность и селективность электрофоретического и хроматографического разделения водо- и жирорастворимых витаминов в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), мицеллярной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).
Способы электрофоретического и хроматографического определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием.
Обоснование возможностей и преимуществ высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ) с использованием фракционного элюирования для одновременного определения водо- и жирорастворимых витаминов.
Методика селективного определения рибофлавина и его производных в режиме капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе с флуориметрическим детектированием.
Одновременное определение водорастворимых витаминов в пищевых продуктах и моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с различными вариантами on-line концентрирования (стэкинг
с усилением поля и с высокопроводящеи матрицей, использование «водной пробки» и динамического скачка рН).
6. Стратегия выбора метода при определении водо- и
жирорстворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых
продуктах и биологических жидкостях, хроматографическими и
электрофоретическими методами.
Определение витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)
Никотиновую кислоту и никотинамид определяют методами ионообменной [52] или обращенно-фазовой хроматографии [53-55]. В [56] предложен двухколоночный вариант определения витамина В3 с использованием обращенно-фазовой и анионообменной колонок.
Одновременное обнаружение шести форм витамина Вб (пирдоксина, пиридоксамина, пиридоксаля и их фосфатных эфиров) в пище и биологических жидкостях осуществляется в режиме ионообменной [61,68] или ОФ ВЭЖХ [57-60] с флуориметрическим детектированием. Общее содержание витамина В6 в пищевых продуктах предложено определять ион-парной ВЭЖХ после предколоночной дериватизации свободных и фосфорилированных витаминов в пиридоксин [58] с флуоресцентным детектированием (А,Ех=330 нм, А,Ет=440 нм) [57-60]. Для улучшения флуоресценции пиридоксаля и его фосфата их переводят в семикарбазиды [61].
Предложен вариант градиентного элюирования при анализе фармацевтических препаратов на содержание витамин Bi2 (1=550 нм) [44].
Для обнаружения аскорбиновой кислоты применяют колонки С18 [63-66], аминофазы [67] и сорбенты на основе полистиролдивинилбензола [68], а также различные иониты [69]. В качестве подвижных фаз при определении аскорбиновой, изоаскорбиновой кислот и их дегидро-форм в мультивитаминных препаратах и фруктах используются водные буферы с рН 7 [66,68]. Витамин С в биологических объектах определяют в форме хиноксалиновых производных дегидроаскорбиновой кислоты с флуоресцентным детектированием [69], а в форме аскорбиновой кислоты - с УФ- [70] и электрохимическим детектированием [63-67].
Слабое поглощение биотина в УФ-области ограничивает применение метода ВЭЖХ для его обнаружения. Для определения биотина и его метаболитов в биологических объектах получают производные с панацил бромид ом [71] и флуоресцинизотиоционатом [72]. После процедуры очистки и/или дериватизации биотин определяют методом ОФ ВЭЖХ с градиентным элюированием и УФ- [72], флуоресцентным [71,72], масс-спектрометрическим [73] или имуноферментным детектированием [74].
Экстракты фолатов (фолатмоноглутаматов и фолиевой кислоты), выделенных из пищевых продуктов и биологических жидкостей, разделяют на колонках Cjg [75-77] или фенильных фазах [78] градиентным элюированием с УФ- [75,77], электрохимическим [78] или флуоресцентным детектированием [76].
Пантотеновая кислота отделяется от других водорастворимых витаминов на обращенной фазе в изократическом режиме (элюент ацетонитрил/фосфатный буфер) [79,80]. В настоящее время не существует единого аналитического подхода для одновременного определения водо- и жирорастворимых витаминов. В [81] с предварительным концентрированием методом ТФЭ на картридже Cjg жирорастворимые витамины отделяют от водорастворимых, и затем обе фракции хроматографически разделяются в обращенно-фазовом режиме. Одновременное опредение водо- и жирорастворимых витаминов в одном хроматографическом цикле осуществлялось градиентным элюированием смесью метанол/10 мМ трифторуксусусная кислота [82] и метанол/100 мМ фосфатный буфер (рН=7) [83] на колонке Cis К достоинствам метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) можно отнести следующее: 1) универсальность хроматографического разделения; 2) легкая и быстрая смена элюента, что необходимо при оптимизации условий разделения; 3) возможность разделения нескольких образцов при однократном или многократном элюировании; 4) отсутствие проблем с необратимо адсорбированными веществами, поскольку все компоненты разделяемой пробы остаются на слое сорбента, и полученные результаты легко оценить визуально; 5) возможность спектральной идентификации хроматографических зон после разделения (в любом диапазоне длин волн, включая ИК); 6) стоимость количественного анализа составляет лишь 35% от затрат, требуемых на анализ методом ВЭЖХ. Недостатками метода ВЭТСХ являются: 1) ограниченная разрешающая способность из-за сравнительно небольшой длины разделяющей зоны (3-10 см); 2) зависимость от изменений условий окружающей среды (влажность, температура); 3) использование токсичных и химически агрессивных растворителей в качестве подвижных фаз; 4) трудности в работе с образцами, имеющими высокую летучесть, а также с веществами, чувствительными к кислороду или свету (все эти недостатки присущи также и традиционному методу ТСХ). Подвижные фазы, используемые в ВЭТСХ, должны удовлетворять следующим требованиям: содержать в своем составе минимум компонентов; не вступать в химические реакции ни с сорбентом, ни с определяемыми соединениями; быстро испаряться с поверхности пластин после разделения аналитов. В настоящее время предложено несколько классификаций подвижных фаз, которые основываются, главным образом, на физических свойствах растворителей, входящих в их состав: 1. Элюотропные ряды. Термин «элюотропные ряды» был впервые использован Траппе [85]. Растворители располагаются в ряд по мере увеличения их элюирующеи силы (e) - безразмерной величины, зависящей от вязкости, поверхностного натяжения, дипольного момента растворителя. 2. Классификация Снайдера. Снайдер разделил растворители, используемые в ТСХ, на восемь групп на основании их протоно-донорных и протоно-акцепторных свойств [85]. Каждый элюент обладает определенной силой растворителя (S). Силу смеси растворителей (ST) рассчитывают по формуле: где Si — сила растворителя индивидуального компонента; ф, — объемная доля компонента в смеси.
Способы концентрирования при вводе проб ("стэкинг", "свипинг") в методах капиллярного электрофореза
Фармацевтические препараты, содержащие рибофлавин, определялись в концентрированных этанольных экстрактах на силикагеле с подвижными фазами бутанол/бензол/уксусная кислота/вода (8:7:5:3, по объему) и бутанол/уксусная кислота/вода (9:4:5) [109]. Пробоподготовку и хроматографическое разделение флавинов проводили в темноте во избежание их фотолитического разложения. Метод ТСХ на силикагеле с различными элюирующими системами использовался для определения и идентификации флавиновых производных в дрожжах [ПО], йогурте [11] и яичном порошке [112]. Флуоресцентные свойства флавинов позволяют детектировать их пятна в УФ-области при X = 254 или 366 нм. В [113] был идентифицирован 7а-гидроксирибофлавин в плазме крови человека по флуоресценции и его спектру. ВЭТСХ с последующей оптоволоконной флуориметрией использовалась для количественного определения рибофлавина в мультивитаминных препаратах с пределом детектирования 48-320 нг [114].
Анализ препаратов, содержащих никотиновую кислоту, осуществляли на силикагелевых пластинах, модифицированных раствором ацетата цинка [115]. Предложен для этой цели и вариант ВЭТСХ с оптоволоконной флуориметрией. Никотиновая кислота переводилась в соответствующее флуоресцирующее производное, и после разделения пластина сканировалась двойным оптоволокном, которое проводило возбуждающее излучение и принимало сигнал. Предел обнаружения никотиновой кислоты в этом случае составил Юнг [108].
Пантенол и пантотеновая кислота были идентифицированы и количественно определены в фармацевтических препаратах экстракцией этанолом или бензиловым спиртом с последующим разделением на силикагелевой пластине с подвижной фазой изопропиловый спирт/вода. Их содержание определялось методом видеоденситометрии [116].
В [117] методом ТСХ разделялись различные формы витамина В6 (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин фосфат, пиридоксаль фосфат, пиридоксамин фосфат, 4-пиридоксовая кислота и ее лактон) на силикагеле с 0,2 %-ным раствором аммиака в воде. Отделение пиридоксина от других водорастворимых витаминов в лекарственных препаратах осуществляли на силикагелевых пластинах, модифицированных раствором ацетата цинка [118]. Модификация пластин гексадецилтриметиламмоний бромидом использовалась для улучшения селективности ТСХ-разделения при определении витамина Вб в пищевых продуктах [119].
Биотин отделяли от других водорастворимых витаминов ТСХ на силикагеле или целлюлозе, используя нейтральные или кислые водно-бутанольные системы [119,120]. Фолаты и их метаболиты определялись в плазме крови методом ТСХ на целлюлозе с использованием 3%-ного раствора NH4C1 и 0,5%-ного раствора 2-меркаптоэтанола в качестве подвижных фаз [121]. ТСХ с денситометрическим детектированием применялась для обнаружения примеси Ы-(4-аминобензол)-Ь-глутамовой кислоты в препаратах фолиевой кислоты. [122]. Из-за малого содержания витамина В в продуктах питания, тканях и биологических жидкостях перед выполнением денситометрии часто используется биоавтография. В качестве микроорганизма для биоавтографии применялся штамм Escherichia coli. Определение витамина В12 в плазме крови и эритроцитах человека осуществлялось методами одномерной [123] и двумерной биоавтографии [124]. ТСХ широко используется для определения содержания аскорбиновой кислоты в пищевых продуктах [125,126], фармацевтических препаратах [126,127] и биологических жидкостях [126,127]. Изомеры аскорбиновой кислоты и продукт ее окисления, дегидроаскорбиновую кислоту, разделяли методом ТСХ на модифицированных боратом натрия силикагеле и целлюлозе. Компоненты обезболивающей смеси (парацетамол, аскорбиновая кислота, кофеин и фенилэфрин гидрохлорид) определяли методом ВЭТСХ на силикагеле, используя элюирующую систему метиленхлорид/этилацетат/этанол/муравьиная кислота (3,5:2:4:0,5, по объему) [126]. Одновременное ТСХ-определение аскорбиновой кислоты и дипирона описано в [128]. Витамины Вь В2 и В3 иденцифицировали методом ТСХ с использованием оптоволоконного флуориметра. В качестве флуоресцентной метки для никотинамида был взят флуоресциинамин. Витамин В і переводили в форму флуоресцирующего тиохрома окислением щелочным раствором гексацианоферрата калия [129]. Витаминный комплекс, содержащий витамины Вь Вг, Вб, В и фолиевую кислоту, был проанализирован на силикагелевых пластинах, модифицированных ионами переходных металлов [130], а водорастворимые витамины (Вь Вб, Ві2 и С) в витаминизированных напитках - методом ТСХ на силикагеле с водой в качестве подвижной фазы [131]. Для одновременного определения водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах использовалась тонкослойная хроматография под давлением на силикагелевых высокоэффективных пластинах с фотоденситометрическим детектированием. ГТантотетат кальция обнаруживался после обработки нингидрином, а витамин В12 и биотин - 4-диметиламиноциннамальдегидом [132]. Следует отметить, что в литературе практически отсутствуют данные о совместном определении водо- и жирорастворимых витаминов методам ВЭТСХ, что представило бы несомненную важность для экспресс-мониторинга фармацевтических препаратов.
Проточная твердофазная микроэкстракция с последующим газохроматографическим анализом
Для ввода пробы применяют избыточное давление (гидродинамический способ) или высокое напряжение (электрокинетический). Объем вводимой в капилляр пробы составляет несколько нанолитров.
Гидродинамический способ ввода. При вводе пробы давлением в герметичном узле ввода создается небольшое избыточное давление воздуха, которое вдавливает пробу в капилляр [148,149].
Электрокинетический ввод. При этом способе ввода сосуд с пробой, в который погружен капилляр, соединяется с источником напряжения, и под действием короткого импульса напряжения компоненты пробы перемещаются в разделительный капилляр. Количество введенной пробы в данном случае зависит от времени и величины приложенного напряжения, а также электрофоретических подвижностей компонентов пробы.
Многие из водорастворимых витаминов являются кислотами или содержат группы, способные к ионизации при высоком значении рН и, следовательно, могут быть разделены в боратных или фосфатных буферных растворах с рН 7-9 [150]. В [151] предложен метод капилярного зонного электрофореза (КЗЭ) для быстрого определения общего содержание ниацина в концентратах дрожжей. В [152] успешно использован КЗЭ для разделения и идентификации аскорбиновой кислоты и биотина в поливитаминных смесях (фармацевтические препараты, фрукты, напитки). Чтобы надежно определять аскорбиновую кислоту, предложено добавлять L-цистеин в качестве антиоксиданта. Ряд работ посвящен определению рибофлавина и флавиновых коэнзимов в биологических образцах методом КЭ [153], в том числе на микрочипе [154] и МЭКХ [155] с детектированем лазерно-индуцированной флуоресценцией. Fotsing и др. [156] описали определение тиамина, никотинамида, рибофлавина, пиридоксина, аскорбиновой кислоты и пантотеновой кислоты в фармацевтических препаратах методом КЭ в боратном буфере при рН 8.5. Однако разделить цианокобаламин и никотинамид все-таки не удалось.
Используя электролиты с низким значением рН, можно определять витамины, имеющие положительный заряд и содержащие амино-группы. В [157] определяли тиамин, никотинамид и витамин В\2. Показано, что режим КЗЭ позволяет оценивать их чистоту и химическую стабильность. КЗЭ с z-ячейкой детектирования успешно использовался для определения тиамина в моче, плазме крови и слюне; порог обнаружения был уменьшен в девять раз по сравнению со стандартной ячейкой детектирования [158].
Нейтральные витамины и смеси незаряженных и ионных аналитов могут быть разделены, в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) [159-161]. В состав рабочего буферного раствора вводится поверхностно-активное вещество (ПАВ) в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ). Наиболее широко в МЭКХ используется додецилсульфат натрия (ДЦСН).
Ни мицеллярная, ни мономерная форма анионного детергента практически не взаимодействуют со стенками кварцевого капилляра. При подаче высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Компоненты пробы будут распределяться между рабочим буфером и мицеллярной фазой. Мицеллы и проба движутся во взаимно противоположных направлениях (рис. 1.5).
В [162] сообщалось о МЭКХ-разделении водорастворимых витаминов, включая тиамин, рибофлавин, никотинамид, рибофлавин, пиридоксин и цианокобаламин, а в [163] обсуждается электрофоретическое разделение семи водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах. Методы КЭ успешно использовались при разделении ретиноидов (ретинол, ретиналь, ретинойная кислота, ретинил пальмитат). Сообщается о разделении жирорастворимых витаминов в режиме МЭКХ со смесью двух детергентов (ДДСН и Brij35) в составе Трис-буфера и ацетонитрила (70:30) [159] или с добавкой ДДСН и солей желчной кислоты [160,161]. Хотя МЭКХ - универсальная техника определения многих нейтральных веществ, смеси гидрофобных соединений, например, жирорастворимые витамины, трудно обнаруживать этим методом; сильные взаимодействия с мицеллами приводят к большим временам анализа [164]. Кроме того, наиболее гидрофобные витамины, такие как ретинол пальмитат, могут выпадать в осадок в процессе электрофореза из-за низкой растворимости в водных буферах [165]. Решением этой проблемы может быть использование метода электрокинетической хроматографии (ЭКХ) с ионами тетрадециламмония (ТДА), выполняющими роль псевдостационарной фазы [165-167]. Чтобы увеличить растворимость гидрофобных витаминов А, Е и D, в качестве базового электролита предлагалось использовать смесь ацетонитрила и 4 мМ боратного буфера (80:20, по объему) с добавкой 80 мМ ТДА [165,166]. В работе [167] определение витамина К проводилось в пропиленкарбонате с добавкой ионов ТДА. Использование метода ЭКХ в таком варианте ограничивается фоновым поглощением ТДА в базовом электролите, что снижает чувствительность к следовым количествам аналитов. Имеются сообщения о разделении жирорастворимых витаминов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) [168-171]. Окруженные молекулами детергента микрокапли растворителя приобретают заряд и движутся в приложенном электрическом поле к детектору (Рис. 1.6.).
Определение водорастворимых витаминов методоми капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии
Капиллярная электрохроматография (КЭХ) - вид жидкостной хроматографии, использующий для подачи элюента не высокое давление, а электрическое поле. Таким образом, этот физико-химический метод анализа можно рассматривать как гибрид высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза (первая работа опубликована в 1976 г., Pretorius [180]). Он является альтернативой мицеллярной электрокинетической хроматографии при одновременном разделении нейтральных и ионогенных аналитов, сочетая высокую селективность с высокой эффективностью.
Для КЭХ характерен и ряд особенностей по сравнению с ближайшими аналогами: уменьшение расхода реагентов; отсутствие насосов (напряжение легче реализовать, чем высокое давление); плоский профиль потока подвижной фазы; изолирование сигналов от различных источников шумов. Скорость подвижной фазы определяется природой элюента, величиной заряда стационарной фазы, температурой и не зависит от диаметра частиц сорбента.
В капиллярной электрохроматографии может быть использовано то же оборудование, что и в капиллярном электрофорезе (КЭ). Требуются незначительные модификации, например, создание давления 1-1.2 МПа в обоих концах капилляра [181]. Сравнительные блок-схемы приборов для КЭ, ВЭЖХ и КЭХ представлены на рис. 1.9 [182].
Используют капилляры из плавленого кварца, которые характеризуются высоким электрическим сопротивлением, устойчивостью к давлению, УФ-прозрачностью, высокой теплопроводностью, химической стабильностью, гибкостью и механической прочностью. Внешнюю стенку капилляра обычно покрывают полиимидным покрытием, чтобы защитить его от механических повреждений, воздействия кислорода и паров воды [183].
Полая колонка представляет собой капилляр, внутренняя стенка которого покрыта неподвижной фазой, содержащей заряженные группы. По сравнению с насадочными колонками, полые - не имеют проблем с образованием пузырей; ЭОП в полой колонке выше [184].
Насадочные ( 95 % всех используемых колонок в КЭХ) капиллярные колонки характеризуется большей емкостью, чем полые. Они обеспечивают лучшее удерживание и более высокую эффективность, чем в случае полых колонок [184].
Для приготовления насадочных колонок предложено четыре способа, позволяющих получать гомогенный и плотный слой в капилляре с приемлемой скоростью: суспензирование в растворителе [187], суспензирование в сверхкритическом С02 [188], электрокинетическое [189] и центростремительное заполнение [190]. Наиболее распространен метод заполнением жидкой суспензией, включающей стадии, представленные на рис 1.11. [187].
Одно из основных требований к неподвижной фазе - наличие заряженных или легко ионизируемых групп для создания электроосмотического потока. Обращенно-фазовый сорбент наиболее широко используется в капиллярной электрохроматографии [191].
Надежность и воспроизводимость работы колонок в существенной степени определяется технологией их изготовления. Однако набивка гранулированных частиц в капиллярные колонки требует квалификации и специализированного оборудования. Кроме того, фритта, используемая для удерживания набивки, часто способствует появлению центров зарождения пузырьков. Это приводит к нестабильности базовой линии и уменьшению ЭОП [192]. Для преодоления этих проблем разработано новое поколение колонок для КЭХ - пористые полимерные монолитные материалы (монолиты) [186].
Монолиты, или сплошные слои стали перспективным видом стационарной фазы в КЭХ главным образом из-за простоты их изготовления "на месте". Удерживающая фритта уже больше не нужна, и при этом обеспечивается хорошая проницаемость благодаря пористой структуре, а поверхностный химический состав можно контролировать [186].
В зависимости от рН подвижной фазы и природы аналита для усиления ЭОП в монолиты включаются катионные или анионные группы (четвертичные аммонийные или сульфокислотные группы) [192]. Процесс введения заряженных групп на поверхность монолитов после полимеризации называется "пост-функционализацией" нейтрального пористого монолитного носителя [193,194].
