Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Литературный обзор 11
1.1. Основные свойства витаминов 12
1.2. Аналитические возможности физико-химических методов определения витаминов 18
1.3. Современное состояние определения витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 27
Глава 2 Экспериментальная часть
2.1. Приборы, оборудование и методика выполнения эксперимента 32
2.2. Растворители и реактивы 34
2.3. Объекты исследования 34
Глава 3
3.1. Выбор рабочих условий для определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 37
3.2. Изучение взаимного влияния водорастворимых витаминов и расчет их предельно допустимых соотношений в методе ВЭЖХ 48
Глава 4
4.1. Исследование влияния рН среды при пробоподготовке исследуемых объектов 51
4.2. Изучение мешающего влияния органической матрицы при определении водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 52
4.3. Оптимизации условий подготовки пробы при определении витаминов методом ВЭЖХ 55
4.4. Алгоритм пробоподготовки при определении водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 61
Глава 5 Методики определения витаминов методом ВЭЖХ 64
5.1. Методика определения водорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ 64
5.2. Методика определения жирорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ 71
5.3. Расчет массовых концентраций витаминов 74
5.4. Метрологическое обеспечение хроматографического анализа 75
Обсуждение результатов 88
Выводы 92
Библиографический список использованной литературы 94
Приложения 119
- Современное состояние определения витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Выбор рабочих условий для определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ
- Оптимизации условий подготовки пробы при определении витаминов методом ВЭЖХ
- Методика определения жирорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ
Введение к работе
Актуальность. Водорастворимые и жирорастворимые витамины - незаменимые органические вещества, биологические катализаторы химических реакций, протекающих в организме человека; они активно участвуют в обмене веществ и поступают в организм человека практически полностью из внешней среды.
Для поддержания баланса витаминов в организме широкое применение нашли витаминизированные продукты и биологически активные добавки к пище (БАД). Одним из важнейших показателей потребительского качества продукции подобного рода является соответствие содержания биологически активных веществ согласно заявленной рецептуре. Для восстановления качества продуктов питания был принят документ «Основы государственной политики в области здорового питания граждан Российской Федерации на период до 2020 года», пришедший на смену «Концепции здорового питания населения России до 2005 года».
Разработка и совершенствование методов определения витаминов является актуальной задачей, от решения которой зависит качество и безопасность подобной продукции. Выбор инструментального метода анализа для определения водо- и жирорастворимых витаминов в пищевых продуктах обусловлен рядом общих соображений, например: пределами обнаружения метода в зависимости от определяемых содержаний, требованием многоэлементности, допускаемой погрешностью, временными затратами, стоимостью анализа. Безусловно, предпочтение отдается методам, требующим минимальной подготовки пробы к анализу при максимальной информативности. Таким требованиям максимально удовлетворяет метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Современное развитие метода ВЭЖХ расширило аналитические возможности определения витаминов в обогащенных пищевых продуктах. Необходимая подготовка пробы образца весьма проста относительно других методов, что связано прежде всего с исключительной универсальностью, высокой эффективностью разделения, благоприятными условиями анализа (низкая температура, инершый растворитель, отсутствие контакта с кислородом).
Однако, несмотря на интенсивное развитие этого метода в последние 10 лет, в литературных источниках практически отсутствуют методики определения витаминов в таких объектах, как БАД. Трудности в создании методик во многом обусловлены сложностью объектов анализа, таких как обогащенные продукты, в состав которых входят лекарственное растительное сырье (ЛРС), растительные экстракты (РЭ), различные минеральные добавки, красители и другие наполнители; низкими концентрациями витаминов в объектах анализа и высокой чувствительностью к термическому, фотоокислительному и химическому воздействиям. Поэтому разработка экспрессных методик одновременного количественного определения водо- и жирорастворимых витаминов в БАД является актуальной задачей.
Целью работы являлось исследование параметров хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В, выбор оптимальных условий их определения и разработка экспрессных методик аналитического контроля БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание жиро- и водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
исследовать хромато графическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола, провести оценку коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов;
установить параметры хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В;
оптимизировать основные стадии и предложить алгоритм пробоподготовки для определения витаминов в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах;
разработать и метрологически аттестовать методики количественного химического анализа БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание витаминов
Научная новизна:
впервые исследовано хроматографическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола и установлены условия определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
показана применимость универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимодействий сорбат- сорбент, модификатор-сорбент в хроматографической системе и проведен расчет параметров хроматографического разделения: коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков водорастворимых витаминов;
проведена оценка мешающего влияния водорастворимых витаминов группы В при их совместном присутствии, рассчитаны предельные соотношения водорастворимых витаминов в пробе при заданной систематической погрешности и оценены основные составляющие органической матрицы при определении витаминов методом ВЭЖХ;
впервые установлены и оптимизированы условия ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения
пищевых продуктов и премиксов для последующего определения содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
впервые разработаны методики количественного химического анализа проб Б АД, пищевых продуктов и премиксов на содержание воДО" и жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
на основании проведенных исследований проведена метрологи:^01^51 аттестация методик количественного химического анализа водорастворимых витаминов (ВРВ) и жирорастворимых витаминов (ЖРВ) для широкого крУга объектов: премиксов, БАД и витаминизированных продуктов пиидевои промышленности. Методики позволяют экспрессно (в течение 45-60 проводить определение 6 водорастворимых витаминов в сложной матрице БАД;
разработанные методики: «Биологически активные добавки, пиисхевые продукты, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод опреде.лния массовой концентрации водорастворимых витаминов Вь (никотинамид, никотиновая кислота ), В5, В6 и фолиевой кислотен» и «Биологически активные добавки, премиксы. Хроматографический
(ВЭ^Х)
метод определения массовой концентрации жирорастворимых витамин: ^ Е и Д3» метрологически аттестованы и внесены в государстве^^113111 Федеральный реестр методик выполнения измерений, допущеннь»х^< к применению в сфере государственного метрологического контроля и надх^зРа под номерами ФР. 1.31.2005.01917, МУ 08-47/185 и ФР.1.31.2005.0181 О 08-47/184 и используются в практике аналитических лабораторий «Эвалар» (г. Бийск), ЗАО «Алтайвитамины» (г. Бийск), «Внешторгфарма» (г. Москва) и НИИ фармакологии (г. Томск), подтверждается соответствующими актами о внедрении.
Положения, выносимые на защиту:
Описание удерживания водорастворимых витаминов с позиций теории универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ.
Закономерности удерживания водорастворимых витаминов группы В в условиях градиентной обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и выбор рабочих условий хроматографического определения водорастворимых витаминов.
Условия пробоподготовки Б АД, пищевых продуктов, премиксов и алгоритм оптимизации стадии УЗ-экстрагирования при определении витаминов.
Методики хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на международном симпозиуме «Федеральный и региональный аспекты политики здорового питания» (Кемерово, 2002), международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), региональной научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), II Всероссийской конференции по аналитической химии» с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова) (Краснодар, 2007), международной выставке и научно- практической конференции «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности» (Москва, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА- 2008» (Уфа-Абзаково, 2008), II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж , 2008), VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008), IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 138 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 27 таблиц. Диссертация состоит из введения и пяти глав, включая литературный обзор. Список цитируемой литературы содержит 180 библиографических названий работ отечественных и зарубежных авторов. Во введении обоснована актуальность проблемы, определены цели и задачи исследования. Первая глава представляет собой обзор литературы по физико- химическим методам определения водорастворимых и жирорастворимых витаминов в различных объектах. На основании литературного обзора формируются задачи исследования. Описание используемого оборудования, растворителей, реактивов и объектов исследования приведены во второй главе. Третья глава посвящена выбору рабочих условий определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ, изучению взаимного влияния водорастворимых витаминов и расчету их предельно допустимых соотношений в методе ВЭЖХ. В четвертой главе проведены исследования по влиянию рН среды при подготовке проб, изучено влияние органической матрицы при определении водорастворимых витаминов, изложены результаты оптимизации условий подготовки проб и алгоритм пробоподготовки при определении витаминов методом ВЭЖХ. В пятой главе представлены методики определения водо- и жирорастворимых витаминов и метрологическое обеспечение хроматографического анализа. Анализ полученных экспериментальных данных приведен в обсуждении результатов. В заключении сделаны выводы. В приложении представлены таблицы обобщенных данных по определению показателей повторяемости (сходимости) и показателей внутрилабораторной прецизионности, свидетельства о метрологической аттестации разработанных методик и акты о внедрении результатов работы.
Современное состояние определения витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
В основу колориметрических методов определения витамина В2 положены цветные реакции: с реактивом Дениже (раствор сульфата оксида ртути) - оранжевое окрашивание; при рН 6,5 - 7,2 с раствором нитрата серебра- красное или розово-красное окрашивание [9], а колориметрический метод определения ниацина основан на освобождении связанных форм ниацина затем гидролиза, очистки гидрализата от мешающих определению веществ, количественном получении производного глутаконового альдегида и определении его массовой доли при А,=400-425 нм в сравнении со стандартным раствором [18].
Колориметрический метод определения витамина Е основан на его способности окисляться с образованием окрашенных продуктов. При этом химическая структура продуктов окисления и их окраска разнообразны и зависят от характера окисления.
Наиболее известным является железопиридиловый метод Эммери- Энгеля, основанный на окислении токоферола хлорным железом в присутствии с1-с1-дипиридила [19,20,21,22] или о-фенантролина. В методе Фуртера-Мейера токоферол окисляют концентрированной азотной кислотой, образующийся при этом о-токоферилхинон имеет красную окраску [23,24].
Основными недостатками колориметрических методов определения витамина Е является их неспецифичность. Многие вещества, встречающиеся в исследуемых объектах, при окислении способны подобно токоферолам давать окрашенные продукты [25]. С целью удаления из исследуемой среды посторонних мешающих веществ (каротиноидов, стеролов, витамина А) чаще всего применяют щелочное омыление спиртовым раствором КОН с добавкой антиоксидантов (пирогаллола, аскорбиновой кислоты) и последующей экстракцией токоферола из неомыленной части сернокислым эфиром [19,20, 26,27,28]. Щелочное омыление небезразлично для токоферола, который нестоек в щелочной среде, тем более что мешающие анализу вещества часто остаются в неомыляемой фракции [25].
Для определения витамина А предложен колориметрический метод [10,29,30]. Сущность метода заключается в омылении. пробы спиртовым раствором щелочи, экстракции неомыленной фракции этиловым эфиром и- измерении оптической плотности испытуемого раствора с треххлористой сурьмой. К недостаткам этого метода определения витамина А можно отнести те же, что и при колориметрическом определении витамина Е.
Перечисленные недостатки отсутствуют во флуориметрическом методе [3 Г,32,26,22], основанном на образовании флуоресцирующего красителя феназина при конденсации окисленной формы токоферола, о- токоферилхинона с о-фенилендиамином. Сравнение перечисленных оптических методов анализа токоферола проведено в работе [26].
Предложены методики спектрофотометрического определения рибофлавина, основанные на его реакции с и измерении оптической плотности образовавшегося катионного красителя [33]. Производную спектрофотометрию [34] использовали при анализе пищевых продуктов. Малая селективность, высокая длительность анализа, а также низкая чувствительность не позволяет использовать эти методы для анализа водорастворимых витаминов в многокомпонентных смесях.
В основе спектрофотометрического определения витамина Вб лежит в образование комплексов синего цвета с сульфатом диэтил-п-фенилендиамина и калием феррицианидом, их экстракции с последующим измерением оптической плотности при Х.=600 нм [30], а при определении витамина В3 - комплекса с роданобромидным раствором и определении оптической плотности при А,=440 нм [30].
Также нашли широкое применение флуориметрические методы. Сущность флуориметрического метода определения В] и В2 заключается в освобождении связанных форм тиамина и рибофлавина путем кислотного и ферментативного гидролиза, хроматографической очистки полученного гидрализата, переводе в щелочной среде тиамина в тиохром, экстракции тиохрома и измерении интенсивности флуоресценции тиохрома в сравнении со стандартным расмтвором, а в случае определения В2 измерение интенсивности флуоресценции рибофлавина до и после восстановления его гидросульфитом натрия (метод прямой флуориметрии) или люмифлавина (люмифлавиновый метод) в сравнении со стандартным раствором [18].
Необходимость выделения компонентов, большое число вспомогательных операций при подготовке пробы к анализу и, в связи с этим, большие затраты времени и реактивов ограничивают применение оптических методов анализа витаминов в многокомпонентных сухих витаминизированных смесях.
Широкое распространение при определении витаминов получили различные варианты хроматографии.
Для очистки токоферола от посторонних примесей используют метод тонкослойной хроматографии [18,35,36]. В сочетании со спектрофотометрическими и флуориметрическими методами этим способом проводят и количественное определение витамина Е [37,38,39]. При разделении используют пластинки с силуфолом [18,35,36].
Метод газо-жидкостной хроматографии рекомендован Государственной Фармакопеей (ГФ XI) для анализа масляных растворов а-токоферола ацетата [40]. Этим способом определяют витамин Е в виде гептафторбутирильных производных и в пищевых продуктах [41,23,24,38].
Методики анализа ГЖХ требуют получения летучих производных, что крайне затруднительно при анализе жирорастворимых и не возможно при анализе водораствооимых витаминов. По этой причине данные способы определения не получили большого распространения.
Электрохимические методы анализа широко используют в аналитической практике благодаря простоте, надежности, экспрессности, возможности определять практически все элементы периодической системы, разнообразные неорганические и органические соединения в широком диапазоне концентраций. Наибольшее развитие электрохимические методы получили в последние годы за счет использования электронной аппаратуры, компьютеров, разработке новых электродов и способов их очистки, позволяющих применять электрохимию на различных стадиях исследования. В настоящее время электрохимические методы анализа успешно применяются и для определения витаминов [42].
Выбор рабочих условий для определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ
Причиной сорбции витаминов в ОФХ являются диполь-дипольные взаимодействия полярных молекул ПФ, их сильное притяжение одна к другой. Это приводит к сольвофобному вытеснению менее полярных молекул из полярной среды элюента к неполярной поверхности сорбента. Роль поверхности неподвижной фазы в ОФХ - выступать акцептором молекул витаминов, ориентированных к ней гидрофобным фрагментом, и удерживать его слабыми дисперсионными силами.
ВРВ растворимы в воде, поэтому для них обычно подвижная фаза содержит 0-50 % органического модификатора (метанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран), а в качестве растворителя используют бидистиллированную и (или) деионизированную воду.
Витамины выходят из колонки в порядке убывания полярности. С целью улучшения формы пика и воспроизводимости результатов в ПФ добавляют соли, кислоты, буферные растворы для поддержания необходимой ионной силы и рН. Его рН и ионная сила подбираются таким образом, чтобы обеспечить желаемые значения констант сорбции.
Другой режим разделения ионогенных соединений - ион-парная хроматография. Суть ее сводится к тому, что в обычную обращенно-фазовую систему добавляют динамический модификатор; содержащий гидрофобные ионы, имеющие заряд, противоположный по знаку заряду разделяемых ионов. Такой компонент, постоянно поступающий- в колонку вместе с ПФ и, находящийся в динамическом равновесии с другими компонентами системы, изменяет механизм сорбции и селективность системы. Этот прием позволяет получить пики ВРВ почти идеальной формы, что редко достигается при обычной ОФХ или ионообменной хроматографии соединений данной группы.
Метод ОФХ в настоящее время является доминирующим в определении витаминов [163-167]. Причины широкого внедрения метода в том-, что для него налажено производство сорбентов, имеющих привитые алкилсилильные группы разной длины (от Сг до С с прямой алкильной цепью, фенильной и дифенильной группами), а растворители, используемые для этого метода (ацетонитрил, метанол, ТГФ, вода), позволяют работать с оптическими.детекторами в УФ и видимом диапазоне спектра, так как они прозрачны в УФ свете. Пределы прозрачности ПФ в зависимости от состава и химической чистоты модификатора лежат в области 190-220 нм.
Дополнительные возможности в детектировании при определении витаминов дают спектрофотометрические детекторы [26,44,49,54,91,101,147152], позволяющие работать в многоволновом режиме. Такие детекторы предназначены для фотометрирования элюата, выходящего из хроматографической колонки при различных длинах волн, например, в спектральном диапазоне 190-360 нм. Спектрофотометрический детектор состоит из источника света, монохроматора и фотометра. В качестве источника света применима дейтериевая лампа. Изменение длины волны осуществляется поворотом дифракционной решетки монохроматора с помощью шагового двигателя. Одним из перспективных направлений развития фотометрических детекторов является применение фотодиодной матрицы при определении витаминов [153,154] . В таких детекторах непрерывное излучение источника проходит через проточную рабочую ячейку и попадает на дифракционную решетку. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости, где расположена фотодиодная матрица, состоящая из 200-250 элементарных фотодиодов.
Детектор выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин вол 190600 нм с дискретностью 2-5 нм в течение 10 мс. В связи с тем, что при регистрации спектра создается большой массив информации, обработка и запись спектров проводится с помощью быстродействующих компьютера и регистратора. Фотодиодные-матричные детекторы позволяют получить за время одного анализа до 200-250 хроматограмм при разных длинах волн или трехмерную спектрохроматограмму, в которой по одной оси откладывается время удерживания, по другим - оптическая плотность и длина волны витаминов. Замечательная особенность детекторов на фотодиодной матрице заключается в том, что они позволяют проводить количественные оценки даже в случае, когда хроматографические пики не разделяются и перекрываются на всех длинах волн. Для определения витаминов используют таюке флуориметрическое [19,21,75,94,105,153-156] и электрохимическое детектирование [148,152].
Для определения витаминов применяют как изократический (для ЖРВ) [52,157,158,161], так и градиентный (для ВРВ) [49,51,69,151,160] режимы хроматографирования.
Процесс хроматографического разделения витаминов сложен, тем не менее его отдельные стадии могут быть смоделированы и представлены в виде уравнений, достаточно точно и верно отражающих реальный процесс. Без знания того, что такое удерживание, эффективность, селективность, нагрузочная емкость, невозможно подойти к решению практических задач по определению витаминов. Хроматографическое разделение витаминов возможно только в том случае, если компоненты образца, попадая в колонку при вводе пробы, во-первых, будут растворены в подвижной фазе и, во- вторых, будут взаимодействовать (удерживаться) с неподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографическом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействующие с неподвижной фазой, пройдут через колонку с подвижной фазой, не разделяясь на компоненты.
Из проведенного анализа литературных данных ясно, что для определения всего спектра ВРВ и ЖРВ в объектах, имеющих сложный состав, состоящий из ЛРС, РЭ, витаминов, микро- и макроэлементов, идеально подходит метод ВЭЖХ, который позволяет после перевода в процессе пробоподготовки витаминов в раствор, разделить и определить их массовую концентрацию по отдельности. Для этого лучше использовать вариант ОФХ, а в качестве модификаторов использовать ацетонитрил или метанол.
Однако следует отметить, что метод ВЭЖХ еще недостаточно изучен для анализа биологически активных добавок к пище, а также обогащенных пищевых продуктов. Хотя потребность и спрос на методики количественного химического анализа методом ВЭЖХ для данных видов продуктов достаточно велик.
Оптимизации условий подготовки пробы при определении витаминов методом ВЭЖХ
Оптимальной формой лабораторного контроля качества обогащенных пищевых продуктов яляется плановое pi регулярное слежение за содержанием в них витаминов согласно заявляемой рецептуре. Важнейшее условие оптимизации деятельности лабораторной службы - наличие специфических, чувствительных, хорошо воспроизводимых, доступных методик, аттестованных органами стандартизации.
Одним из перспективных методов контроля качества является метод ВЭЖХ, обладающий высокой чувствительностью, селективностью и позволяющий проводить экспрессные серийные анализы. Однако, методики ВЭЖХ определения водорастворимых и жирораствооримых витаминов в БАД практически отсутствуют.
Нами исследовано хроматографическое поведение водорастворимых витаминов Вь В2, В3, В5, Вб В9. при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола. Для выбора рабочих условий определения витаминов нами изучено влияние ПФ на хроматографическое разделение витаминов группы В качестве неподвижной фазы применена Simmetry-Cig и бинарную подвижную фазу, для которой зависимость удерживания сорбата от состава бинарной подвижной фазы описывается уравнением Снайдера log к/= а-п log Nb
Количественное описание закономерностей удерживания водорастворимых витаминов от мольной доли модификатора в бинарной ПФ в обращено-фазной ВЭЖХ в работе описано с применением универсальной квазихимической модели, учитывающей межмолекулярные взаимодействия компонентов хроматографической системы.
Поскольку в нашем случае сорбаты и элюенты оставались неизменными, основная причина изменения доминирующих в системе межмолекулярных взаимодействий сорбат-сорбент и модификатор-сорбент и изменению закономерностей удерживания сорбатов, связанных с составом бинарного элюента адекватно описывается полиномом первой степени:
Нами проведен расчет параметров хроматографического разделения: коэффициентов емкости, ассиметрии и разрешения пиков водорастворимых витаминов (табл. З.1.). Нами экспериментально установлено, что увеличение концентрации модикатора в ПФ сопровождается уменьшением параметров удерживания, а фактора асимметрии приближается к оптимальным значениям 0,7 As l,5. Увеличение содержания ацетонитрила (от 6 до 8 об. %), приводит к примерно одинаковому уменьшению удерживания витаминов, поэтому селективность разделения витаминов зависит в основном от концентрации модификатора. Рассмотренные хроматографические системы с бинарными водно-органическими фазами эффективны для анализа 2-3 компонентных смесей, но не обеспечивает эффективного разделения более сложных смесей. Применение водно- ацетонитрильных элюентов позволяет увеличить разрешающую способность системы с сорбентом Simmetry-Ci8 Эффективного разделения смеси витаминов. Однако применение колонки Simmetry-Cig совместно с водно- ацетонитрильным элюентом решает эту задачу. Система вода-ацетонитрил - Simmetry-Cig характеризуется высокой избирательностью сорбента и хорошей эффективностью разделения водорастворимых витаминов. С помощью программы ACD-Lab/Log Р Version 1.0 по химическим формулам витаминов нами были рассчитаны логарифмы коэффициенты удерживания витаминов В2, В3, В9. Также провен анализ литературных данных и рассчитаны логарифмы коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов. Проведено сопоставление с полученными результатами и сделан анализ отличия коэффициентов удерживания рассчитанными программой.
Нами было изучено хроматографичекое поведение витаминов в модельных смесях с различной органической матрицей: соевый протеин, сахар, растительное масло и яблочный пектин. На модельных смесях, приближенных к реальным объектам были подобраны условия хроматографического разделения и определения витминов с погрешностью - не более 15%.
Нами впервые установлены и оптимизированы условия ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения водорастворимых витаминов и разработан алгоритм подготовки проб БАД, пищевых продуктов и премиксов для последующего определения содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ. Поиск оптимальных условий пробоподготовки мы проведен с помощью факторного планирования эксперимента на примере определения фолиевой кислоты (витамин В9) в витаминизированном премиксе 1-03. В качестве параметра оптимизации выбрано значение содержания витамина В9 в пробе, поскольку ранее показано, что витамин В9 при совместном определении с другими вождорв витаминпами дает большую систематическую погрешность в определении. Варьируемыми факторами выбраны: объем соляной кислоты, концентрация соляной кислоты, температура УЗ-ванны и время УЗ-обработки. Обработка опытных данных для получения математической модели проведена методами классического регрессионного и корреляционного анализа, в результате выбраны оптимальные условия пробоподготовки: объем соляной кислоты - 10 см3, концентрация соляной кислоты - 0,1 М, температура УЗ-ванны - 65 С, время УЗ-обработки - 20 мин.
Методика определения жирорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ
Нами было изучено хроматографичекое поведение витаминов в модельных смесях с различной органической матрицей: соевый протеин, сахар, растительное масло и яблочный пектин. На модельных смесях, приближенных к реальным объектам были подобраны условия хроматографического разделения и определения витминов с погрешностью - не более 15%.
Нами впервые установлены и оптимизированы условия ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения водорастворимых витаминов и разработан алгоритм подготовки проб БАД, пищевых продуктов и премиксов для последующего определения содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ. Поиск оптимальных условий пробоподготовки мы проведен с помощью факторного планирования эксперимента на примере определения фолиевой кислоты (витамин В9) в витаминизированном премиксе 1-03. В качестве параметра оптимизации выбрано значение содержания витамина В9 в пробе, поскольку ранее показано, что витамин В9 при совместном определении с другими вождорв витаминпами дает большую систематическую погрешность в определении. Варьируемыми факторами выбраны: объем соляной кислоты, концентрация соляной кислоты, температура УЗ-ванны и время УЗ-обработки. Обработка опытных данных для получения математической модели проведена методами классического регрессионного и корреляционного анализа, в результате выбраны оптимальные условия пробоподготовки: объем соляной кислоты - 10 см3, концентрация соляной кислоты - 0,1 М, температура УЗ-ванны - 65 С, время УЗ-обработки - 20 мин.
Проведено исследование влияния рН раствора при подготовке проб модельных смесей, содержащих витамины Вь В2 - 0,025 %, Вз - 0,1 %, В5, Вб - 0,05 и В9 - 0,002 %. Показано, что при рН 3 возможно с незначительным занижением витамина В9 определять водорастворимые витамины с достаточной точностью.
На основании проведенных исследований предложен оригинальный алгоритм пробоподготовки и разработаны методики «Биологически активные добавки, пищевые продукты, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод определения массовой концентрации водорастворимых витаминов Вь В2, Вз (никотинамид, никотиновая кислота), В5, В6 и фолиевой кислоты» и «Биологически активные добавки, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод определения массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и Дз». Для практического их использования проведена метрологическая аттестация, согласование и внесение в Федеральном Реестре МВИ под номерами ФР.1.31.2005.01917, МУ 08-47/185 и ФР.1.31.2005.01810 МУ 0847/184.
Методики применимы для широкого круга объектов: премиксов, Б АД и витаминозированных продуктов пищевой промышленности и позволяют экспрессно за 45-60 минут проводить анализ 6 водорастворимых и 3 жирорастворимых витаминов в сложной органической матрице. Выводы 1. Исследованы условия определения водорастворимых витаминов группы В методом ВЭЖХ при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола. Рассчитаны коэффициенты емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов с применением универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ. Установлено, что оптимальное значение параметров удерживания витаминов наблюдается при содержании модификатора - 5 об. %. 2. Сделана сравнительная оценка коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов, рассчитанных различными методами: по программе ACD-Lab/Log Р Version 1.0 и с применением универсальной квазихимической модели и проведено их сопоставление с литературными данными. Выбраны условия хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В: колонка Simmetry-Ci8, водно-ацетонитрильный элюент. 3. Исследовано мешающее влияние водорастворимых витаминов и проведен расчет их предельных соотношений при определении методом ВЭЖХ с систематической погрешностью не более 15 %. 4. Изучено влияние органической матрицы в модельных системах на основе белка, сахара, жира и пектина при определении водорастворимых витаминов и проведена оценка предела обнаружения витаминов В], В2, Вз, В5, Вб, В9 при совместном определении их методом ВЭЖХ. Установлено, что стандартное отклонение определяемого содержания большинства водорастворимых витаминов не превышает 20 %, а для витамина В9 - 40 %.
