Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Пьезокварцевые сенсоры для определения низко- и высокомолекулярных соединений 10
1.2. Полимеры с молекулярными отпечатками для применения в пьезокварцевых сенсорах 20
Глава II. Экспериментальная часть 31
II.1. Характеристика объектов исследования, химических реагентов, иммунореагентов и аналитического оборудования 31
II.2. Иммобилизация биомолекул на поверхности золотого электрода пьезокварцевого иммуносенсора 37
II.3. Электросинтез пленок полимеров с молекулярными отпечатками 39
II.4. Синтез наночастиц полимеров с молекулярными отпечатками методом преципитации 41
II.5. Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело 42
II.6. Определение коэффициентов перекрестного реагирования антител и ПМО 42
II.7. Пробоподготовка образцов пищевой продукции 43
Глава III. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для определения высоко - и низкомолекулярных соединений 46
III. 1 .Формирование рецепторного покрытия иммуносенсора 46
III. 1.1. Генерирование подложки методом электрополимеризации. 47
III. 1.2. Иммобилизация биомолекул на поверхности электрода сенсора 55
III.2. Характеристика применяемых иммунореагентов 62
III.З. Выбор регенерирующего раствора 67
III.4. Метрологические характеристики разработанных пьезокварцевых иммуносенсоров 69
Глава IV. Сенсоры на основе полимеров с молекулярными отпечатками 73
IV. 1. Формирование покрытия на основе полимеров с молекулярными отпечатками методом электрополимеризации 73
IV.2. Применение ПМО цефотаксима и пенициллина G в пьезокварцевых сенсорах 81
IV.3. Синтез наносфер с поверхностными отпечатками методом преципитации 83
IV.3.1. Применение частиц полимеров с молекулярными отпечатками в пьезокварцевых сенсорах 89
Глава V. Применение пьезокварцевых иммуно- и ПМО-сенсоров для определения антибиотиков и природных токсинов в пищевой продукции 94
Выводы 100
Список использованной литературы
- Полимеры с молекулярными отпечатками для применения в пьезокварцевых сенсорах
- Иммобилизация биомолекул на поверхности золотого электрода пьезокварцевого иммуносенсора
- Иммобилизация биомолекул на поверхности электрода сенсора
- Применение частиц полимеров с молекулярными отпечатками в пьезокварцевых сенсорах
Введение к работе
Актуальность работы.
Необходимость определения следовых концентраций биологически активных веществ в пищевой продукции и биологических пробах стимулировала развитие экспрессных, высокочувствительных и селективных методов анализа, основанных на применении сенсоров различной природы.
Пьезокварцевые гравиметрические сенсоры положительно зарекомендовали себя при анализе газов и жидкостей. Чувствительность определения аналитов связана со свойствами пьезокварцевого преобразователя, в то время как рецепторный слой на поверхности его электродов влияет на чувствительность и селективность детектирования. Наиболее часто при анализе жидких сред в качестве распознающих молекул используются иммунореагенты, позволяющие существенно упростить и сократить процесс пробоподготовки при анализе сложных многокомпонентных проб. Способ создания рецепторного слоя на поверхности электрода сенсора зависит от свойств иммобилизуемых биомолекул и может существенно повысить чувствительность определения индивидуальных соединений. Как правило, для формирования распознающего слоя используется ковалентное закрепление иммунореагентов на предварительно сформированную подложку, обеспечивающую прочную связь с поверхностью металлического электрода и влияющую на продолжительность его службы. Наиболее часто применяются подложки на основе самоорганизованных монослоев тиолов и силоксанов. Способы иммобилизации биомолекул на электрополимеризованные тонкопленочные покрытия в пьезокварцевых сенсорах используются значительно реже, несмотря на возможность изменять их характеристики непосредственно в процессе генерирования.
Кроме иммунореагентов для создания рецепторного слоя пьезокварцевых сенсоров применяются полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), которые, как правило, получают методом блочной полимеризации. Перед нанесением полимеров на поверхность электрода сенсора требуется их размельчение, фракционирование и последующее закрепление в виде суспензии, что является причиной невысокой воспроизводимости свойств покрытия. Применение метода электрополимеризации позволяет существенно повысить надежность получения слоя с воспроизводимыми характеристиками, сократить продолжительность получения покрытия и упростить процедуру анализа. Поэтому получение полимеров непосредственно на поверхности электрода сенсора методом электрополимеризациии или применение наночастиц с поверхностными отпечатками определяемого соединения расширит возможности использования ПМО в пьезокварцевых сенсорах в качестве заменителей антител, как в прямом, так и конкурентном формате псевдоиммуноанализа.
Предложенные подходы планируется реализовать при создании сенсоров для определения следовых концентраций антибиотиков бета-лактамной группы, хлорамфеникола, природных фико- и бактериотоксинов, содержание которых в пищевой продукции строго нормируется.
Работа выполнялась при финансовой поддержке ведомственной целевой аналитической программы Минобрнауки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011)» (№2.1.1/14142), гранта РФФИ «Иммунохимические системы для молекулярного распознавания антибиотиков и оценка безопасности пищевых продуктов» (09-03-97566-р_центр_а), темплана Минобрнауки РФ «Пьезокварцевые биосенсоры нового поколения для определения токсинов и физиологических активных веществ» (№3.2727.2011), Фонда развития малых форм предприятий «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» «У.М.Н.И.К» (тема№ 17126, 2012-2013 гг.)
Цель исследования - создание пьезокварцевых сенсоров на основе иммунореагентов и полимеров с молекулярными отпечатками для селективного определения следовых концентраций ряда антибиотиков и природных токсинов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
изучить условия ковалентной иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и антител на электрополимеризованные пленки полианилина и полипиррола;
определить кинетические характеристики обратимой гетерогенной иммунохимической реакции, протекающей на поверхности сенсора, рассчитать константы аффинности и коэффициенты перекрестного реагирования гомологичных и групп-специфичных антител;
изучить условия получения in situ методом электрополимеризации покрытий на основе полимеров с молекулярными отпечатками пенициллина G и цефотаксима;
изучить закономерности синтеза методом преципитации наносфер с молекулярными отпечатками пенициллинов и исследовать условия их использования в пьезокварцевых сенсорах;
разработать пьезокварцевые иммуносенсоры для определения индивидуальных биологически активных соединений (хлорамфеникол, пенициллин G, ампициллин, окадаиковая кислота, стафилококковый энтеротоксин А) и суммарного количества пенициллиновых антибиотиков; ПМО-сенсоры для определения пенициллина G, ампициллина, цефотаксима в пищевой продукции.
Научная новизна.
Установлено влияние условий получения электрополимеризованных тонкослойных пленок полианилина и полипиррола на характеристики рецепторного слоя сенсоров, предназначенных для определения следовых концентраций антибиотиков и природных токсинов. Показано, что иммобилизация гаптен- белковых конъюгатов и антител на полипиррольную подложку обеспечивает более высокую чувствительность определения биологически активных соединений.
Предложен электрохимический способ формирования распознающего слоя на основе полимеров с молекулярными отпечатками цефотаксима и пенициллина G непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора. Показано, что формирование покрытия методом циклической вольтамперометрии и применение в качестве кросс-мономеров диоксибензолов (гидрохинон, резорцин) способствует созданию однородного слоя ПМО оптимальной массы и толщины, с высокой поверхностной концентрацией молекулярных отпечатков.
Впервые изучены условия синтеза наносфер с поверхностными отпечатками пенициллинов методом преципитации и обосновано влияние природы функционального и кросс-мономеров, органического растворителя, температуры и ультразвука на размер и дисперсность наночастиц ПМО. Показана возможность применения наночастиц ПМО в пьезокварцевых сенсорах.
Практическая значимость.
Разработаны сенсоры для определения следовых концентраций индивидуальных биологически активных веществ (пенициллин G, ампициллин, цефотаксим, окадаиковая кислота и стафилоккоковый энтеротоксин А) и суммарного количества антибиотиков пенициллиновой группы. Разработаны способы синтеза тонких пленок ПМО цефотаксима и пенициллина G и наночастиц ПМО пенициллинов методом преципитации. Сенсоры апробированы при анализе реальных пищевых объектов (мясо, молоко, яйца, мед, креветки, кальмары). Научная новизна способа определения хлорамфеникола подтверждена положительным решением Роспатента о выдаче патента (№ 2011129725 от 3 марта 2013).
На защиту выносятся:
распознающие слои иммуносенсоров, полученные ковалентной иммобилизацией гаптен-белковых конъюгатов и антител на электросинтезированные подложки полианилина и полипиррола, позволяющие существенно повысить чувствительность определения биологически активных соединений по сравнению с сенсорами на основе у-аминопропилтриэтоксисилана;
способ электросинтеза тонкослойных пленок ПМО цефатоксима и пенициллина G непосредственно на поверхности электрода пьезокварцевого сенсора, характеризующихся высокой степенью импринтинга и поверхностной концентрацией молекулярных отпечатков, механической прочностью;
результаты изучения условий синтеза методом преципитации наносфер ПМО пенициллинов и заключение о влиянии природы функционального и кросс- мономеров, органического растворителя, температуры и ультразвука на размер и дисперсность наночастиц ПМО и возможности применения наносфер в пьезокварцевых сенсорах;
пьезокварцевые иммуносенсоры, позволяющие определять следовые концентрации хлорамфеникола, пенициллина G, ампициллина, окадаиковой кислоты, стафилококкового энтеротоксина А, суммарное содержание пенициллиновых антибиотиков и ПМО-сенсоры для определения цефотаксима и пенициллина G в пищевой продукции.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на следующих конференциях: Всероссийской конференции «Аналитика России», Краснодар, 2009; Всероссийской конференции «Проведение научных исследований в области индустрии наносистем и материалов», Белгород, 2009; «Экотоксикология - 2009, 2011», Пущино, Тула; Съезде аналитиков России, Москва, 2010; ХХ Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», Екатеринбург, 2010, 2011, 2012; Всероссийской конференции «Биосовместимые материалы и покрытия», Саратов, 2011; Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009, 2011», Москва; V Всероссийской конференции "Фагран-2010", Воронеж; XIII Международной конференции «ИОНИТЫ - 2011» Воронеж; 2-ой Научной региональной конференции с международным участием «Химия-2011», Коломна; Общероссийской научной конференции «Полифункциональные химические материалы и технологии», Томск, 2012; The 7th International conference on instrumental methods of analysis modern trends and application, Греция, 2011; Всероссийской конференции «ЭМА-2012», Уфа, 2012; Всероссийской конференции «Химия биологически активных веществ», Саратов, 2012; International Conference on Materials and Applications for Sensors and Transducers, Венгрия, 2012; 1-ой школе- конференции с международным участие «Новые методы аналитической химии», Санкт-Петербург, 2013.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей (в том числе 6 статей в журналах, входящих в Перечень ВАК) и 7 тезисов докладов.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах печатного текста, включает 37 рисунков, 21 таблицу. Состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальной части, выводов и библиографического списка, включающего 198 ссылок на работы.
Полимеры с молекулярными отпечатками для применения в пьезокварцевых сенсорах
В обоих случаях на величину аналитического сигнала влияет масса присоединенных реагентов, кинетические характеристики реакции и полнота регенерации рецепторного слоя.
Полимерные слои могут быть получены непосредственно на поверхности электрода сенсора или закреплены после соответствующей подготовки в виде суспензий [116].
Широкое распространение для синтеза ПМО получил метод блочной полимеризации [123-124], включающий несколько стадий. В начале темплат, функциональный мономер, кросс-мономер растворяют в подходящем растворителе. Далее в систему вводят инициатор полимеризации [наиболее часто азобисизобутиронитрил (АИБН)], нагревают или облучают электромагнитным излучением УФ-диапазона. По окончании синтеза полимер, полученный в виде монолита, измельчают, фракционируют и экстрагируют темплат органическим растворителем.
ПМО, полученные методом блочной полимеризации, наиболее часто используют при разработке сенсоров для определения органических соединений (кофеин, гидрохинона, фенол, даминозид и т.д. [119-121]). Для получения однородного рецепторного слоя ПМО на поверхности электрода сенсора частицы полимера обрабатывают подходящим растворителем, повышающим адгезию к поверхности металлического электрода. При этом возможно набухание полимерной матрицы и, следовательно, изменение размера «полостей» в ПМО, что может являться причиной снижения доступности отпечатков, уменьшения сорбционной способности и скорости связывания целевых молекул [121]. Измельчение полимера и отсеивание фракций частиц фиксированного размера, получение суспензии в органическом растворителе и ее закрепление на поверхности электрода сенсора приводит к увеличению продолжительности формирования рецепторного слоя (1-2 суток), удлиняет анализ в целом и снижает его производительность. Многостадийность операций на стадии создания рецепторного слоя на основе ПМО также является причиной снижения воспроизводимости анализа. При получении и использовании ПМО макромолекул затруднено их встраивание в матрицу и последующее экстрагирование из нее, что сказывается не только на кинетике взаимодействия, но также влияет на селективность и чувствительность анализа. Поэтому ПМО высокомолекулярных соединений применяются редко не только в пьезокварцевых сенсорах, но и в сенсорах другой природы [123].
Для получения отпечатков макромолекул с использованием матрицы на основе полидиметилсилоксана используется метод софтлитографии [125]. Разработаны полимеры с молекулярными отпечатками бактерий Synechococcus и микроорганизмов [126]. Однако, применение данного способа ограничивается неустойчивостью полидиметилсилоксана в большинстве органических растворителей, используемых для вымывания темплата [116].
Описан золь-гель метод получения химически модифицированных оксидных поверхностей, способных к молекулярному распознаванию, в основе которого лежит реакция поликонденсации алкоксисиланов в порах или на поверхности силикагеля, проводимая в присутствии молекул темплата. Данный метод использован при создании полимеров с молекулярными отпечатками гербицидов [127-128].
Метод электрополимеризации позволяет получать селективные молекулярные отпечатки в структуре полимера непосредственно на поверхности электрода сенсора без длительных предварительных стадий, характерных для метода блочной полимеризации [129-134]. Дополнительными преимуществами данного способа является химическая стабильность электрогенерированных ПМО по отношению к водным и органическим растворителям, прочность связи с металлической поверхностью электрода и высокая воспроизводимость по массе по сравнению с применением ПМО, синтезированных методом блочной полимеризации. Кроме того, при электрохимическом способе возможно контролировать качество покрытия непосредственно в процессе получения.
Как правило, при создании полимерного слоя на основе ПМО базовыми компонентами реакционной смеси являются функциональный мономер и темплат, растворенные в подходящем фоновом электролите. Описаны условия получения электрогенерированных полимеров на основе о-фенилендиамина, анилина, метакриловой кислоты с отпечатками допамина [135], сорбитола [136], атропина [137], нандролона [138], парацетамола, никотина [139] и др. Установлено, что морфология и свойства электросинтезируемых полимерных покрытий зависит от концентрации мономера [141] и природы ионов фонового электролита, поскольку в процессе полимеризации происходит встраивание и освобождение ионов из структуры полимера [140]. Также на процесс полимеризации влияет структура и материал подложки, на которой электроосаждается полимер [140-147].
Однако использование только одного функционального мономера для получения полимерной матрицы может негативно влиять на количество получаемых молекулярных отпечатков, что связано со сложностью встраивания темплата в линейную структуру полимера. В тоже время перспективно электрогенерирование гетерополимерных покрытий на основе функционального мономера, ответственного за формирование линейной структуры полимера, и кросс-мономера, способствующего поперечной сшивке отдельных слоев и «разрыхлению» структуры ПМО, что облегчает процесс встраивания и экстракции молекул темплата. Описан процесс получения покрытий ПМО с применением двух мономеров (о-фенилендиамин и анилин) при создании сенсоров для определения атропина в сыворотке крови человека и урине на уровне 2-Ю"6 М [148]. Однако характеристики слоя ПМО существенно зависят от правильности выбора сополимеров.
Иммобилизация биомолекул на поверхности золотого электрода пьезокварцевого иммуносенсора
Аналитические характеристики пьезокварцевых иммуносенсоров определяются свойствами биорецепторного слоя, такими как доступность активных сайтов распознавания, масса и толщина биослоя, влияющими на чувствительность определения, диапазон определяемых содержаний и устойчивость при эксплуатации в жидких средах и при регенерации.
Для получения селектирующих покрытий хорошо зарекомендовал себя способ ковалентной иммобилизации, включающий нанесение подложки на поверхность золотого электрода пьезокварцевого сенсора и закрепление на ней биомолекул с помощью бифункционального реагента.
Наиболее часто подложки получают путем последовательного нанесения на поверхность электрода раствора реагентов с последующим испарением растворителя. Воспроизводимость получаемых покрытий зависит от точности дозирования объема реагента, условий высушивания. При этом невозможно по стадийно контролировать процесс формирования распознающего слоя, влиять на его характеристики непосредственно на стадии получения.
Перспективным является использование при формировании распознающего слоя тонкопленочной подложки на основе электросинтезируемого полимера. При электрогенерировании полимерных подложек непосредственно на поверхности золотого электрода возможно контролировать массу и толщину покрытия в процессе получения путем изменения потенциала и скорости его развертки [194]. Электрогенерация полиэлектролитных пленок с достаточным количеством поверхностных функциональных групп обеспечивает прочную связь с золотым электродом сенсора, способствует повышению устойчивости биослоя к регенерации, что позволяет осуществить многократное его применение в проточно-инжекционном режиме.
Исследовано влияние режима полимеризации, природы и концентрации фонового электролита на свойства полимерных пленок на основе полианилина и полипиррола. Электрохимическую полимеризацию анилина непосредственно на поверхности золотого электрода пьезокварцевого сенсора осуществляли в потенциодинамическом режиме с линейной и циклической разверткой потенциала со скоростью 10 мВ/с в диапазоне -0,2 -г- 1,4 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения в растворах серной, соляной и хлорной кислот. Изучение методом атомно силовой микроскопии поверхностных характеристик полианилиновых пленок, полученных при потенциодинамическом режиме развертки потенциала (рис. 7), выявило постепенное снижение шероховатости поверхности. Однако покрытие сохраняет неоднородность, поскольку не полностью заполняет поверхность электрода.
Вольтамперограмма в растворе 0,5 М НСЮ4 + 0,2 М СбН5МН2 при синтезе полианилинового покрытия в потенциодинамическом режиме и топография его поверхности Циклический режим развертки потенциала способствует образованию тонкой пленки зеленого цвета, что соответствует преобразованию непроводящей формы лейкоэмеральдина (Л) в проводящую форму соли эмеральдина (сЭ) с дальнейшим переходом в пернигранилин (П) (рис. 8). При обратной развертке на вольтамперограмме присутствуют два пика, соответствующие переходу от пернигранилина к эмеральдину (Э) [189]. Т. ,ІГЛ І jT\ і.
Увеличение количества циклов поляризации приводит к возрастанию массы полимерной пленки и ее толщины (рис. 9) и только при трехкратной развертке потенциала наблюдается образование однородного, равномерного покрытия, полностью закрывающего всю поверхность электрода сенсора и характеризующегося хорошей адгезией к ней. Ra=63±8 нм N=3 т, мкг 100 012 3 4567 N циклов Зависимость массы полианилиновой пленки от числа циклов полимеризации в растворе 0,5 М НСЮ4 Iі При увеличении циклов полимеризации (N 3) образуются пленки с массой превышающей 120 мкг, что может быть причиной сужения диапазона пьезокварцевого микровзвешивания и даже приводить к срыву частоты колебаний пьезокварцевого резонатора.
На поверхностные характеристики и толщину полимерного слоя также существенное влияние оказывает природа фонового электролита (рис. 10). Рассмотрен процесс полимеризации анилина в растворах серной, соляной и хлорной кислот (0,1 М, 0,3 М, 0,5 М). Так, в растворах 0,1 М и 0,3 М серной, соляной и хлорной кислот приращение массы полимера составляет одинаковую величину (20-30 мкг), но существенно различается морфология поверхности полианилинового слоя.
В растворе серной кислоты образуются рыхлые покрытия с невысокой адгезией к поверхности золотого электрода, часть верхнего слоя легко удаляется дистиллированной водой. Напротив использование в качестве фонового электролита 0,5 М растворов хлорной или соляной кислот способствует генерированию сплошных и однородных полимерных слоев. Однако в среде соляной кислоты существенно возрастает масса полимерных пленок, что является причиной срыва частотных колебаний резонатора. Различия в характеристиках полученных покрытий могут быть объяснены с позиций поляронной теории [189], описывающей влияние анион-специфических эффектов в серной и хлорной кислотах на переокисление полианилина: в результате частичной делокализации заряда по фрагменту полимера образуется катион-радикал, называемый поляроном, который при увеличении окисленности полимера переходит в биполярон. Ионы перхлората экранируют биполяроны от нуклеофильного нападения О" -ионов лучше, чем сульфат-ионы, приводящие к деградации полианилина. Кроме того, сульфат-анионы значительно проще встраиваются в структуру полимера, чем перхлорат-анионы. m, мкг 0,3 м неї
Таким образом, только в 0,3 М растворе хлорной кислоты происходит образование полианилиновой пленки минимальной массы и толщины, полностью закрывающей поверхность электрода сенсора
При многократном использовании сенсора после удаления покрытия происходит изменение поверхностных свойств золотого электрода, в частности его шероховатости. На основании экспериментально полученной диаграммы зависимости массы полианилинового слоя от значения токов и потенциалов в первом цикле электрополимеризации было установлено, что для получения покрытия впервые достаточно проведения трех циклов поляризации (значения тока максимальны), при повторном применении сенсора для получения оптимального по своим характеристикам полианилинового слоя необходимо проводить развертку потенциала свыше трех раз в зависимости от кратности возобновления поверхности.
Электрохимический синтез тонкого слоя полипиррола также осуществляли в потенциодинамическом режима с линейной и циклической разверткой потенциала в диапазоне -0,2 В до 0,8 В относительно хлорид-серебряного электрода. Поскольку электронейтральность пленки полипиррола может быть достигнута в результате удаления анионов или внедрения катионов из раствора электролита [195], в качестве фоновых электролитов применяли хлорид, перхлорат натрия, соляную или хлорную кислоты.
Методами атомно-силовой микроскопии и пьезокварцевого микровзвешивания изучены свойства покрытий, полученных электрополимеризацией с линейной разверткой потенциала в присутствии различных фоновых электролитов. Было установлено влияние на массу, толщину и структуру полипиррольной подложки природы и концентрации фонового электролита (синтез осуществлялся в растворах содержащих 0,2 М пиррола). Однако, как и в случае электросинтеза полианилина, при линейной развертке потенциала не удается получить однородный слой, полностью закрывающий всю площадь электрода сенсора.
При циклической развертке потенциала происходит образование однородного полимерного слоя уже на первом цикле развертки потенциала. На циклической вольтамперограмме при синтезе полипиррольного покрытия в растворе, содержащем 0,2 М C4H4NH и 0,1 М NaCl, пики в области потенциала равного 0 В и - 0,1 В соответствуют экстракции/внедрению катиона, что подтверждает участие фонового электролита в процессе окислительно-восстановительных реакций полипиррола [195] (рис. 11). Кроме того, с каждым последующим циклом развертки потенциала увеличивается величина тока, проходящего через электролитическую ячейку, что сопровождается возрастанием массы полимерной пленки, зафиксированной методом пьезокварцевого микровзвешивания.
Иммобилизация биомолекул на поверхности электрода сенсора
На электрополимеризованных подложках, активированных с помощью глутарового альдегида, ковалентно иммобилизовали конъюгаты пенициллина G, ампициллина, хлорамфеникола с BSA и STI, или антитела к окадаиковой кислоте и стафилококковому энтеротоксину А
На свойства распознающего слоя влияет концентрация биомолекул, используемая на стадии иммобилизации, поскольку она определяет количество доступных для связывания с аналитом или антителами «сайтов» распознавания. Критерием выбора оптимальной концентрации гаптен-белкового конъюгата являлся аналитический сигнал сенсора Af, служащий косвенной характеристикой изменения поверхностной концентрация антигенных детерминант (табл. 3, 4).
Максимальный сигнал сенсора зарегистрирован при иммобилизации конъюгата хлорамфеникола и соевого трипсинового ингибитора с концентрацией 5,0 мкг/мл и конъюгатов пенициллинов и бычьевого сывороточного альбумина - 4,0 мкг/мл. Уменьшение или увеличение концентрации приводит к снижению сигнала, что свидетельствует о недостаточном количестве активных «сайтов» связывания или их стерической недоступности для связывания с антителами вследствие их близкого расположения.
Для выбора концентрации специфичных антител экспериментально получены графические зависимости величины аналитического сигнала сенсора от концентрации антител (рис. 14). В области линейной зависимости этих параметров определяли концентрацию антител, соответствующую 50%-ому ингибированию активных центров биорецепторного покрытия пьезокварцевого иммуносенсора. Применение концентрации антител, равной половине линейного участка графика, позволяет достичь оптимального соотношения числа молекул антител, не связавшихся на этапе проведения иммунохимической реакции, и количества активных центров на поверхности иммуносенсора, что положительно сказывается на диапазоне определяемых содержаний с помощью пьезокварцевого сенсора [191].
Установлено, что рабочая концентрация моноклональных антител к хлорамфениколу равна 17 мкг/мл, поликлональной антисыворотки, содержащей антитела к пенициллину G и ампициллину - 2,7 мкг/мл (или разбавление 1/750).
Иммобилизация антител к окадаиковой кислоте на поверхности золотого электрода осуществлялась в три этапа. Для увеличения адгезии рецепторного слоя предварительно формировали подложку на основе у-аминопропилтриэтоксисилана (способ 2) или полипиррола (способ 1 б), поверхность которых активировали глутаровым альдегидом, нанося его в виде раствора (способ 2) или воздействуя парами (способ 1 б), после чего проводили ковалентное закрепление антител.
Изучено влияние концентрации антител, используемых для иммобилизации, на величину Sc, позволяющую дать комплексную оценку равномерности распределения на поверхности биослоя и стерической доступности эпитопов для комплементарного связывания с аналитом (табл.5).
Влияние концентрации антител к окадаикововй кислоте и способа иммобилизации на концентрационную чувствительность (Sc) и устойчивость биослоя (N)
При применении раствора антител с разведением 1/2000 в обоих способах иммобилизации достигаются оптимальные совокупные характеристики покрытия сенсора (S„ N). На таких покрытиях возможно проведение до 12-14 циклов измерений. В тоже время, иммобилизация антител на полипиррольную подложку предпочтительнее, поскольку в этом случае регистрируются более высокие значения аналитического сигнала (Sc=6,0 Гц мл нг"! и N=14).
Иммобилизацию антител к стафилококковому энтеротоксину А осуществляли на подложку из у-аминопропилтриэтоксисилана (способ 2), полипиррола (способ 1 б) или путем включения антител в полипиррольную пленку на стадии электросинтеза, вводя антитела на втором цикле полимеризации (способ 3). Применение высоких концентраций антител (свыше 25 мкг/мл) приводит к высокой плотности эпитопов на поверхности электрода сенсора, что является причиной стерических затруднений при иммунохимическом взаимодействии SEA с биорецепторным слоем и, как следствие, приводит к снижению значения аналитического сигнала (табл. 6). Концентрация антител ниже 10 мкг/мл не обеспечивает достаточного количества поверхностных сайтов связывания, что также негативно сказывается на величине аналитического сигнала сенсора. Иммобилизация 10 мкг/мл антител к стафилоккоковому энтеротоксину А способами 1 б и 2 является оптимальной, поскольку способствует образованию биослоя с высокой плотностью стерически доступных сайтов распознавания, увеличению интегральной концентрационной чувствительности сенсора и повышению воспроизводимости аналитического сигнала. Более высокие значения Sc и N отмечены при закреплении антител на электрополимеризованной пленке полипиррола (табл. 6).
Применение частиц полимеров с молекулярными отпечатками в пьезокварцевых сенсорах
Пьезокварцевые иммуно- и ПМО-сенсоры апробированы при определении антибиотиков и токсинов в пищевой продукции животного происхождения: хлорамфеникола - в мясе, молоке, яйцах и меде, пенициллинов и стафилоккокового энтеротоксина А - в мясе и молоке, окадаиковой кислоты - в морепродуктах.
Использование хлорамфеникола в ветеринарии запрещено в ряде стран ЕС (в РФ МДУ Сар в мясе - 0,01 мг/кг, в яйцах - 0,003 мг/кг, не допускается наличие Сар в продуктах детского питания). Однако его продолжают использовать для лечения инфекционных заболеваний крупного рогатого скота и домашней птицы, поскольку он эффективен в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Необходимость определения хлорамфеникола вызвана его аккумулированием в пищевой продукции, что приводит к аллергическим реакциям, нарушению обмена веществ, дисбактериозу, возникновению резистентности у человека.
Детектирование хлорамфеникола в мясе, меде и яйцах проводили после его извлечения фосфатным буферным раствором и центрифугирования, в молоке - в надосадочной жидкости после осаждения белков сульфатом аммония. В пробу перед анализом вводили известную концентрацию антибиотика и фиксировали содержание хлорамфеникола с учетом полученного значения аналитического сигнала. Определение осуществляли в конкурентном формате анализа (табл. 18) методом градуировочного графика. Таблица 18. Определение хлорамфеникола в мясе, молоке, яйцах и меде (п=3, Р=0,95)
Пенициллины являются самыми малотоксичными из всех антибиотиков, но вследствие их быстрого выведения из организма, дозы, назначаемые при лечении животных, многократно превышают уровни других антибиотиков, что является причиной их высоких остаточных концентраций в продуктах животноводства, в результате чего возможно возникновение аллергической реакций, резистентности микроорганизмов и общего снижения иммунитета у потребителей мясной и молочной продукции. Кроме того пенициллины широко применяются для консервации мяса и молока с целью увеличения срока их хранения. Пьезокварцевые иммуно- и ПМО сенсоры апробированы для определения ампициллина и пенициллина G в пищевой продукции (табл. 19, 20).
Во всех проанализированных пробах выявлено присутствие пенициллинов в концентрациях не превышающих МДУ (0,10 мг/кг).
Сопоставление стандартных отклонений серий измерений при определении пенициллина G с помощью иммуно- и ПМО-сенсоров (табл. 20) с применением критерия Фишера показало отсутствие значимого различия в воспроизводимости результатов, т.е. их случайные погрешности имеют один порядок. А сравнение средних результатов измерений с помощью иммуно- и ПМО сенсоров с применением критерия Стьюдента подтвердило незначимость расхождений между ними. Следовательно, для определения пенициллинов в пищевой продукции можно равнозначно использовать и иммуно- и ПМО-сенсоры.
Пьезокварцевые иммуносенсоры апробированы для определения природных токсинов в пищевой продукции: окадаиковои кислоты в креветках и кальмарах, стафилококкового энтеротоксина A (SEA) в мясе и молоке. Определение осуществлялось в прямом формате иммуноанализа (табл. 21). Окадаиковая кислота (диарейный яд), относится к наиболее токсичным фикотоксинам, может присутствовать в моллюсках (мидии, устрицы, морские гребешки), крабах, омарах, кальмарах и некоторых видах шельфовых рыб и стать причиной отравления [197]. В техническом регламенте Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" для рыбы, нерыбных объектов промысла и продуктов, вырабатываемых из них, предельное содержание окадаиковой кислоты установлено на уровне 0,16 мг/кг [198].
Частой причиной отравлений является попадание в организм человека патогенных бактерий Staphylococcus aureus, продуцирующих стафилококковый энтеротоксин А (летальная доза менее 100 нг) [77].
Правильность определения природных токсинов подтверждена методами математической статистики с применением теста Стьюдента. Таким образом, с помощью пьезокварцевых иммуно- и ПМО-сенсоров возможно проводить определение следовых концентраций хлорамфеникола, пенициллинов, окадаиковой кислоты и стафилококкового энтеротоксина А на уровне ПДК/МДУ и ниже. Разработанные сенсоры могут быть рекомендованы для применения в лабораториях, контролирующих качество пищевой продукции.
