Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика аминогликозидов 11
1.2. Методы определения аминогликозидных антибиотиков 17
1.2.1. Микробиологические методы 17
1.2.2. Спектрофотометрические методы 18
1.2.3. Электрохимические методы 20
1.2.4. Хроматографические, в том числе электрофоретические методы. 22
1.3. Координационные свойства аминогликозидов 29
1.4. Использование приемов дериватизации для определения веществ 37
Резюме 39
1.5. Цели и задачи 42
2. Экспериментальная часть 43
2.1. Реагенты и растворы 43
2.2. Аппаратура 44
2.3. Методики 47
2.3.1. Ионометрия 47
2.3.2. Спектрофотометрия в видимой и УФ-области 48
2.3.3. ИК спектрометрия 49
2.3.4. Вольтамперометрия на ГРДНРЭ 49
3. Результаты и их обсуждение 50
3.1. Определение гентамицина и его комплекса 53
3.1.1. Спектрофотометрия 53
3.1.2. ИК - Спектроскопия 59
3.1.3. Вольтамперометрия на ГРДНРЭ 64
3.1.4. Ионометрия 68
3.2. Определение стрептомицина и его комплекса 73
3.2.1. Ионометрия 74
3.3. Определение канамицинаи его комплекса 77
3.3.1. Ионометрия 79
3.4. Определение амикацина и его комплекса 82
3.4.1. Ионометрия 83
3.4.2. Вольтамперометрия 87
4. Практическое применение разработанных электрохимических методов для определения аминогликозидных антибиотиков 88
4.1. Потенциометрическое определение гентамицина в ампульпых растворах 89
4.2. Потенциометрическое определение свободного гентамицина и амикацина в наносомальной лекарственной форме 91
4.3. Вольтамперометрическое определение свободного гентамицина в наносомальной лекарственной форме 94
Выводы 96
Литература 98
- Методы определения аминогликозидных антибиотиков
- Спектрофотометрия в видимой и УФ-области
- Определение стрептомицина и его комплекса
- Потенциометрическое определение свободного гентамицина и амикацина в наносомальной лекарственной форме
Введение к работе
Актуальность темы. Аналитическая химия биологически активных соединений (БАС) является приоритетной областью развития современной аналитической химии. К БАС относится ряд классов органических соединений, среди которых выделяются антибиотики - это группа природных или полусинтетических органических веществ, способных разрушать микробы или подавлять их размножение. С развитием фармацевтической науки ежегодно появляются 30-40 новых лекарственных препаратов. В настоящее время в мире зарегистрировано более 10000 лекарственных веществ (ЛВ) и свыше 100000 лекарственных форм. В связи со все возрастающим количеством новых ЛВ актуальна проблема их идентификации и определения как в отдельных пробах (in vitro), так и в живых организмах (in vivo). Определение антибиотиков -важная задача в медицине, фармацевтической и пищевой промышленности.
Аминогликозиды являются группой антибиотиков широкого спектра действия; они обладают специфической ото- и нефротоксичностью, а также способностью угнетать дыхание вплоть до развития мышечной блокады. И, тем не менее, в настоящее время они занимают ведущее место в лечении тяжелых инфекционно-воспалительных заболеваний. Однако успешное применение этих препаратов из-за низкого терапевтического индекса возможно лишь при строгом контроле их концентраций в крови, поэтому в большинстве случаев необходим терапевтический лекарственный мониторинг.
Подавляющее большинство методов определения антибиотиков основано на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эти методы весьма дороги и не всегда доступны. Существует потребность в разработке
Диссертант выражает особую благодарность д.х.н. проф. Петрухину Олегу Митрофановичу за помощь в обсуждении результатов данной работы.
более простых и доступных методов определения антибиотиков, например, электрохимических - ионометрических и вольтамперометрических. Простота и доступность аппаратуры, экспрессность анализа способствуют внедрению этих методов в различные области химии, медицины, биологии. При помощи ионселективных электродов (ИСЭ) определяют различные биологически активные органические вещества и лекарственные препараты. В этом случае в качестве электродноактивного соединения (ЭАС) обычно применяют сложные биомолекулы (ферменты) или простые ион-парные реагенты. Первые часто неустойчивы и дороги, хотя обеспечивают высокую селективность; со вторыми ситуация в точности обратная. Для разработки селективных и чувствительных потенциометрических и амперометрических ИСЭ весьма перспективным может оказаться подход, основанный на дериватизации определяемого антибиотика, например на переведении антибиотика в комплекс с металлом и последующем использовании ионного ассоциата (ПА) (комплекса с гидрофобным противоионом) в качестве ЭАС.
Кроме того, представляет интерес изучение процессов, протекающих на границе раздела жидкость / жидкость. С одной стороны, это возможность моделирования процессов, протекающих в ионселективных электродах с жидкостными мембранами. С другой стороны, информация об этих процессах позволяет конструировать новое поколение электрохимических сенсоров. Для изучения реакций переноса в двухфазных гетерогенных системах используют метод вольтамперометрии на границе раздела двух несмешивающихся растворов электролитов (ГРДНРЭ).
Таким образом, разработка электрохимических методов анализа определения антибиотиков, в частности аминогликозидов, является актуальной задачей.
Цель работы - изучение возможности применения приема дериватизации аминогликозидных антибиотиков медью(П) для потенциометрического и
вольтамперометрического определения ЛВ; выявление закономерностей потенциометрического отклика мембран в зависимости от природы ИА, используемого в качестве ЭАС и условий эксперимента. Постановка задачи подразумевала необходимость исследования комплексообразования аминогликозидов с медью(П) методом спектрофотометрии и подтверждения наличия комплекса в полимерной матрице мембраны методом ИК-Фурье спектроскопии.
Практическая цель - разработка экспрессных и доступных (простых) электрохимических методик определения аминогликозидных антибиотиков в реальных объектах.
Научная новизна.
- Предложено использовать реакцию комплексообразования
аминогликозидов с медью(П) в качестве реакции дериватизации для
последующего определения антибиотика методами ионометрии и
вольтамперометрии на ГРДНРЭ.
- Методом спектрофотометрии установлена стехиометрия комплекса
гентамицина (ГНМЦ) с медью(П) состава 1:1. Наличие комплекса в мембране
ИСЭ подтверждено методом ИК-Фурье спектроскопии.
Методом вольтамперометрии на ГРДНРЭ изучен перенос ГНМЦ и его комплекса с медью(П).
Исследованы потенциометрические свойства мембран, где в качестве ЭАС использовали ИА, образованный комплексом меди(П) с аминогликозидом и различными гидрофобными противоионами; проведено сравнение с ИСЭ на основе ИА с немодифицированным антибиотиком. Установлено, что при дериватизации антибиотика медью(П) наклон электродной функции соответствует теоретическому нернстовскому для положительной двухзарядной частицы, расширяется диапазон определяемых концентраций по сравнению с немодифицированным антибиотиком, снижается предел обнаружения.
Разработаны ИСЭ и методики для потенциометрического определения свободного ГНМЦ и амикацина (АМКЦ) в наносомальной лекарственной форме, ГНМЦ в ампульных лекарственных растворах.
Показана возможность вольтамперометрического определения ГНМЦ в виде его комплекса с медью(П).
Практическая значимость работы.
Разработаны ИСЭ и предложен оптимальный состав мембранной композиции для определения аминогликозидных антибиотиков. Разработанные датчики применены для экспрессного определения ЛВ в реальных объектах.
Показана возможность и выбраны условия использования метода вольтамперометрии на ГРДНРЭ как метода определения антибиотиков.
На защиту выносятся:
- результаты исследования комплексообразования ГНМЦ с медью(П)
методами спектрофотометрии и ИК-Фурье спектроскопии;
- результаты изучения переноса ГНМЦ и его комплекса с медью(П) через
границу раздела вода / о-нитрофенилоктиловый эфир (о-НФОЭ);
результаты изучения потенциометрического поведения электродов на основе ИА ГНМЦ, стрептомицина (СТРЦ), канамицина (КНМЦ) и АМКЦ как с тетрафенилборатом натрия (ТФБ), так и его галогенопроизводными: тетра-«-хлорфенилборатом калия (ТХФБ) и тетра-«-фторфенилборатом калия (ТФФБ);
результаты изучения потенциометрического поведения электродов на основе ИА, образованных комплексами ГНМЦ, СТРЦ, КНМЦ, АМКЦ с медью(П) и гидрофобными противоионами: ТФБ, ТХФБ, ТФФБ;
практическое аналитическое применение ИСЭ для определения ГНМЦ и АМКЦ (ГНМЦ в ампульном лекарственном растворе, а также ГНМЦ и АМКЦ в наносомальной лекарственной форме).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 1 главы литературного обзора, 3 глав экспериментальной части, выводов и перечня
Методы определения аминогликозидных антибиотиков
В 1929 году Флемингом был открыт новый препарат пенициллин, который только в 1940 году удалось выделить в кристаллическом виде. Получение этого препарата открыло эру веществ микробного происхождения - антибиотиков. С получением пенициллина как препарата возникло направление в науке - учение об антибиотиках [3].
Аминогликозиды являются группой антибактериальных препаратов, широко используемых в клинической практике для лечения инфекционных болезней. Характерной химической особенностью антибиотиков данной группы является наличие в их молекулах общих структурных элементов - аминосахаров, соединенных гликозидной связью с агликановым фрагментом. Все эти антибиотики включают в качестве структурного элемента 2-дезоксистрептамин.
В настоящее время, аминогликозиды по-прежнему являются важной группой лекарственных средств, широко используемых в терапии разнообразных инфекций, несмотря на большой арсенал антибактериальных препаратов.
Различают 3 поколения аминогликозидов. Аминогликозиды первого поколения - стрептомицин, неомицин, канамицин и мономицин - вследствие их токсичности применяют только для терапии специфических инфекций (туберкулез, зоозные и особо опасные инфекции). Основное клиническое значение имеют аминогликозиды второго и третьего поколений. Ко второму поколению аминогликозидов относят гентамицин, тобрамицин, сизомицин и нетилмицин. В третье поколение аминогликозидов входят амикацин и исепамицин. Спектр их активности включает аэробные грамотрицательные бактерии: представители семейства Enterobacteriaceae, Acinetobacter spp. и Pseudomonas spp. Поэтому они применяются для лечения тяжелых системных, в том числе нозокомиальных, инфекций [4]. 1.1. Характеристика аминогликозидов
Свою историю данная группа отсчитывает с 50-х годов, когда появился стрептомицин. Затем были созданы мономицин, канамицин и др. В настоящее время некоторые из препаратов этой группы уже не используются. Стрептомицин и канамицин применяются сейчас только во фтизиатрии и входят в некоторые схемы лечения как одна из составляющих.
С течением времени были созданы препараты второго поколения этой группы, такие как гентамицин, тобрамицин, а затем третьего поколения. Наиболее активным в лечении бактериальных инфекций из препаратов нового поколения можно назвать амикацин [5].
Стрептомицин — исторически первый антибиотик группы аминогликозидов и первый, оказавшийся активным против туберкулёза, был открыт после пенициллина Зельманом Ваксманом. Актиномицет {Streptomyces), образующий стрептомицин, впервые выделен в лаборатории микробиологии Ратжерского университета в 1943 г.
В 1949 г. 3. Ваксман и X. Лешевалье из культуры Streptomyces fradiae, выделили широкоспектровый антибиотик неомицин. Он обладает широким спектром антибактериального действия. Неомицин - является комплексом антибиотиков (неомицин А, неомицин В, неомицин С); эффективен в отношении ряда грамположительных (стафилококки, пневмококки и др.) и грамотрицательных (кишечная палочка, палочка дизентерии, протей и др.) микроорганизмов. Его антимикробный спектр сходен со спектром стрептомицина.
В 1957 г. X. Умезаева и сотр. описали антибиотик канамицин, образуемый. Streptomyces kanamyceticus. Позднее было установлено, что в состав канамицина входит 3 антибиотика А, В и С.
По биологическим свойствам канамицин А сходен со стрептомицином и неомицинами. Молекула канамицина состоит из центрального дезоксистрептаминового кольца и двух аминоуглеводных колец, прикрепленных к центральному кольцу гликозидными связями в положении 4 и 6. Он включает в себя 5 аминогрупп. Применяется в медицине в качестве противотуберкулезного препарата, для борьбы со стафилококковыми заболеваниями, а также для лечения сибирской язвы, гонореи и других инфекций.
Гентамицины (Сь Cia, С2, С2а) производятся культурой Micromonospora purpurea. Гентамицин - аминогликозидный антибиотик, который был выделен более чем 50 лет назад. Его до сих пор используют в клинической практике, несмотря на его неблагоприятное влияние на почечную функцию, слух и вестибулярный аппарат.
Данный антибиотик обладает широким спектром биологического действия; он подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе Proteus, Rseudomonas. Он часто используется в медицинской практике при лечении тяжелых гнойных инфекций.
Тобрамицин, выделяемый бактериями Streptomyces tenebrarius, впервые выделен в 1967 г. К. Хиггенсом и Р. Кастнером. Является аминогликозидным антибиотиком широкого спектра действия против грамположительных и некоторых аэробных грамотрицательных бактерий. По спектру антимикробного действия аналогичен гентамицину.
В 1972 г. получена химическая модификация канамицина - амикацин -полусинтетический антибиотик, подавляющий рост патогенных бактерий, чувствительных и резистентных к канамицину, гентамицину и другим аминогликозидам.
Сизомицин - один из перспективных антибиотиков, относящихся к группе аминогликозидов, образуемый культурой Micromonospora inyoensis, и обладает широким спектром антимикробного действия. По строению сизомицин относят к группе гентамицина. Его антибиотическая активность аналогична гентамицину, однако последний менее активен в отношении ряда микробов.
Спектрофотометрия в видимой и УФ-области
Аминогликозидные антибиотики разделяют с использованием различных методов: хроматографических [43], капиллярного электрофореза [47, 57, 58], а также микробиологических [6]; в качестве детекторов применяют электрохимические датчики.
В основном аминогликозиды определяют методом ВЭЖХ. Так в работе [32] разработан быстрый и простой способ для разделения и прямого определения ГНМЦ с масс-спектрометрическим детектором. Также метод ВЭЖХ широко используется для выделения антибиотиков - аминогликозидов в виде индивидуальных соединений и определения их в биологических жидкостях [33]. Аминогликозидные антибиотики не-обладают флуоресценцией и не поглощают в УФ области. Для детектирования аминогликозидов используют реакции комплексообразования с реагентами, имеющими группировки, способные поглощать в УФ области (1-фтор-2,4-динитробензол), либо обладающие способностью к флуоресценции (флуорескамин, дансилхлорид, офталевый ангидрид), при этом белки сыворотки крови отделяют осаждением. Градуировочный график линеен в пределах 0,5 - 66 мкг/мл. Метод позволяет определить 0,5-1 мкг/мл антибиотика в 25-50 мкл сыворотки [33].
Метод ВЭЖХ использовался в работах [34] для количественного определения тобрамицина. Для его определения предварительно проводят комплексообразование с динитрофенилом и получают 2,4-динитрофенильные производные (ДНФ) по свободным аминогруппам антибиотиков. Образующиеся в результате реакции ДНФ-производные аминогликозидов обладают высоким светопоглощением при А,=350 нм, что позволяет использовать для их определения УФ-детектор. Разделение проводили на колонке Spherisorb Сб, в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетона с трисбуфером (рН 7,0). Метод дает воспроизводимые результаты и позволяет определять степень чистоты стандартных препаратов тобрамицина [34].
Определение антибиотика парамомицина возможно методом обратнофазной ВЭЖХ с УФ - детектированием при А,=350 нм. Градуировочный график линеен в интервале 0,5-50 мкг/мл плазмы [35].
В работе [36] предложено хроматографическое определение АМКЦ в ампульыых растворах. Предварительно синтезировали производное АМКЦ с 1-нафтоилхлоридом в среде пиридина при 30С в течение 1 часа. Полученное производное в виде раствора в MeCN количественно определяли методом ВЭЖХ с УФ-фотометрическим детектированием при =295 нм. Градуировочный график линеен в интервале 17-170 нмоль/мл АМКЦ; предел обнаружения составляет 5 нмоль/л; Sr 0,02 [36].
Метод ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием был применен в работе [37] для определения антибиотиков сизомицина и нетилмицина в цельной крови, сыворотке и плазме крови с предварительным синтезом их производных с о-фталевым альдегидом.
В [38] разработан специфический метод для измерения ГНМЦ в плазме с помощью жидкостной хроматографии при высоком давлении. В 0,2 мл плазмы образца можно достаточно точно измерить 1 мкг/мл ГНМЦ, а также разделить ГНМЦ на его формы Cia+C2, С\. Данный метод применим и для определения ГНМЦ в моче.
Описано применение ВЭЖХ [39] для количественного определения ГНМЦ в сыворотке крови. Антибиотик отделяли от сыворотки с использованием колонки с кремниевой кислотой, обработанной офталевым альдегидом и элюировали этанолом. Дериватизированный ГНМЦ разделяли на три его главных компонента: С\, С1а, Сг и количественно определяли флуориметрически. Калибровочный график линеен в диапазоне 0-20 мкг ГНМЦ на мл сыворотки крови. Концентрацию в крови ниже 0,5 мкг ГНМЦ на мл можно определить с большой точностью. Такие антибиотики как тобрамицин, АМКЦ, ампициллин, пенициллин G, метициллин, карбенициллин, хлорамфеникол, клиндамицин и цефалотин не мешают определению ГНМЦ.
Предложено определение разных форм ГНМЦ: Сь Сіа, С2, в плазме и моче методом ВЭЖХ. Отклик детектора линеен до 50 мкг/мл индивидуальных компонентов. Для формы Сі нижний предел обнаружения — 0,07 мкг/мл и. 0,1 мкг/мл для форм С1а и С2. Восстановление ГНМЦ из плазмы составило 72% и 98% из мочи. Этот метод отработан для анализа человеческой и собачьей плазмы и мочи [40].
Рассмотрен, метод обратнофазной жидкостной хроматографии для анализа аминогликозидных антибиотиков, при использовании предколоночной дериватизации антибиотика фенилизоцианатом. Градуировочный график линеен в диапазоне от 5 до 50 мкг/мл для таких антибиотиков как КНМЦ, неомицин и ГНМЦ. Этот метод показал хорошую специфичность, точность, воспроизводимость [41].
В работе [42] разработан и- аттестован метод жидкостной хроматографии с термораспыл яющим детектором (температура испарения 50С и давление Збар, в качестве газа переносчика использовали азот) для количественного определения компонентов ГНМЦ и КНМЦ в их лекарственной форме. КНМЦ и четыре компонента ГНМЦ элюировались. через 3,2; 4,6; 5,9; 7,1 мин соответственно с хорошим разрешением. Логарифмический градуировочный график дляобщего содержания ТНМЦ линеен в пределах 35-240 мг/мл.
Проведено разделение составных компонентов ГНМЦ методом жидкостной ионпарной хроматографии с использованием полистиролдивинилбензола в качестве стационарной фазы с импульсным электрохимическим детектированием [43]. В качестве рабочего использовали золотой электрод диаметром 3 мм, хлоридсеребряный — в. качестве электрода сравнения. Данный способ позволяет разделить ГНМЦ на пять компонентов, однако, при использовании импульсного электрохимического детектора требуется опыт экспериментатора для получения воспроизводимых результатов. В то же время представленный метод достаточно чувствителен к компонентам ГНМЦ без дериватизации.
Также предложен метод для определения ГНМЦ в сточных водах больниц с использованием ионпарной ВЭЖХ с электрораспылением в тандеме с масс-спектрометрией. Предел обнаружения данного метода составил 0,20 мкг/мл в сточных водах, диапазон возможного измерения антибиотика от 0,4 до 7,6 мкг/мл [44].
Предложено количественное определение ГНМЦ высокоэффективной жидкостной хроматографией в агаре Мюллер - Хинтона, а также изучено влияние матрицы агара на диффузию ГНМЦ в данной среде. После процедуры разделения аминогликозид детектировали при 365 нм после его дериватизации 1-фтор-2,4-динитробензолом [45].
Помимо разработки хроматографических методов анализа, также разрабатываются более современные электрофоретические методы, которые отличаются уменьшением времени анализа, большей точностью и возможностью разделения веществ на большее число компонентов.
Авторами [46] показана возможность идентификации и разделения двенадцати аминогликозидных антибиотиков. Анализ проводят, используя капиллярный электрофорез при прямом УФ детектировании. Количественное определение дигидрострептомицина и СТРЦ было осуществлено в 160 мМ растворе тетрабората натрия с линейностью градуировочного графика в диапазоне 0,05—1,0 мг/мл. Количественное определение также продемонстрировано для таких соединений, как АМКЦ, беканамицин, канамицин А и тобрамицин, с использованием сизомицина в качестве внутреннего стандарта. Воспроизводимость метода 2-3%. Эти исследования показывают возможность использования капиллярного электрофореза для идентификации и количественного определения аминогликозидов как потенциальной альтернативы методу, предложенному в Фармакопее США.
Определение стрептомицина и его комплекса
В настоящее время аминогликозидные антибиотики широко применяют при лечении туберкулеза и ряда других тяжелых инфекций. Наряду с высокой эффективностью, антибиотики имеют ряд существенных недостатков. Попадая в продукты животноводства, они могут стать причиной интоксикации, опасной для здоровья человека. Поэтому важен строгий контроль при определении лекарственных препаратов на соответствие фармакопейным или иным аналогичным стандартам, в оценке их остаточных количеств в продуктах питания и сточных водах предприятий-производителей [23].
Для решения задачи определения соединений этого типа необходимы различные методы анализа, различающиеся в зависимости от класса определяемых веществ, объектов анализа, стоимости оборудования и его обслуживания.
Одним из простых и доступных методов, является ионометрия, которая позволяет определять содержание лекарственных веществ в готовых лекарственных формах. Развитие прикладной ионометрии на современном этапе .требует расширения как теоретических исследований, направленных на выяснение природы селективности электродных мембран, так и на поиски новых путей их синтеза и приемов модификации для получения более совершенной структурной организации и расширения функциональных свойств [25].
Ионометрическим методом определяют широкий круг неорганических соединений, используя комплексообразование с органическими реагентами. Опубликовано много работ по использованию подандов в качестве нейтральных переносчиков в мембранах ИСЭ на катионы щелочных, щелочноземельных и др. металлов. В то же время число ИСЭ для определения органических молекул весьма ограничено. Особенно трудно определять ионометрически сравнительно гидрофильные соединения, содержащие несколько полярных групп -аминоуглеводы (например, аминогликозидные антибиотики). Часто для улучшения потенциометрического отклика на органические катионы приходится вводить в мембрану липофильную ионогенную добавку, что может повышать селективность определения [81].
Как известно, аминогликозидные антибиотики являются гидрофильными соединениями [86], поэтому нам представляется перспективным введение в ЭАС катиона металла (в данной работе медь(П)) для гидрофобизации молекулы антибиотика, предотвращения вымывания ЭАС из фазы мембраны и улучшения характеристик ИСЭ.
Каждый антибиотик аминогликозидного ряда, обладая такими комплексообразующими группировками, как -ОН, -NH2, может образовывать комплексы с переходными металлами Mz+. При введении ионов таких металлов в водную фазу, содержащую определяемый аминогликозид, возможно образование комплексов различной степени протонированности [66, 68-72]. При этом функциональные группы, обеспечивающие высокую гидрофильность исследуемого антибиотика «блокируются» за счет образования донорно-акцепторных и ковалентных связей с ионами металла. Можно предположить, что введение ионов переходных металлов в водную фазу, содержащую аминогликозид, приведет к образованию комплекса более гидрофобного, чем определяемый антибиотик.
Учитывая также стереохимическую подвижность подобных ненасыщенных структур можно предполагать, что молекулы аминогликозидов будут образовывать стереохимические изомеры, соответствующие требованиям координационной структуры металла — комплексообразователя. Образование комплекса металла с органическим реагентом изменяет свойства как катиона металла, так и свойства лиганда. Глубина этих изменений определяется степенью перераспределения электронной плотности при образовании комплекса, которая, в свою очередь, определяется как свойствами центрального атома комплекса (ц.а.) так и свойствами донорньгх атомов (д.а.) лиганда. Ц.а. комплекса, как правило, меняет свое координационное окружение и, соответственно, характер связи с д.а. лигандов. Стереохимия ц.а. меди(И) чрезвычайно разнообразна: анализ стереохимии неорганических соединений меди (II) позволяет выделить квадратно-плоскостные (к.ч. 4), октаэдрические (к.ч. 6) и тетрагональные (к.ч. 4) комплексы. Необходимо подчеркнуть, что здесь перечислены только канонические структуры. Структуры реальных соединений могут изменяться за счет изменения формы полиэдра и длин связей центрального атома с донорными атомами и, соответственно, энергий связей [87].
В настоящее время исследованы комплексы металлов со многими БАС. Близкими к аминогликозидам по комплексообразующим свойствам являются аминокислоты и пептиды. Электронодонорные свойства кислорода пептидной группы гораздо слабее электронодонорных свойств пептидного азота; в то же время, пептидный азот образует связь с ц.а. комплекса только после того как диссоциирует гидроксильная группа пептида. Комплексообразование пептидов исследовано с катионами многих металлов, интересно, что и в этом случае работает гипотеза жестких и мягких кислот и оснований (ЖМКО) Пирсона [87].
Электронное строение и свойства реакционной пептидной группы отражаются строением ее следующих канонических групп:
Приведенные структуры пептидной группы с чередованием простых и двойных связей — это лишь грубая схема. На самом деле валентная электронная плотность свободно «переливается» в поле ядер, и именно поэтому пептидная группа как своеобразный реакционный центр обеспечивает возможность комплексообразования пептидов с любыми металлами.
Можно было ожидать, что при использовании комплекса аминогликозидов с медью(П) в качестве аналитической формы в результате «блокировки» гидрофильных групп появится возможность их определения методом вольтамперометрии на ГРДНРЭ, а также улучшатся аналитические характеристики потенциометрических ИСЭ на основе ИА с комплексами антибиотиков.
Помимо приема дериватизации ЭАС в селективных мембранах также важным является подбор гидрофобного противоиона: поэтому были исследованы ТФБ и его галогенопроизводные.
Для проведения электрохимических испытаний важно было исследовать образующийся комплекс металла с антибиотиком, а также подтвердить наличие этого комплекса в фазе самой мембраны. В связи с этим на примере ГНМЦ спектрофотометрически в водных растворах было изучено комплексообразование антибиотика с медью(П), а затем методом ИК-Фурье спектрометрии было исследовано наличие комплекса, в фазе мембраны. В табл.2 приведены данные, необходимые при обсуждении полученных экспериментальных результатов: структурная формула ГНМЦ и его комплекса с медью(П), зависимость степени протонированности комплекса от рН, а также, константы протонирования ГНМЦ и константы устойчивости его комплексов с медыо(И) в зависимости от степени их протонирования [66].
Предварительно было изучено комплексообразование ГНМЦ с медью(П) в водных растворах спектрофотометрическим методом. ГНМЦ имеет максимум поглощения при Я =240 нм; в своей структуре не имеет ни сильных хромофорных групп, ни систем сопряжения (табл.2-а). Молярный коэффициент поглощения, определенный при этой длине волны составляет (3,2 ± 0,5) х Ю3. Известно, что для увеличения чувствительности определения используют реакции комплексообразования, обычно для определения катионов металлов. Таблица 2. Структурная формула гентамщина (а), его комплекса с медью(II) (б), зависимость степени протонированности комплексов гентамицина с медъю(П) от рН (в), константы устойчивости комплексов гентаміщина с медью(П) (г), константы протонирования для гентамщина (д).
Потенциометрическое определение свободного гентамицина и амикацина в наносомальной лекарственной форме
Отметим, что дериватизация антибиотика медью(П) в ЭАС расширяет верхний диапазон определяемых концентраций. Наклон электродной функции, где в качестве противоиона использовали ТФБ, значительно ниже теоретического наклона для положительной двухзаряднои частицы, тогда как в случае с ТФФБ крутизна электродной функции оказалась выше теоретического наклона для положительной двухзаряднои частицы. Вероятно, в данном случае в зависимости от природы противоиона влияние рН на протонирование аминогрупп СТРЦ сказывается в гораздо большей степени, чем для ГНМЦ. Об этом свидетельствует и зависимость электродной функции от кислотности .среды (рис.23). Горизонтальный участок на данной зависимости отсутствует, что косвенно указывает на изменение степени протонирования комплекса в ИА и, следовательно, на возможное изменение заряда катиона в ИА. Для работы с такими электродами требуется стабилизация кислотности раствора.
Рис.23. Влияние pH на электродный потенциал ИСЭ на основе ионного .ассоциата, образованного комплексом СТРЦ с медъю(П) с ТФФБ, Сстрц-си(іі)—№ М Исследована потенциометрическая селективность ИСЭ, где в качестве ЭАС применены ИА на основе комплекса антибиотика и меди(П) с различными противоионами (табл.11).
Как видно из таблицы, коэффициенты селективности к КНМЦ и АМКЦ близки к единице, что свидетельствует о возможности ионометрического определения лишь индивидуальных антибиотиков или их суммарного содержания.
В табл.12 приведены данные, необходимые при обсуждении полученных экспериментальных результатов: структурная формула КНМЦ, зависимость степени протонированности комплекса от рН, а также, константы протонирования ГНМЦ и константы устойчивости его комплексов с медью(И) в зависимости от степени их протонирования [70].
Канамицин [96] по своей химической структуре подобен гентамицину. Его определяют методами ион-эксклюзионной хроматографии [98-99], обратно-фазной жидкостной хроматографии после предколоночной дериватизации [100], колориметрией после дериватизации нингидрином [99], а также спектро Таблица 12
Структурная формула канамицина (а), зависимость степени протонированности комплексов канамицина с медъю(П) от рН (б), константы устойчивости комплексов каналгицина В с медъю(П) (в), константы протонирования для канамицина В (г). фотометрией [101]. Тонкослойная хроматография была впервые предложена как полуколичественный метод для определения КНМЦ в сыворотке крови и моче [102]. Также этот метод используют для определения канамицина В в КНМЦ согласно Европейской Фармакопее [103].
Все вышеперечисленные способы являются достаточно трудоемкими, тогда как одним из простых и доступных методов является ионометрия, которая позволяет определять содержание ЛВ в готовых лекарственных формах, промышленном химико-фармацевтическом сырье и полупродуктах и в ряде других объектов с помощью ИСЭ. 3.3.1 Ионометрия
Были разработаны КНМЦ-селективные мембраны и проведены исследования потенциометрических характеристик ИСЭ, где в качестве ЭАС применяли как ИА КНМЦ-противоион, так и ИА, образованные комплексом КНМЦ с медью(И) и противоионами: ТФБ, ТХФБ, ТФФБ.
Электродные характеристики ПВХ-пластифицированных мембран в растворах КНМЦ приведены в табл.13.
Все мембраны проявляют катионный отклик в растворах КНМЦ. Крутизна электродных функций изменяется от 12 до 20 мВ/рс, что, также как в и предыдущих случаях, свидетельствует о сосуществовании нескольких различных протонированных форм антибиотиков (табл.12-г). Наклоны в ряду противоионов ТФБ ТХФБ ТФФБ возрастают, что, по-видимому, связано с природой противоиона и влиянием кислотности среды. В то же время, полученные характеристики для КНМЦ-селективных электродов не являются удовлетворительными, поэтому мы перешли к исследованию ИСЭ на основе ИА, образованных комплексом КНМЦ с медью(П) и противоионами.
Введение меди(П) в ЭАС также как и в случае ГНМЦ и СТРЦ увеличивает диапазон линейности определяемых концентраций КНМЦ. Согласно литературным данным [70] комплекс КНМЦ с медью(П) достаточно устойчив (табл.12-в) при рН 6 находится в виде CuH2L (L - молекула КНМЦ) (табл. 12-6), то есть молекула протонирована по двум азотам, поэтому в изучаемых условиях (рН 6) комплекс КНМЦ с медью(П), вероятно, является положительной двухзарядной частицей, на что и указывает крутизна электродной функции, достигающая теоретического нернстовского наклона для двухзарядной частицы. Было исследовано поведение электродов на основе комплекса с различными противоионами в зависимости от кислотности изучаемых растворов комплекса КНМЦ с медью(П) (рис.25). Поведение электродной функции в зависимости от рН для различных противоионов практически одинаково: на кривой отсутствует плато. Таким образом, требуется тщательная стабилизация кислотности растворов комплексов КНМЦ с медью(П).
Влияние рН на электродный потенциал ИСЭ на основе ионного ассоциата, образованного комплексом КНМЦ с медью (II) с ТФФБ, Скнмц-Си(П)-№ М
Потенциометрическая селективность ИСЭ на основе различных противоионов к комплексу КНМЦ с медыо(П) показана в табл.15. Как видно, .определению комплекса КНМЦ КНМЦ-селективными мембранами мешает присутствие как комплекса АМКЦ, так и комплекса СТРЦ, что позволяет рекомендовать электроды для определения индивидуальных антибиотиков или их суммарного содержания. Таблица 15
Потенциометрические коэффициенты селективности ИСЭ на основе ионных ассоциатов, образованных комплексом КНМЦ с медъю(П) и различными противоионами
В табл.16 приведены данные, необходимые при обсуждении полученных экспериментальных результатов: структурная формула АМКЦ, зависимость степени протонированности комплекса от рН, а также, константы протонирования ГНМЦ и константы устойчивости его комплексов с медью(П) в зависимости от степени их протонирования [72].
Амикацин - полусинтетический антибиотик (табл. 16-а), производный от канамицина А. Является одним из наиболее эффективных антибиотиков-аминогликозидов.
Так же, как и в случае других антибиотиков амикацин образует протонированные формы и протонированные комплексы с медью(П), а степень протонированности комплексов зависит от рН (табл.16). Таблица 16
Структурная формула амикацина (а), зависимость степени протонированности комплекса амикацина с медъю(П) от рН (б), константы устойчивости комплексов амикацина с медью (II) (в), константы протонирования для амикацина (г)
Было изучено электрохимическое поведение АМКЦ-селективных мембран. В качестве ЭАС применяли ИА АМКЦ с различными противоионами, а также ЭАС на основе ИА, образованных комплексом АМКЦ с медью(П) и противоионами.
При использовании в качестве ЭАС АМКЦ — противоион, наблюдается катионный отклик, причем крутизна электродной функции в случае ТФБ и ТХФБ выше значения для двухзарядной частицы, что свидетельствует о сосуществовании нескольких различных протонированных форм антибиотика (табл.16-г,17). Для противоиона ТФФБ наклон электродной функции соответствует значению для двухзарядной частицы. В то же время, предел обнаружения для немодифицированного ЭАС оказался ниже, чем для других аминогликозидов.
