Введение к работе
Актуальность темы. Професс в области диагностики многих серьезных олеваний базируется на развитии новых методологических подходов в ана-нческой технике. Сегодня хорошо известна чрезвычайно важная роль роидных гормонов в биохимических процессах и патогенезе многих олеваний. Именно поэтому в настоящее время интенсивно разрабатываются личные способы их определения в биоорганических субстанциях, агностика заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма :роидных гормонов в эндокринологии, гинекологии и онкологии, немыслима ( определения содержания гормонов в организме. Постоянно возрастающее :ло больных бесплодием, которое часто оказывается связанным с эмональными нарушениями, резко повышает актуальность проблемы.
Как правило, медики, строя свои суждения об эндокринной патологии, заничиваются простым измерением уровня гормонов в крови. Причина вышенного внимания именно к крови, как биологической субстанции, язана с созданием автоматизированных аппаратов, принципиально нованных на использовании высоко специфической реакции антиген -титело, позволяющих делать анализы в большом количестве, быстро и чественно. Моча в качестве объекта исследования осталась на втором плане: к правило, при ее анализе ограничиваются лишь определением суммы 17-тостероидов (17-КС), реже суммы 17-оксикетостероидов и дегид-опиандростерона (DHEA).
Однако, после довольно длительного периода "тотального увлечения" оп-
делением гормонов в крови выявились и серьезные недостатки этого метода,
:новные из которых перечислены ниже:
Моментальные колебания концентрации гормонов в крови, связанные с цир-
кадными ритмами и другими возможными физиологическими процессами в
организме, приводят к ложным выводам.
Значительные вариации нормативных показателей в зависимости от применяемой разновидности иммунологического метода существенно снижают надежность определения.
Ассортимент доступных, особенно в условиях современной России, наборов реактивов, необходимых для использования с максимальной эффективностью данного метода недостаточен. К тому же дороговизна и ограниченное время хранения наборов накладывает дополнительные ограничения на их практическое применение в клинических условиях.
Наконец: анализ крови не являясь неинвазивным методом диагностики, всегда создает некоторую вероятность случайного заражения пациента и врача лаборанта вирусами СПИДа, гепатита В и др.
70 - 80-е годы можно без преувеличения назвать "Золотым веком" развития методик определения стероидов в биологических жидкостях с использованием всевозможных химических и хроматографических способов. Именно в этот период были решены основные проблемы по практическому применению подобного анализа. Однако, несмотря на ряд успешных разработок в этом направлении, иммунологический метод все же "одержал верх" над химическим, причем основной причиной этой "победы" оказалась трудоемкость процессов, многоступенчатость стадий проведения химического анализа, и, как следствие, трудность их автоматизации.
Основные преимущества использования мочи в качестве объекта исследования связаны прежде всего с тем обстоятельством, что с мочой экскретируется большое количество стероидов, несущих обширную информацию не только о железах, в которых они синтезируются, но и о состоянии печени, где преимущественно стероиды подвергаются катаболизму. Кроме того, определение стероидов в суточной моче позволяет избежать влияния на результаты измерений циркадных ритмов, которые часто бывают значительными.
Анализ литературных данных позволяет заключить, что одним из наиболее мощных инструментов эффективного анализа стероидов в моче на современном этапе является капиллярная газовая хроматография. Это обусловлено, прежде всего, высокой чувствительностью и разрешающей способностью данного метода.
Хроматографическая кривая сложной смеси стероидов в моче - стероид-[ый профиль (СП), как оказалось, является наиболее ценным диагностическим естом при целом ряде заболеваний, связанных с нарушением синтеза и іетаболизма стероидов, причем некоторые из заболеваний могут быть (нагностированы только этим методом. К сожалению, широкому применению ГП в клинике препятствует длительность аналитического процесса, его шогостадийность и, как следствие, высокая стоимость. Поэтому целью шстоящей работы является поиск и разработка новых методологических юдходов, позволяющих быстро и надежно определять стероиды в моче, іричем существенным дополнительным требованием в условиях специфики слинической практики в России должна быть относительная дешевизна >азработанного метода, а, следовательно, и его общедоступность. В целом :стественно ожидать, что внедрение разработки позволит существенно шучшить выявляемость ряда заболеваний, снизить репродуктивные потери и >существить качественный мониторинг за ходом проведения лечения.
Постановка задачи. Наиболее трудоемкой, дорогостоящей и длительной іроцедурой является подготовка образца для газохроматографического ісследования. Именно эта стадия препятствует широкому внедрению метода в ірактику. Совершенствование и упрощение этого этапа, без потери трицизионности и надежности измерений, и является основной задачей данного исследования, решение которой позволит применить газовую хроматографию ггероидов для диагностики в широких масштабах.
Для выполнения основной задачи требуется решить несколько вопросов. В частности, сейчас чаще всего для извлечения конъюгатов из биологической жидкости применяют так называемые С|8-картриджи, которые уже сами по себе являются дорогостоящими изделиями, а работа с ними представляет собой грудоемкий процесс, требующий достаточно высокой квалификации оператора. По нашему мнению, применение экстракции типа "жидкость-жидкость", взамен использования C|g картриджей могла бы оказаться гораздо менее трудоемкой, а шачит и дешевле. Особенно длительной и недостаточно совершенной стадией подготовки пробы является ферментативный гидролиз конъюгатов стероидов,
поэтому применение комбинированного с экстракцией кислотного гидролиза (ККГ) могло бы значительно ускорить этот процесс и улучшить воспроизводимость метода. После изучения и анализа литературных данных стало ясно, что данный подход хотя и был предложен ранее, но не был достаточно разработан и не изучен детально. Оптимизация условий и способов проведения ККГ, подбор подходящего метода дериватизации для стероидов, полученных после такого гидролиза, а также совершенствование стадий очистки, позволит значительно ускорить процесс подготовки пробы и удешевить его, без потери при этом качества получаемых результатов.
Ранее хроматографические исследования проводили после ККГ, как правило, с использованием обычных насадочных колонок, что отрицательно сказывалось на качестве разделения пиков, то есть на разрешении метода и, в конечном счете, на его эффективности. Нами предложено использование гораздо более эффективных капиллярных колонок, имеющих ряд преимуществ, и, как оказалось, открывающих широкие перспективы для развития и совершенствования методики.
Таким образом, решение вышеперечисленных вопросов позволяет решить основную задачу настоящего исследования, что в свою очередь может обеспечить достижение главной цели работы широкого использования газовой хроматографии для диагностики ряда заболеваний.
Научная новизна работы. Впервые разработан надежный и эффективный метод определения стероидных гормонов в биологических жидкостях методом газовой хроматографии, отличающийся от известных способов простотой методологического подхода, дешевизной, экспрессностью и высокой информативностью. Автор защищает: >* процесс оптимизации экстракции конъюгатов стероидов из биологического
материала типа "жидкость-жидкость"; >- разработку способа комбинированного с экстракцией кислотного гидролизе (ККГ) конъюгатов стероидов;
метод газохроматографического определения стероидов в образце, полученного после проведения ККГ;
обоснование и выбор метода дериватизации клинически важных стероидов;
модернизацию хроматографа ЛХМ-80;
применение данного методологического подхода для диагностики ряда конкретных заболеваний;
Практическая значимость работы. Разработанный в диссертационной работе анализ концентрации профилей стероидных гормонов газохроматографическим методом в биологической жидкости человека апробирован на практике и успешно внедрен в 8-й городской больнице Москвы, 29-ом роддоме Москвы, а также используется для диагностики причин гиперандрогении в Центре акушерства и гинекологии, на кафедре акушерства и гинекологии РГМУ. Кроме того, метод применяется для диагностики заболеваний в ряде частных медицинских учреждений г. Москвы.
Апробация работы. Результаты работы доложены на следующих конференциях и симпозиумах: «7th European Conference on Clinical Oncology and Cancer Nursing», Jerusalem, Israel, 1993; «V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике», Москва, 1995; «Laboratory medicine 4995», 11th 1FCC European Congress of Clinical Chemistry, Tampere, Finland, 1995; «X конференция по экстракции», Уфа, 1994; «Юбилейная научная сессия, посвященная 60-летию основания Института», Москва 1994; «Хроматографические методы в химии, биологии и медицине», Минск 1995; «III всероссийский симпозиум по жидкокристаллическим полимерам», Черноголовка 1995; «Научно-практическая конференции молодых ученых и врачей, посвященная 125-летию фирмы Schering» Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, 1996; Институт медицинской физики, Минздрав России, Москва, 1996; Городская клиническая больница № 8, Москва, 1996; «International congress on analytical chemistry» Moscow, 1997, «Национальные дни лабораторной медицины России», Москва, 1997, «Проблемы эндокринологии в акушерстве и гинекологии», Центр акушерства и гинекологии. Москва, 1997; «XI Российская конференция по экстракции»,
Москва, 1998г; «Юбилейная конференция, посвященная 65-летию ИНХС РАН и 275-летию РАН», Москва, 1999; Основные результаты также представлены на выставках: Общественное собрание Российской академии наук; «Экология. Здравоохранение» Москва, 1998; XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Санкт-Петербург, 1998; Результаты работы регулярно докладывались на лабораторных коллоквиумах ИНХС РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ (из них 11 статей в реферируемых отечественных и международных журналах), список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, завершающегося постановкой задачи, экспериментально-методической части, двух глав, посвященных обсуждению полученных экспериментальных результатов и главы, в которой представлены некоторые аспекты практического использования разработанного метода, выводов и списка литературы.
