Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературных данных 8
1.1. Общие сведения о стероидных гормонах и их классификация 8
1.2. Биосинтез и метаболизм кортикостероидов. Биологические формы
и действие кортикостероидов в организме 8
1.3. Физико-химические методы исследования стероидных гормонов ... 14
1.3.1. Иммунологические методы 14
1.3.2. Хроматографические методы анализа стероидных гормонов...
1.3.2.1. Определение стероидов методом тонкослойной хроматографии 16
1.3.2.2. Газовая хроматография (ГХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) при определении стероидов 17
1.3.2.3. Определение стероидных гормонов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 18
1.3.2.3.1. Использование циклодекстринов (ЦД) в хроматографии стероидов 23
1.3.2.3.2.Методы детектирования стероидных гормонов 26
1.3.2.4. Мицеллярная жидкостная хроматография 31
1.3.3. Определение кортикостероидов методом мицеллярной
электрокинетической хроматографии (МЭКХ) 33
1.3.3.1. Поверхностно-активные вещества, используемые в МЭКХ для разделения стероидных гормонов 40
1.3.3.2. Буферные системы, используемые в МЭКХ стероидов 46
1.3.3.3. Влияние модификаторов в составе ведущего электролита на разделение кортикостероидов методом МЭКХ 48
1.4. Подготовка биологических объектов к анализу 49
1.4.1. Гидролиз коньюгатов стероидов 49
1.4.2. Методы экстракции стероидных гормонов
1.5. Биосинтез и метаболизм катехоламинов 54
1.6. Физико-химические методы исследования катехоламинов
1.6.1. Иммунологические методы определения катехоламинов 58
1.6.2. Газовая хроматография для определения катехоламинов 58
1.6.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) катехоламинов 59
1.6.4. Использование метода капиллярного электрофореза (КЭ) для определения катехоламинов (КА) 60
1.6.5. Детектирование катехоламинов в ВЭЖХ и КЭ 63
1.6.6. Сравнительный анализ физико-химических методов определения катехоламинов 67
1.6.7. Пробоподготовка реальных объектов к анализу катехоламинов 68
ГЛАВА 2. Общая характеристика объектов и методов исследования 74
2.1. Аппаратура 74
2.2. Реактивы и материалы
2.2.1. Подготовка рабочих растворов 76
2.2.2. Отбор пробы 79
2.3. Методы исследования 79
2.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография при определении стероидов и катехоламинов 79
2.3.2. Капиллярный электрофорез 81
2.4. Подготовка биологических объектов к анализу 84
2.4.1. Подготовка биологических объектов к анализу смесей
стероидных гормонов 84
2.4.1.1. Жидкостная экстракция 84
2.4.1.2. Твердофазная экстракция 85
2.4.1.3. Определение стероидных гормонов методом ТСХ 87
2.4.2. Оптимизация пробоподготовки при определении
катехоламинов 88
2.4.2.1. Подготовка сорбента для экстракции
катехоламинов 88
2.4.2.2. Твердофазная экстракция катехоламинов 88
ГЛАВА 3. Установление факторов, влияющих на хроматографическое (оф вэжх) и электрофоретическое {мицеллярная электрокинетическая хроматография) разделение кортикостероидов 91
3.1 Факторы, влияющие на разделение стероидов в режиме ОФ ВЭЖХ 92
3.2. Влияние добавки Р-цикло декстрина на разделение стероидных гормонов в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ 98
3.3 Расчет констант устойчивости, образующихся комплексов между 3-циклодекстрином и стероидами 105
3.4. Сравнительная оценка жидкостной и твердофазной экстракции при определении кортикостероидов в сыворотке крови и в моче.. 109
3.5. Факторы, влияющие на разделение кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии 118
3.6. Методы on-line концентрирования в МЭКХ при определении стероидных гормонов в биологических жидкостях 129
3.7. Определение стероидов в биологических объектах методом МЭКХ 139
3.8. Сопоставление полученных результатов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с методом ОФ ВЭЖХ 141
ГЛАВА 4. Определение катехоламинов методами КЭ УФ И КЭ-МС 143
4.1. Факторы, влияющие на разделение катехоламинов в капиллярном зонном электрофорезе 143
4.2. Факторы, влияющие на стабильность электрораспыления и чувствительность ESI-MS-детектирования 148
4.3. Определение катехоламинов в реальных объектах методом КЭ-МС 152
4.4. Сопоставление методов КЭ-МС и ОФ ВЭЖХ при определении катехоламинов 156
ГЛАВА 5. Практическое приложение 160
5.1. Закономерности изменения стероидных профилей при различных дисфункциях коры надпочечников 160
5.1.1. Подготовка пробы к анализу 161
5.1.2. Характеристические стероидные профили при различных дисфункциях коры надпочечников методом ОФ-ВЭЖХ 161
Приложение 170
Выводы 180
Список использованной литературы 182
- Физико-химические методы исследования стероидных гормонов
- Высокоэффективная жидкостная хроматография при определении стероидов и катехоламинов
- Влияние добавки Р-цикло декстрина на разделение стероидных гормонов в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ
- Факторы, влияющие на стабильность электрораспыления и чувствительность ESI-MS-детектирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Стероидные гормоны коры надпочечников играют основную роль в обеспечении жизненных процессов. Изменение концентраций катехоламинов в крови определяет различные заболевания мозга и нервной системы. Низкие концентрации обсуждаемых аналитов в биологических жидкостях требуют использования высокочувствительных и селективных методов их определения. К тому же биологически активной является лишь свободная фракция стероидов, содержание которой в сыворотке не превышает 15%. Для корректной диагностики многих патологий, например, эндокринных нарушений, необходимо определение в сыворотке крови и моче как стероидов, так и катехоламинов.
Традиционно используемые в отечественной практике иммуноферментные методы имеют существенные ограничения и обеспечивают определение лишь одного конкретного соединения. Опубликованные работы в области ВЭЖХ стероидов и катехоламинов посвящены ограниченному набору аналитов либо решению конкретной задачи (установлению количественного соотношения кортизол : кортизон). Определенные перспективы, открываются в выяснении возможности использования различных вариантов капиллярного электрофореза с УФ- и МС-детектированием.
Актуальность проблемы подтверждается поддержкой исследований в этом направлении со стороны конкурсного центра фундаментального естествознания (гранты АСП-30513 и АСП - 301053) и Министерства образования РФ ( грант АОЗ-2.11-394).
Цель работы Усовершенствование методов хроматографического и электрофоретического разделения стероидов (кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC), 11-дезоксикортизола (S), 11-дегидрокортикостерона(А), прогестерона(Рг), 17а-гидроксипрогестеро-на (17СС-ОНРг), тестостерона (Т)) и биогенных аминов (адреналина (Е), норадреналина (NE), дофамина (DA)) в биологических жидкостях.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: -Установить на модельных смесях факторы, влияющие на хроматографическое и электрофоретическое разделение стероидных гормонов и катехоламинов.
Отработать режимы пробоподготовки для указанных классов аналитов.
Выяснить пути снижения их предела обнаружения в биологических жидкостях.
Получить сравнительные оценочные характеристики используемых методов для определения этих аналитов. і
| РОС национальная!
I БИБЛИОТЕКА |
1 &&№№
-Разработать методики определения стероидов и катехоламинов в сыворотке крови и моче больных с различными эндокринными нарушениями. Научная новизна
Установлены закономерности электрофоретического и хроматографического разделения стероидов и катехоламинов, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий разделения сложных смесей нейтральных соединений с близкими свойствами.
Выявлена доминирующая роль р-циклодекстрина при разделении природных стероидных юрмонов в изокрагическом режиме ОФ ВЭЖХ.
Обнаружен эффект влияния мочевины на разделение кортикостероидов в режиме МЭКХ.
Практическая значимоегь работы
Разработан метод хроматографического (ОФ ВЭЖХ с УФ-детектором) и электрофоретического (МЭКХ с УФ-детектором) определения стероидных гормонов в сыворотке и моче.
Впервые выполнен анализ смесей стероидных гормонов (F, Е, А, В, 17-OHPr, DOC, S) в реальных объектах (моча, сыворотка крови) методом МЭКХ с использованием on-line концентрирования.
Проведен комплексный анализ закономерностей хроматографических стероидных профилей, позволяющих обнаруживать нарушения стероидогенеза на ранних этапах заболеваний и осуществить дифференциальную диагностику различных патологий коры надпочечников.
Определение кортикостероидов в биологических объектах нашло практическое
применение в области клинической медицины. Получено свидетельство на
рационализаторское предложение №1354 от 18.06.2001. Ворохобина Л.В.,
Великанова Л.И., Королева Е.М., Бессонова Е.А., Шафигулина З.Р., Милютина О.Л. Комплексное исследование уровня кортикостероидов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ для ранней диагностики патологий коры надпочечников.
Положения, выносимые на защиту
1.Результаты исследования влияния состава, концентрации и рН буферного
электролита, природы и концентрации мицеллообразователя и органических
модификаторов, добавки циклодекстрина в качестве компонента подвижной фазы,
разделительного буфера и магрицьь образца, определяющие закономерности
хроматографического и электрофоретического разделения кортикостероидов.
: '«.і \ч v;
-
Количественная оценка (константы комплексообразования) процессов комплексообразованця с участием стероидов и Р-цикло декстрина.
-
Оптимизированный регламент пробопоаготовки биологических жидкостей (сыворотки крови и мочи) при определении стероидных гормонов методами ОФ-ВЭЖХ и МЭКХ.
-
Способы предварительного концентрирования (стэкинга и евнпинга) для увеличения концентрационной чувствительности определения кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматофафии.
-
Обоснование преимуществ для определения кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии по отношению к обращенно-фазовой
вэжх.
-
Сравнительные характеристики ОФ ВЭЖХ и КЭ-МС определения катехоламинов.
-
Методики анализа реальных объекте с использованием выявленных закономерностей:
- определение кортикостероидов методом ОФ-ВЭЖХ,
- определение кортикостероидов методом МЭКХ.
Апробация работы Результаты исследований докладывались на Всероссийской
конференции «Химический анализ веществ и материалов». 16-21 апреля. 2000 г. Москва;
IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной
хроматографии. 24-28 апреля. Клязьма. 1999 г. Москва; научно-практической
конференции молодых ученых СПбМАПО "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". 2001. СПб; симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины». 9-11 октября. 2001г. СПб; 4-м Всероссийском конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии». 2001. СПб; X Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбиии и адсорбционной хроматоірафии. 24-28 апреля. 2001г. Москва; VIII Всероссийском симпозиуме :ю жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. 15-19 октября. 2001г. Москва; Всероссийском симпозиуме по «Современным проблемам хроматографии» 18-22 марта. 2002 г. Москва; I International conference «High medical technologies in XXI century» November 2-9. 2002. Benidorm. Spain; Illrd International symposium on separations in BioSienceJ "100 years of Chromatography". 13-18 may. 2003. Moscow; XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии. 21-26 сентября. 2003. Казань; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы». 15-19 марта. 2004 г. Москва.
Публикация результатов. Материалы диссертации опубликованы в 2 статьях и 15 тезисах докладов.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав с обсуждением полученных результатов, экспериментальной части, приложения, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (162 наименований). Работа изложена на 200 страницах машинописного текста, содержит 5 схем, 39 таблиц и 35 рисунков.
Физико-химические методы исследования стероидных гормонов
Иммунологические методы характеризуются высокой чувствительностью (несколько пг в мл), однако, позволяют определять лишь ограниченное число стероидных гормонов. Селективность реакции антитела с конкретным стероидом не абсолютна: в присутствии гормонов, имеющих близкое строение, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции, и результаты будут завышены.
Для определения кортикостероидов широко используется газовая хроматография (ГХ) [3,7-9] и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) [10-12], высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [4,13-34] и ее сочетание с масс-спектрометрией [35-38] и хроматография в тонком слое (ТСХ) [39-41] .
До активного внедрения ВЭЖХ именно метод ТСХ использовали для идентификации стероидных гормонов в биологических объектах.
Разделение стероидов осуществляют обычно на слое силикагеля с использованием различных элюирующих систем: гексан-этилацетат (2:8), бензол-ацетон (4:1), бензол-этанол (4:1), бензол-этилацетат (3:7) [3], хлороформ-этанол (9:1) [40], толуол-этанол (9:1), толуол-ацетон-уксусная кислота, хлороформ-метанол-вода (90:10:0,8) [3], хлороформ-ацетон (27:3) [39], этилацетат-метанол-вода (85:15:1), метанол-вода (11:9) [39] и др. В скобках даны объемные соотношения. Обычно проводят многократное элюирование [40]. Кроме силикагеля для разделения кортикостероидов, предлагаются полиамидные сорбенты (LH-20), целлюлоза с 1,2-пропандиоловой пропиткой и силикагель, обработанный щелочью и формамидом [3].
Для детектирования стероидных гормонов в ТСХ чаще всего используется серная кислота (разбавленная водой или спиртами, иногда в сочетании с альдегидами): наблюдается разнообразное окрашивание зон в зависимости от типа стероида [3,42]. Специфичным реагентом для кортикостероидов является тетразолиевый синий; также применяют фосфорную и соляную кислоты, хлорид сурьмы (Ш), пары йода [39]. Количественный анализ осуществляют с использованием сканирующих денситометров [40].
В настоящее время ТСХ используется в основном для выделения кортикостероидов из биологических образцов.
Первые работы, посвященные анализу стероидов методами ГХ, были опубликованы в 1960 г. [8], где была показана возможность разделения их на неподвижной фазе SE-30. Для этой цели использовались в основном стеклянные и реже - металлические насадочные колонки [8,42]. Неподвижную фазу наносили на специально подготовленный белый диатомитовый носитель. Наибольшее применение в качестве неподвижных фаз нашли полиметилсилоксаны и метилфенилсиликоновые фазы [8,43].
Большей термической устойчивостью отличаются газохроматографические фазы на основе сополимеров карборана и метилсилоксана, используемые для разделения нелетучих стероидов: холестерина, станолов и желчных кислот с большими молекулярными массами [3]. Анализируемые стероиды обычно термически неустойчивы, поэтому при ГХ-определении их практически всегда переводят в более летучие и стабильные производные [8,10,11]. Для детектирования используют ионизационно-пламенный (ДИП) и фотопламенный детекторы, хромато-масс-спектрометрометрию (ГХ-МС) и детектор электронного захвата (ДЭЗ) [8,10-12].
С появлением техники "термораспыления" [44], позволяющей осуществлять ионизацию при атмосферном давлении и сравнительно низких температурах, стало возможным сочетание работы масс-спектрометра с жидкостным хроматографом, что устранило необходимость предварительного силилирования аналитов.
Определение стероидных гормонов методом высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Начиная с 1970-х гг. XX в. наибольшее распространение в анализе смесей стероидных гормонов получила ОФ ВЭЖХ [4,13-38] (табл. 1. 3.).
Для определения кортикостероидов применяют нормально- и обращенно-фазовую ВЭЖХ. В случае немодифицированного силикагеля, в качестве элюента используют хлороформ, дихлорметан, в которые добавляется незначительное количество ( 1-3%) этанола или метанола, диоксана или тетрагидрофурана. В нормально-фазовом варианте достаточно трудно получать воспроизводимые результаты, что связано с адсорбцией воды из растворителей, применяемых в качестве подвижных фаз, а также из-за достаточно длительного установления равновесия при замене элюента.
В настоящее время нормально-фазовая ВЭЖХ определения стероидов практически полностью уступила место обращенно-фазовой. Установлено, что неподвижные фазы (н.ф.) на основе дигидроксипрошшового эфира («DIOL») обеспечивают наилучшее разделение стероидов [46] и имеют преимущество перед другими н.ф. при определении малополярных стероидов. В связи с этим обсуждается проблема влияния рН буфера на Таблица 1. 3. Условия анализа стероидов методом ВЭЖХ
Высокоэффективная жидкостная хроматография при определении стероидов и катехоламинов
Скорость элюента - 600 мкл/мин. - на чешском жидкостном хроматографе в режиме изократического элюирования с УФ-детектированием (254 нм); колонка металлическая 250 х 4 мм, сорбент "Диасорб -130 - СібТ (7 мкм); колонки стеклянные Separon SGXC-18 (5 мкм) 150 х 3 мм и 100x2 мм (Чехия) и ISN Silica RP 18 ЮОА (5 мкм); 160x2 мм. Самописец КСП4-039-УХЛ.4.2; скорость элюирования - 0,3 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. - на жидкостном хроматографе Милихром-2, применяя в качестве подвижной фазы раствор 45% ацетонитрила в воде, позволяющей достигнуть необходимое разделение смеси анализируемых стероидов для оценки эффективности их экстракции. Ввод пробы осуществляли в капилляр путем регулирования хода шагового двигателя, управляющего насосом. Объем вводимой пробы составлял 25 мкл. Скорость элюента - 40 мкл/мин.
Хроматографический анализ модельных систем катехоламинов и реальных объектов проводился на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза» производства НПО Химавтоматика г. Москва, детектор: амперометрический; рабочий электрод - стеклоуглеродный, потенциал рабочего электрода +1,0 В; колонка: Phenomex Luna Cis (4,6x150мм), Т колонки 23,3С; Т детектора 22,6С; объем дозы 20 мкл; скорость потока элюента 1 мл/мин. В качестве элюента взята система: 30 мМ КН2Р04, 1,44 мМ октилсульфонат натрия (ОСН), 40 мМ монохлоруксусная кислота (МХК), ацетонитрил (рН = 3).
Анализ кортикостероидов и оценку степени экстракции для твердофазной экстракции модельных растворов катехоламинов проводили на приборе «Капель 103-РЕ». Для регистрации сигналов в системах капиллярного электрофореза использовали фотометрическое детектирование с фиксированной длиной волны (254 нм). Детектирование проводили в режиме реального времени непосредственно в капилляре. Использовали немодифицированный кварцевый капилляр (внешнее покрытие -полиимидное), геометрические характеристики капилляра: внутренний диаметр 75 мкм, внешний 365 мкм, общая длина 60 см, эффективная длина 50 см). При работе с катехоламинами в КЭ использовали положительную полярность высоковольтного блока (детектор находится вблизи катода, и ЭОП движется от анода к катоду).
Ввод пробы - гидродинамический; параметры ввода в каждом случае оптимизировали, варьируя величину произведения давления ввода на время ввода (мбархс). Рабочее напряжение изменяли в диапазоне от +15 до +25 кВ, при этом токи не превышали 120 мкА. Для анализа катехоламинов на приборе КЭ-МС «Agilent» использовали немодифицированный кварцевый капилляр с защитным полиимидным покрытием (внешний диаметр 375 мкм, внутренний диаметр 50 мкм, общая длина капилляра 80-90 см и эффективная - 30-50 см). Капилляр выступает из электроспрей иглы на 0,3мм. Напряжение, подаваемое на концы капилляра, 30 кВ; отбор пробы с карусели сэмплера: гидравлический, 900 мбар с;
Использовали буферные растворы различного состава: боратный (рН=9,18), аммонийно-ацетатный (рН=4,5), фосфатный (рН=7,4), уксусную кислоту и фосфорную кислоту в диапазоне концентраций 10-100 мМ. В состав буферного электролита вводили макроциклический реагент (Р-ЦД в диапазоне концентраций 1-10 мМ), органические растворители (метанол, ацетонитрил, изопропиловый спирт 5-30 %, объемн.), мочевину (в концентрациях 1-5 М), диэтиламин солянокислый (в концентрации 5 10"3 М) и ПАВ (ДДСН, мицеллярные формы использовали в диапазоне концентраций от 10 до 100 мМ при критической концентрации мицеллообразования (ККМ), равной 8 мМ; холат натрия, мицеллярные формы использовали в диапазоне концентраций 15 - 50 мМ при ККМ, равной 12,5 мМ). Оптимальный состав рабочего электролита для анализа катехоламинов методом КЭ: раствор 50-100мМ ацетатного буфера (рН=4,5) с добавкой 5 10"3 М диэтиламина солянокислого; рН доводили до 4,5 раствором 10%-ного водного аммиака. Оптимальный состав рабочего электролита для анализа кортикостероидов методом МЭКХ: раствор 25 мМ ортофосфорной кислоты (рН = 2,5) с добавкой 10 мМ ДДСН и 4,5 М мочевины. Все буферные растворы фильтровали и дегазировали под вакуумом водоструйного насоса.
Важную роль в методе КЭ играет качество подготовки кварцевого капилляра к анализу (кондиционирование капилляра).
Перед проведением анализа в режиме капиллярного электрофореза капилляр подготавливался к работе. Для этого в полипропиленовые сосуды вместимостью 1 мл помещали по 500 мкл дистиллированной воды и раствора аммиака (1:10, по объему). Предварительно отфильтровывали растворы через мембранный фильтр с диаметром пор 1,2 мкм. Последовательно капилляр промывали дистиллированной водой в течение 5 минут, водным раствором аммиака (для КЭ-МС) или 0,5М раствором NaOH (для КЭ-УФ) - 10 минут, дистиллированной водой - 5 мин, соответствующим буферным электролитом -15 мин. (давление при промывке 1000 мбар, напряжение - 0 кВ). Проверяли качество подготовки капилляра к работе: при подаче напряжения в системе капиллярного электрофореза сила тока, протекающего через капилляр, должна быть стабильной. Между анализами капилляр промывали буферным раствором в течение 2 мин.
Режим регистрации положительных ионов в МС Использовался ESI-интерфейс с трехслойной металлической иглой. В иглу, выполняющую функцию электроспрея, коаксиально вводили потоки газа-осушителя и обволакивающей жидкости. Величина ESI напряжение +4кВ Скорость подачи обволакивающей жидкости изменяли в диапазоне 2-8 мкл/мин. Скорость подачи газа-осушителя (азот) 5 л/мин. Температуру газа-осушителя изменяли в диапазоне 100-300 С. Давление подачи газа-осушителя - 12 кПа. Режимы регистрации сигналов в масс-спектрометрическом детекторе: SCAN 150ч-185 м/е, время миграции 0 мин. SIM 152 м/е, время миграции (МТ) 0 минут; 166 м/е, время миграции 18,2±0,2мин. Скорость подачи обволакивающей жидкости 4 мкл/мин. Раствор обволакивающей жидкости, используемый для обеспечения жидкостного контакта между кончиком капилляра и иглой электроспрейера, готовили из смеси метанола или изопропилового спирта в воде в соотношениях 40 : 60 - 95 : 5 (по объему) с 0,5% уксусной кислоты (по объему).
Влияние добавки Р-цикло декстрина на разделение стероидных гормонов в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ
Полученные пределы обнаружения для анализируемых стероидных гормонов с гидродинамическим вводом образца (60 мбар с) составили 5 мкг/мл для кортизола, кортизона и кортикостерона; 2,5 мкг/мл - для прогестерона, 17-гидоксипрогестерона, 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона.
Таким образом, чувствительности метода МЭКХ недостаточно для определения аналитов в реальных образцах, поскольку содержание свободных кортикостероидов в биологических жидкостях находятся на уровне нг/мл.
В связи с этим необходимо было выбрать стратегию on-line концентрирования образца: стэкинг [62,68,71,73,77,84-86] и/или свипинг [75, 76, 87,89], которые используются отдельно или в сочетании друг с другом.
Стэкинг - один из наиболее общих подходов к увеличению УФ-концентрационной чувствительности в КЭ. Стэкинг имеет место, когда ионы образца достигают границы, отделяющей зону высокой проводимости раствора буферного электролита и низкой - образца. В результате низкой проводимости матрицы образца (обычно за счет разбавления буфером или водой) в зоне пробы возникает относительно высокое электрическое поле. Аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой локальной скоростью, и, замедляясь на границе с буферным раствором, концентрируются. С применением стэкинга достигается не менее, чем 10-кратное (в случае большой скорости ЭОИ) и более, чем 1000-кратное увеличение концентрации (табл. 3.14.). Это позволяет приблизить предел обнаружения аналитов в методе КЭ к ВЭЖХ.
Впервые стэкинг нейтральных соединений в МЭКХ был предложен в 1994 году Liu [88]. Нейтральные аналиты растворяли в мицеллярном растворе при концентрации больше ККМ, но намного меньше, чем концентрация ПАВ в разделительном буфере. За счет усиления поля в зоне пробы образующиеся заряженные комплексы «аналит-мицеллы» имели большую подвижность в зоне образца по сравнению с зоной разделительного буфера.
При гидродинамическом вводе эффективен следующий вариант стэкинга нейтральных аналитов: переключение полярности на короткое время после ввода образца с последующим возвращением в нормальный режим - reversed electrode polarity stacking mode (REPSM) [85,88]. Образец растворяется в низкопроводящей матрице. За счет инверсии полярности матрица удаляется, а образующиеся комплексы мицелл с аналитами, перемещаясь против ЭОП, концентрируются в пограничном слое между раствором пробы и разделительным буфером. Полярность снова переключают для МЭКХ-разделения прежде, чем этот пограничный слой достигнет входа в капилляр. Когда сила тока достигнет 90% от максимального значения (капилляр заполняется разделительным буфером), полярность переключают. При этом имеет место увеличение вводимого объема пробы (капилляр можно заполнить раствором пробы почти до детектора).
Позднее был предложен другой механизм концентрирования: проба вводится из чистого водного раствора - normal stacking mode (NSM) [84]. Мицеллы из разделительного буфера входят в зону образца и ускоряются в сильном поле матрицы образца. Анализируемые вещества задерживаются мицеллами по мере их продвижения в зоне образца и концентрируются на входе капилляра [84], при этом также применима техника обращения полярности для удаления матрицы образца из капилляра [85]. Этот вариант позволяет в первую очередь концентрировать соединения с большими значениями факторов емкости. Данный вариант нами не рассматривался.
Quirino и Terabe описали еще один метод концентрирования нейтральных веществ и удаления матрицы образца без переключения полярности во время анализа - стэкинг с обращенно-мигрирующими мицеллами - stacking with reversed migration micelles (SRMM) [86]. Используется буферный электролит с низким значением рН, чтобы уменьшить ЭОП. Образец растворяют в низкопроводящей матрице (в воде) и гидродинамически вводят большой объем на катодном конце. Анализ проводят при обращенной полярности. В результате, при низких значениях рН электрофоретическая подвижность мицелл превышает скорость ЭОП, и мицеллы мигрируют в направлении детектора, перенося с собой разделяемые компоненты. Из-за небольшого ЭОП происходит удаление матрицы образца из капилляра. Концентрирование происходит за счет низкой проводимости матрицы образца на границе раздела между зонами пробы и буфера. Нами изучены возможности этого метода для определения стероидов.
В [88] разработаны два варианта концентрирования нейтральных веществ в МЭКХ во время ввода пробы. Используя матрицу образца с низкой проводимостью, содержащую положительно заряженные мицеллы, в процессе электрокинетического ввода компоненты пробы концентрируются на границе с разделительным буфером с высокой проводимостью. Разделение проводят при нормальной полярности.
Аналогичный вариант предложен в [88], где для усиления поля на входе капилляра при электрокинетическом вводе образца перед анализом гидродинамически вводят водную пробку - field enhanced sample injection (FESI). Образец растворяют в мицеллярном растворе и электрокинетически вводят в капилляр при обращенной полярности. В результате на входном конце капилляра создается зона высокого поля для эффективного стэкинга.
Дальнейшее разделение проводят при нормальной полярности. В этом случае также применима техника усиления поля без переключения полярности, т.е. реализуется метод ввода с усилением поля с обращенно-мигрирующими мицеллами - field enhanced sample injection — reversed migration micelles (FESI-RMM). [68]. Разделение проводят при обращенной полярности в фосфатном буфере при рН 7 (для уменьшения ЭОП). При приложении напряжения аналиты и мицеллы растворяются в водной пробке и дальше концентрируются на границе с буфером, а водная пробка удаляется из капилляра за счет ЭОП. Мы использовали данный вариант стэкинга для увеличения чувствительности детектирования стероидов.
Описанные методы концентрирования позволяют значительно уменьшить предел обнаружения, но ограничены разницей электропроводностей; требуется более низкая проводимость матрицы пробы по сравнению с разделительным буфером и, следовательно, концентрация заряженных мицелл, вводимых в матрицу образца, ограничена; при уменьшении концентрации заряженных мицелл соответственно уменьшается и эффективность концентрирования.
В альтернативном варианте концентрирования используется высокопроводящая матрица [88]. В результате увеличения проводимости в зоне образца происходит концентрирование мицелл на границе раздела проба/буфер, что приводит к образованию фронта мицелл. Вблизи этой границы скорость миграции стероидов уменьшается, благодаря высокой концентрации мицелл, и происходит эффективный захват незаряженных гидрофобных аналитов по мере их продвижения. Наибольшее концентрирование достигается для более гидрофобных стероидов. Данный вариант концентрирования для выбранной смеси стероидов нами был тщательно изучен.
Факторы, влияющие на стабильность электрораспыления и чувствительность ESI-MS-детектирования
На основании проведенных ранее экспериментов (глава 3) разработана методика определения кортикостероидов в биологических объектах (моча, сыворотка крови) при различных дисфункциях коры надпочечников.
Для модельной смеси, содержащей кортизол (F), кортизон (Е), 11 дегидрокортикостерон (А), кортикостерон (В), тестостерон (Т), 11 дезоксикортикостерон (DOC), 11-дезоксикортизол (S), 17 гидроксипрогестерон (17-ОНРг), подобрали оптимальные условия разделения компонентов в изократическом режиме ОФ-ВЭЖХ: подвижная фаза CH3CN:H20 (45:55, по объему) с добавкой Р-циклодекстрина в концентрации 2,5 мМ, колонка Separon SGX С-18 100x2 мм, 5 мкм (Чехия); УФ-детектирование: 254 нм; скорость элюента 0,3 мл/мин, чувствительность регистрации 8, объем вводимой пробы 20мкл.
Нижние границы диапазонов определяемых концентраций составили 30-50 мкг/л. Для определения содержания кортикостероидов в биологических объектах предложена стадия предварительной очистки и концентрирования пробы с использованием жидкостной экстракции, нижние границы обнаружения в этом случае составили 2 мкг/л (объем пробы сыворотки крови - 1 мл, мочи - 2 мл).
Получены характеристические стероидные профили при различных патологиях коры надпочечников (с диагнозами альдостерома, рак коры надпочечников, синдром Щетсо-Кушинга, врожденная гиперплазия коры надпочечников), нашедших применение в лабораторной диагностике. На основании значений параметров удерживания и масс-спектрометрического анализа неизвестному соединению при заболевании врожденная гиперплазия коры надпочечников была приписана структура андростендиона.
Подготовка сыворотки крови к анализу. Пробу сыворотки крови объемом 1 мл экстрагировали пятикратным объемом метиленхлорида (5 мл), промывали органический экстракт 0,5 мл водного раствора 0,1 М NaOH, для отделения более полярных, чем кортикостероиды веществ (фенольные эстрогены, нестероидные липиды и др.), окрашенных соединений, присутствующих в образце сыворотки крови. Процедуру промывания щелочью выполняли быстро, чтобы избежать потерь кортикостероидов. Затем экстракт промывали 1 мл дистиллированной воды, сушили в течение 30 мин над безводным сульфатом натрия и выпаривали под током воздуха. Сухой остаток растворяли в 60 мкл 10%-ного водного раствора ацетонитрила и анализировали методом ОФ-ВЭЖХ.
Подготовка пробы мочи к анализу. Пробу мочи объемом 2 мл экстрагировали пятикратным объемом хлороформа (10 мл). Затем экстракт промывали дважды 1 мл 0,1 М водного раствора гидроксида натрия и 2 мл дистиллированной воды. Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия и выпаривали досуха под током воздуха. Сухой остаток растворяли в 60 мкл 10% -ного водного ацетонитрила для анализа методом ОФВЭЖХ.
Варьирование различных сорбентов и элюирующих систем в режиме жидкостной и твердофазной экстракции позволили отработать процедуру пробоподготовки сыворотки и мочи. Это дало основание перейти к непосредственному хроматографическому анализу реальных объектов в оптимизированных условиях методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием.
В качестве реальных образцов нами были обследованы биологические жидкости (сыворотка крови и моча) здоровых доноров (21 человек) и 4 групп пациентов с диагнозами: 1. Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) (19 человек), 2. Алъдостерома (10 человек), 3. Рак коры надпочечников (12 человек), 4. Синдром Иценко-Кушинга (15 человек).
Были определены нормы содержания стероидов у здоровых доноров (рис. 5.3.) и при различных заболеваниях коры надпочечников в моче и сыворотке (табл. 5.1., 5.2.; Рис. 5.1). Диагностически важное соотношение кортизол/кортизон при различных патологиях представлено графически на рис. 5.2
В основе многих эндокринных заболеваний лежит нарушение активности ферментов, участвующих в синтезе стероидных гормонов, что приводит к изменению соотношений индивидуальных стероидов между собой. Это, в свою очередь, находит отражение в стероидном профиле мочи и сыворотке.
Первая группа - заболевание Врожденная гиперплазия коры надпочечников (стертая форма) (Рис.5.4.а) Нами было показано, что данное заболевание обусловлено неполноценностью ферментных систем, участвующих в стероидогенезе коры надпочечников. Анализ стероидов показал снижение уровня кортизола в крови и экскреции свободного кортизола мочи, что привело к уменьшению соотношения кортизол/кортизон как в крови, так и в моче; а также увеличению выработки предшественников стероидогенеза - DOC и S. Это дает возможность предположить дефект 11-ОН-гидроксилазы. Полученные данные согласуются с результатами хроматографического анализа мочи этих пациентов (Рис. 5.4.6).
