Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Методы получения летучих производных аминокислот, различных органических кислот и сахаров (литературный обзор) 13
1.1. Газохромаюграфический анализ аминокислот 14
1.2. Газохроматографический анализ жирных, дикарбсновых, гидрокси-, оксокислот, спиртов, сахаров и родственных соединений 29
ГЛАВА 2. Оборудование, исходные вещества и методика эксперимента .53
2.1. Оборудование 53
2.2. Исходные вещества и материалы 53
2.3. Методика эксперимента 66
2.3.1. Приготовление растворов модельных соединений 66
2.3.2. Дериватизация аминокислот с использованием гексаметилдисилазана .66
2.3.3. Дериватизация модельных соединений с использованием N.O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и N-метил-М-третбутилАиметилсилилтрифторацетамида 68
2.3.4. Дериватизация аминокислот с использованием изобутилхлорформиата68
2.3.5. Дериватизация жирных и дикарбоновых кислот с использованием изобутилхлорформиата 69
2.3.6. Приготовление лиофилизированных препаратов культуральной жидкости с клетками бактерий Escherichia Coli 69
2.3.7. Приготовление клеточных культур фибробластов и аденокарциномы прямой кишки человека 69
2.3.8. Экстракция из лиофилизата Escherichia Coli 71
2.3.9. Дериватизация экстрактов из реальных образцов 72
2.3.10. Газохроматографическое определение продуктов дериватизации 72
2.3.11. Масс-спектрометрическая идентификация продуктов дериватизации .73
ГЛАВА 3. Дериватизация модельных соединений и оптимизация условий гх-мс определения летучих производных 75
3.1. Оптимизация условий глзохроматогрлфичесюго определения 76
3.2. Силилирование жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, сахаров, спиртов и стеролов 77
3.2.1. Дериватизация гексаметилдисилазаном 77
3.2.2. Дериватизация НО-бис(триметилсилил|трифторацетамидом 79
3.2,3. Дериватизация аминокислот N-Men-iA-N-
третбутилдиметилсилилтрифторацетамидом S3
3.3 Этерификация и лцилирование жирных, дикарбоновых и аминокислот 86
3.3,1. Дериватизация изобутилхлорформиатом 86
ГЛАВА 4. Хромато-ЛЛАСС-спектрометрическая идентификация продуктов 95
4.1. электронная ионизация 95
4.1.1. Изучение масс-спектров силильных эфиров жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования 95
4.1.2. Изучение масс-спектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования 109
4.2. Химическая ионизация 136
4.2.1. Изучение масс-спектров силильных эфиров гидрокси-, оксокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования 137
4.2.2. Изучение масс-спектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования 141
ГЛАВА 5. Изучение состава соединений, выделенных из клеточных культур
148
5.1. Определение состава соединений, выделенных из лиофилизированной культуры escherichia coli 148
5.2. Определение состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в клетках аденокарциному и фибробллсюв человека 153
ГЛАВА 6. Определение следовых содержаний аминокислот в водных растворах 158
6.1. Изучение возможности сорбционного концентрирования следовых количеств изобутоксикарбонильных производных аминокислот из органического раствора и анализа всего концентрата 158
Заключение 164
Выводы 166
Список литературы
- Газохроматографический анализ жирных, дикарбсновых, гидрокси-, оксокислот, спиртов, сахаров и родственных соединений
- Дериватизация аминокислот с использованием гексаметилдисилазана
- Силилирование жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, сахаров, спиртов и стеролов
- Изучение масс-спектров силильных эфиров жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования
Введение к работе
Актуальность темы, В настоящее время все чаще возникает необходимость высокоселектпвпого и высокочувствительного определения состава таких биологически важных соединений, как аминокислоты, органические кислоты и сахара, в различных объектах. Подобные исследования проводятся при диагностике различных заболевании, в том числе врожденных. Состав органических кислот и Сахаров - один из показателей качества пищевой продукции и различных напитков. Микробиологические исследования также требуют определения состава этих классов соединении на улілраишком уровне.
При определении таких соединений в ряде случаев используется жидкостная хроматофафпя и капиллярный электрофорез, поскольку эти методы позволяют проводить определение указанных соединении напрямую (после предварительной очистки пробы). Однако пределы обнаружения (за исключением ВЭЖХ с амперометрическим детектированием), достигаемые в этом случае, сравнительно высоки, а и качестве элюспта необходимо использование органических растворителей высокой степени чистоты. Следует отметить также, что сочетание этих методов с масс-снектрометрией до сих пор находит лишь ограниченное применение, при этом пределы обнаружения существенно выше, чем в случае использования реакционной хромато-масс-спскхрометрии. Кроме этого, жидкостная хроматография н капиллярный электрофорез не позволяют проводить определение соединений различных классов при их совместном присутствии в смеси.
Газовая хроматофафпя находит более широкое применение в анализе указанных соединений, и, как правило, определение проводят с использованием пламепио-ионизациоииого детектора. Поскольку рассматриваемые соединения, как правило, не подлежат прямому газохроматофафическому анализу, необходимо проведение предколоночной дериватнзации для переведения таких соединений в соответствующие летучие производные. В существующих публикациях, посвященных газохроматофафическому определению соединений этих классов, уровень рабочих концентраций составляет обычно 10"1- 10"4%, и в по- даішиощсм большинстве случаев не проводится определение всех рассматриваемых соединении при их совместном присутствии в смеси (или же определяют лишь несколько пред став ителеїі каждого класса). Кроме того, наблюдается значительная противоречивость данных по условиям получения различных производных рассматриваемых классов соединении.
В настоящее время наиболее часто используется два основных метода получения летучих производных вышеуказанных сосдинспиН: сшшлировапие и-реже - этерифпкацня (ацнлировапие) различными реагентами, в том числе ал-килхлорформиатамн. Данные но условиям проведения реакции силилироваиия зачастую противоречивы - разные авторы предлагают различные температурные режимы проведения реакции, время дернватизацнн и используют разные растворители. Результаты, полученные разными авторами в эквивалентных условиях, также отличаются. Второй тип реагентов (различные алкилхлорфор-мнаты) сравнительно недавно получил применение для дернватизацнн аминокислот и жирных кислот. Основным достоинством данного типа реагентов является то, что реакция протекает практически мгновенно в водно-органической среде при ко.мнатной температуре, хотя выход (степень конверсии) очень сильно зависит от выбранного алкшшюрформиата н вспомогательного реагента (спирта). Эта реакция вес еще мало изучена в анализе жирных, дпкарбо-повых и гидрокенкнелот. Ист публикаций, в которых происходило бы одновременное определение амшю-, жирных, дикарбоповых и гидроксикислот и сахарок в одной пробе.
Применимость некоторых описанных в литературе методов получения летучих производных показана только на модельных смесях соединений, а не на реальных объектах, хотя ясно, что матрица может оказывать настолько сильное мешающее влияние, что пи о каком не только количественном, но и качественном установлении состава не может быть и речи. Также в литературе совершенно не рассматривается применение концентрирования при определении изучаемых соединений. Как правило, только малая часть реакционной смеси, полученной после дер и ваті іза ци и, подвергается анализу ( из 0.5-1 лт ко-
7 печного экстракта), что приводит к значительному повышению пределов обнаружения, и ис позволяет в полном мерс раскрыть возможности, предоставляемые современным аналитическим оборудованием.
Необходимо отметить немногочисленность работ по использованию реакционной хромато-масс-снсктромстрии для анализа отдельных груші соединений, относящихся к рассматриваемым классам, хотя она является более высокочувствительным м, в большинстве случаев — высокосслективпым методом. Кроме того, масс-спектры летучих производных регистрируют для относительно больших количеств веществ, хотя известно, что общий вид масс-спектра зависит от концсіпраціпі, и чем ниже концентрация, тем больше масс-спектр может отличаться от библиотечного.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка способа определения жирных, дикарбоновых, гпдроксн-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, спиртов и стеролов в водных и органических растворах (экстрактах) при их совместном присутствии и смеси на уровне следовых концентраций методом реакционной хромато-масс-спсктромстрии и снижения пределов обнаружения за счет использования сорбционного концентрирования из органического раствора (экстракта) с последующим анализом всего концентрата.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: - изучить закономерности енлилпровапия различных жирных, дикарбоновых, гпдроксн-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов в органических растворах с использованием гексаметилднеилазана (ГМДС), N,0-бис(тримстилсплнл)ірифторацстамнда (БСТФА), ^-метил-Л^-третбутил-димстилсшшлтрнфторацетампда (МТБСТФА) н различных растворителей, и выбрать условия ГХ-МС определения соответствующих триме-тнлеплильпых (ТМС) и трстбутплднметилсилильных (ТБДМС) производных; изучить масс-спектры электронной (ЭИ) и химической (ХИ) ионизации для различных количеств этих производных и провести оценку пределов детектирования в режиме регистрации полного ионного тока и селективного ионного детектирования; разработать методологию определения жирных, дпкарбоповых, гндрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов при их одновременном присутствии и смеси па уровне следов методом реакционной ГХ-МС; изучить условия дернватнзацпн в водно-органическом растворе для аминокислот, жирных, дпкарбоповых и других органических кислот с помощью реакции этерифпкации - ацплироваиия (реагент - нзобутилхлорформиат, ИБХФ) и разработать условия ГХ-МС определения получающихся производных; изучить масс-спектры ЭИ п ХИ для различных количеств соответствующих мзобутоксикарбоипльных производных и алкиловых эфиров и оценить пределы детектирования; изучить состав жирных, дпкарбоповых, гндрокси-, оксо- и аминокислот, а также Сахаров, выделенных экстракцией нз лиофшшзнровапной культуры Е. Coli (после дернватизации); изучить состав жирных, дпкарбоповых и аминокислот, выделенных из клеточных культур аденокарциноми прямой кишки человека и фиброб-ластов (после дернватизации), и возможность дифференциации этих типов клеток; разработать способ определения следовых количеств аминокислот в водном расгворе, основанный па получении ТУ-изобутоксикарбошш-О-гептаф-торбутшювых (ИБОК-ГФБ) производных, их экстракции хлороформом, сорбционпом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата.
Научная иовтна. В работе изучены условия дернватизации широкого круга веществ (всего 60 соединении), принадлежащим к юшссам аминокислот, жирных, дпкарбоповых, гндрокси- и оксокислот, а также Сахаров, спиртов и
9 стеролов с использованием следующих реагентов: ГМДС, БСТФА, МТБСТФА, ИБХФ. Показаны преимущества и недостатки каждого способа получения летучих производных и установлены оптимальные условия дериватизацни и определения изученных веществ при их совместном присутствии.
Для всех производных изучены масс-спектры ЭИ для различных количеств веществ. Получены масс-спектры ЭИ ТМС производных ряда органических кислот, Сахаров и стеролов, отсутствующие в библиотеке масс-спектральных данных NIST98. Впервые представлены масс-спектры ЭИ ЛГ-изобуток-сикарбонил-0-пзобутиловых и Л^-пзобутокснкарбонил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, а также гептафторбутиловых эфиров жирных и днкарбоновых кислот. Установлены пределы детектирования всех соответствующих производных в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хро мато грамме) и селективного ионного детектирования, которые составили 2.5x10"9- 2.0x10"12 г и 1.4x10"9- 1.0х10*12г в пробе (в зависимости от соединения и типа производных).
В режиме ХИ положительных ионов изучены масс-спектры ТМС производных гидрокси- и оксокпелот, стеролов и Сахаров; ЛЧізобутоксикарбонил-О-пзобутиловых и jV-изобутоксикарбонил-О-гентафторбутиловых эфиров аминокислот, а также изобутшюиых и гептафторбутиловых эфиров жирных и днкарбоновых кислот. Показано, что пределы детектирования всех изученных производных составляли 3.4хЮ"9 - 5.0х10"12г в режиме регистрации полного ионного тока (по масс-хроматограмме) и І.ОхІО"9 - 1.0х10"12г в случае селективного ионного детектирования (в зависимости от соединения и типа производных).
Предложена методология определения жирных, дикарбоповых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стеролов при их одновременном присутствии в смеси па уровне следов, основанная на обработке одной части образца смесью БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой — смесью ИБХФ с гентафторбутанолом в водно-органическом растворе. При этом в нервом случае в виде ТМС производных определяются все классы
10 соединении, кроме аминокислот, а во втором - аминокислоты, жирные, дикарбоновыс и короткоцепные гидрокси- и оксокислоты.
На основании проведенных исследований установлен состав свободных аминокислот, а также других органических кислот и Сахаров в лнофилизи-рокаииой культуре клеток В. Coli (штамм К-12 Hfrll thi).
Проведено исследование состава жирных, дикарбоповых и аминокислот в суспензии клеток адепокарцшюмы прямой кишки человека и фибробластов и показана возможность дифференциации этих типов клеток на основании различия в составе аминокислот.
Предложен способ определения аминокислот в водных растворах, основанный па получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбцнониом концентрировании этих производных из органического раствора (экстракта) и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мере на 2 порядка.
Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решать задачи определения следовых концентрации широкого круга веществ в водных и органических растворах при их совместном присутствии. Изученные закономерности дерпватпзации соединений различных іслассов позволяют выбрать наиболее подходящий реагент и условия проведения реакции в зависимости от цели и задач исследования, а также предполагаемого состава смеси.
Масс-спектры ЭИ и ХИ, полученные для различных производных всех изученных соединении, позволяют увеличить селективность определения и дополнительно снизить пределы детектирования при использовании селективного ионного дегектирования.
Масс-спектры ЭИ соединений, отсутствующих в библиотеке масс-спек-тральных данных NIST 98, позволяют увеличить достоверность идентификации, что особенно важно в анализе аминокислот в виде изобутокс и карбонильных производных.
Разработанная методология анализа микробиологических образцов позволяет проводить высокочувствительное и селективное определение широкого круга соединении в указанных объектах.
Предложенный способ определении аминокислот в раковых клетках и фибробластах позволяет увеличить достоверность дифференциации раковых и здоровых клеток.
Разработанный способ сорбцпшшого концентрирования из органических растворов обеспечивает возможность снижения пределов обнаружения по крайней мерс на 2 порядка благодаря ГХ-МС анализу всего концентрата.
На защиту выносятся: оптимизированные условия дерпватпзацмн соединений, принадлежащих к классам жирных, дикарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, спиртов, Сахаров и стсролов с использованием таких реагентов, как ГМДС, БСТФА, МТБСТФЛ, ИБХФ; масс-спектры ЭИ ТМС производных различных органических кислот, Сахаров, спиртов и стсролов, а также ЛЧізобутоксикарбоиші-О-изобутиловых, ЛЧізобутокснкарбоішл-0-гептафторбутиловьіх эфиров аминокислот, пзобутшювых и гентафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот, и соответствующие пределы детектирования; масс-спектры ХИ положительных ионов ТМС производных гидрокси- и оксокпелот, спиртов, Сахаров и стеролов, Лг-изобутоксикарбопнл-СЧізо-бутнлоиых и УУ-изобутоксикарбонил-О-гептафторбутиловых эфиров аминокислот, пзобутшювых и гептафторбутиловых эфиров жирных и дикарбоиовых кислот, и соответствующие пределы детектирования; методология определения жирных, дикарбоиовых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, а также спиртов, Сахаров и стсролов при их одновременном присутствии в смеси, основанная па обработке одной части образца смесью БСТФА с пиридином (после высушивания), а другой - смесью ИБХФ с геитафторбутанолом в водно-органическом растворе; результаты определения состава соединений изученных классов, выделенных экстракцией из лпофшшзмрованной клеточной культуры Б. Со И; способ дифференциации клеток аденокарциноми и фибробластов, основанный па определении различия в составе аминокислот методом реакционной ГХ-МС; способ определения аминокислот в водном растворе, основанный на получении ИБОК-ГФБ производных, их экстракции хлороформом, сорбционном концентрировании производных и ГХ-МС анализе всего концентрата, позволяющий снизить пределы обнаружения по крайней мере на 2 порядка. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на
Питгсбургскои конференции по аналитической химии и прикладной спектроскопии (12-17 марта 2000 г., Новый Орлеан, Луизиана, СШЛ), 24-м Международном симпозиуме по хроматографии (15-20 сентября 2002 г., Лейпциг, Германия), и 8-м Международном симпозиуме по гибридным методам а хроматографии (4-6 февраля 2004 г., Брюгге, Бельгия).
Публикации. По материалам работы опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.
Материал диссертации изложен на 178 страницах, содержит 28 таблиц и 83 рисунка. Синеок литературных источников состоит из 96 наименований.
Газохроматографический анализ жирных, дикарбсновых, гидрокси-, оксокислот, спиртов, сахаров и родственных соединений
Получение летучих производных органических кислот (жирных, оксо- и гидр оксикислот, а также дикарбоновых кислот), спиртов и Сахаров представляет собой менее сложную задачу из-за меньшего разнообразия функциональных групп у этих классов соединении (-СООН, -СНО и -ОН) и их химического строения.
Анализ жнршлх кислот ц настоящее время включает несколько основных способов дериваті ізащш, к которым относятся этерификация дназомстаном (метилирование) [58,59], спиртами а присутствии катализатора либо алкилхлорформиатами, и енлилпровапне до ТМС или ТБДМС эфиров (как частный случаи этернфикацни). Кроме того, возможен и прямой (без дерииатизацнп) газохроматографический анализ жирных кислот (обычно С г -Съ иногда до С2г) на колонках с полярной ііснодшілспоії фазой [38-40], однако пределы обнаружения таким методом примерно в 200 раз выше но сравнению с анализом этерифнцированпых жирных кислот. По методам анализа жирных кислот, а также способам их выделения из различных матриц написан рад обзорных статей [41,42].
Наиболее часто в газохроматографическом анализе жирных кислот для получения летучих производных проводят метилирование [43-60]. Поскольку большинство авторов используют один н тот же способ дериватизации, а основные отличия заключаются в проб о подготовке и объектах исследования, ниже будут рассмотрены только отдельные работы.
Так, при определении состава свободных жирных кислот (насыщенных и ненасыщенных) в сыворотке крови [43] применяли следующую методику. К \00мкл сыворотки добавляли 50мкл раствора внутреннего стандарта, ІЗОидаї среды для осаждения белков и 200 мкл изооктана. Полученную смесь встряхивали до образования эмульсии и затем центрифугировали. Отбирали органический слой, смешивали его со 150 мкл раствора для реэкстракции (ацетонитрил - 1% КОН в соотношении 9:1), и снова встряхивали. Верхний органический слой, содержащий нейтральные липиды, удаляли, после чего прибавляли 100 мкл изооктана, смесь снова встряхивали, и удаляли органический слой. К водному слою добавляли 100 мкл раствора, содержащего диметиламинопиридпн (катализатор реакции этерификации), и 50 мкл смеси мстилхлор форм пата с (ізооктаном в соотношении 1:9. Полученный раствор встряхивали, добавляли 100 мкл 1 М раствора соляной кислоты, снова встряхивали, и после расслоения фаз органический слой анализировали. Хроматограмма метиловых эфпров жирных кислот приведена для концентрации около \0 й г в пробе, в работе использовали ПИД. Идентификацию жирных кислот, выделенных их сыворотки, проводили по временам удерживания. Данных о пределах детектирования не приводится, и эта работа является единственной, где для метилирования жирных кислот использовали ал кил хлорформ мат.
В работе [45] проводили определение состава жирных кислот в растительных маслах. Для этого к навеске масла (0.5 г) прибавляли 5 мл 0.5 Л/ раствора NaOII в метаноле и проводили омыление триппщеридов при 140-160С п течение 5 мин. После этого к полученному раствору прибавляли 5 мл метанола, содержащего BF3, и снова нагревали при 140-160 С в течение 5 мин. Затем в раствор добавляли 5 мл гексана и 10 ЛУГ насыщенного раствора NaCl и встряхивали. После расслоения фаз алнквоту органического слоя высушивали над безводным Na2SOj, и анализировали ОЛмкл. В работе приведены сравнительные данные по составу жирных кислот в 8 различных маслах, содержание отдельных соединении варьировалось в интервале 0.3 - 60%.
Аналогичным способом получали метиловые эфиры жирных кислот в работе [47], объектом исследования являлась сердечная мышца крыс. Вначале проводили извлечение жиров из ткани, последовательно обрабатывая подготовленный образец метанолом и хлороформом. Полученный экстракт частично упаривали, а затем наносили его на ТСХ пластинку для разделения жирных кислот, триглицеридои и фосфолипмдои, получая 3 соответствующих пятна. После этого соскабливали участки сорбента, отвечающие этим классам соединений, переносили их в пробирку и обрабатывали 7% раствором BF3 в метаноле при комнатном температуре в течение 15,-шш, Степень извлечения жирных кислот из матрицы составила 90- 105%. Идентификацию метиловых эфиров проводили по временам удерживания (С4 - С24, включая ненасыщенные). Авторы указывают, что несмотря па использование высокочистых реагентов и растворителей, фоновое содержание некоторых жирных кислот было около 5x10"7 г в пробе (100 мг), и это не позволило им снизить пределы обнаружения ниже этой величины.
В работе [48] при определении жирных кислот, выделенных из лппопротеи-нов плазмы, пробоподготопку проводили аналогично [47J. Для метилирования использовали 1 М раствор мстплата натрия в безводном метаноле. После нейтрализации 1 М раствором уксусной кислоты, образовавшиеся эфиры извлекали гексаном, экстракт пропускали через колонку с Na2SOj, упаривали досуха, остаток заново растворяли в изооктанс и затем анализировали полученный раствор. В работе представлены обширные статистические данные, касающиеся погрешности каждой стадии эксперимента, пределы детектирования отсутствуют (использовали ПИД).
Определение состава жирных кислот в различных съедобных растениях пропели авторы работы [50]. Образцы растений промывали, высушивали и измельчали, после чего обрабатывали пстролейным эфиром. Для метилирования выделенных жирных кислот использовали раствор ацетплхлорнда в метаноле. Подробности дериватпзацип не указаны; данные о пределах детектирования также отсутствуют (ПИД).
Дериватизация аминокислот с использованием гексаметилдисилазана
БСТФЛ использовали для получения производных всех модельных соеди-псннЛ, включая аминокислоты, а МТБСТФЛ - только для аминокислот.
В случае дериватпзации с предварительным окснмироваиием готовили свежий раствор модельных соединений в окснмирующем растворе. Через 30мин \00мкл полученного после оксимнрования растиора смешивали с 200 мкл БСТФА и нагревали в течение часа при 70-120С. Если оксимиро-вание не проводили, брали 100 мкл исходного раствора модельных соединении в пиридине и прибавляли 100 - 200 мкл БСТФА, после чего нагревали полученную смесь в течение часа при 100С. 1 мкл раствора после дериватпзации вводили в хроматограф.
При дериватпзации аминокислот \00 мкл исходного раствора аминокислот в 0.1 М или 0,01 М ІІС1 упаривали досуха в токе азота при комнатной температуре. Остатки воды удаляли, троекратно обрабатывая сухой остаток 500 мкл дихлорметаиа. Затем к сухому остатку прибавляли ЮОлнсл ацето-иигрила и ЮОлго БСТФА либо МТБСТФА, и нагревали: в нервом случае в течение 4 часов (первый отбор пробы проводили через 15 мин) при 135С на масляной бане, во втором случае — 30 мин при 70С. 1 мкл полученных реакционных смесей вводили в хроматограф.
К 100 мкл раствора аминокислот в 0.1 М, 0.01 МНС\ или бидистиллирован-ной воде прибавляли 15-40 мкл изобутанола либо гептафторбутанола, 10 мкл пиридина и подвергали смесь кратковременному воздействию ультразвукового поля (30 сек). После этого к полученной смеси добавляли 10-30 мкл ИБХФ и повторно вносили смесь в ультразвуковую ванну (30 сек). Экстракцию образовавшихся производных проводили 200 - 500 мкл хлороформа. После центрифугирования 1 мкл органического слоя вводили в хроматограф, 2.3.5. Дериватизация жирных и дикарбоновых кислот с использованием изобутилхлорформиата
К 60 - 80 мкл бндистпллнрованпой воды добавляли 15-40мкл изобутанола либо гептафторбутанола и Юмкл исходного пиридинового раствора жирных либо дикарбоновых кислот и подвергали смесь кратковременному воздействию ультразвукового поля (30 сек). После этого к полученной смеси прибавляли 10- 30 мкл ИБХФ и повторно вносили смесь в ультразвуковую ванну (30 сек). Экстракцию образовавшихся производных проводили 500 мкл хлороформа. После центрифугирования 1 мкл органического слоя вводили в хроматограф.
Приготовление лиофилизированных препаратов культуральной жидкости с клетками бактерий Escherichia Coli
Лнофплнзированпыс препараты культуральной жидкости с клетками бактерий E.Coli К-12 Hfrll Ihi (далее лиофилизат) были приготовлены сотрудниками кафедры микробиологии биологического факультета МГУ В.В. Куц, Н.В. Угольковон, И.Б. Котов о ii и А.Д. Измайловым. Клетки культивировали на жидкой синтетической среде Гловера (NHjCl — 5.0 г/л, NII4NO3 - 1.0 г/л, Na2SO.,- 2.0 г/л, К211Р04 - 1.0 г/л, MgS04 7H20 - 0.1 г/л, глюкоза - 8.0 г/л; рН среды - 7.3) в течение 24 часов. После этого клетки осаждали центрифугированием при 5000об/шш, замораживали в жидком азоте для разрушения клеточных оболочек и проводили лпофпльиую сушку и течение 3 суток.
Культуры клеток аденокарциномы и фибробластов были приготовлены сотрудниками Онкологического научного центра НЛО. Анисимовой и М.В. Киселевским.
Пробы клеток аденокарциномы готовили следующим образом. Выращивание клеток проводили в среде RPMI-1640 (25 мМ HEPES, 24 мМ ЫаНСОз, все незаменимые аминокислоты). Центрифугировали взвеси клеток в среде RPMI-1640 («ПапЭко») 10 мин при 800 g. Удаляли 2/3 сунернатанта, а оставшуюся 1/3, содержащую клеточный детрит и дефектные физиологически неактивные клетки, оставляли в качестве коїпроля. Добавляли к равным объемам осадка ц супсриатапта, содержащего детрит, десятикратный объем 0.9% раствора NaCI и центрифугировали Юмгш при 1000 g. Удаляли из обеих проб супернатант, ре-суспендировалн осадок и отмывали его 10-кратным объемом 0.9% раствора NaCI, и снова центрифугировали 10.шш при 1000g. Эту операцию повторяли дважды, доводя количество отмываний клеток от среды и детрита до 3. После удаления супсриатапта 11 рссуспсиднрованпя осадков в равных объемах 0.9% раствора NaCI оценивали физиологическое состояние и концентрацию клеток в полученных взвесях с помощью микроскопии. Содержание физиологически ак-тинных опухолевых клеток составляло 2.3x10 в I мл раствора, или 2.3х10"3 г/мл, полагая массу одной клетки около 10" г. Содержание же физиологически неактивных клеток-2.9x106 и 2.9x10" г/мл, соответственно. Для вскрытия клеток проводили троекратное замораживание образцов в жидком азоте и размораживание.
Контрольную пробу среды готовили следующим образом. К среде Rl MI-1640 добавляли эмбриональную телячью сыворотку («ПанЭко») до конечной концентрации 5%. К объему среды, равному объему взвеси отмываемых клеток аденокарциномы, добавляли 10-кратиый объем 0.9% раствора NaCI. Центрифугировали среду около 10 мин при 1000 g и затем удаляли верхний слой. Повторяли описанные действия троекратно для получения контрольной пробы куль-туралыюй среды, разведенной физиологическим раствором до состояния, адекватного концентрации среды в опытной пробе, содержащей взвесь клеток аденокарциноми.
Подготовку проб фибробластов проводили следующим образом. Из флаконов с культурой клеток в центрифужные пробирки сначала сливали всю куль-туральную среду (UPMI-1640) со свободноплавающими фнбробластами. Затем во флаконы добавляли раствор Версепа («ПанЭко») для ослабления адгезии зафиксированных пристеночных клеток, выдерживали IS мин и добавляли его к первой порции в центрифужную пробирку
Силилирование жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, сахаров, спиртов и стеролов
Гексаметилдисилазан (рис. 1) один из наиболее доступных реагентов для получения тримстнлемлмльных производных, и он широко используется в настоящее время її практике реакционной газовой хроматографии. Деривагмзация ГМДС требует присутствия в качестве катализатора ірифторуксусноіі кислоты (ТФУК). Рис. 1. Ґексаметилдисилазан {MM- 161.40, tKun= 126.7"C)
Получение летучих производных аминокислот представляет собой наиболее сложную задачу, поэтому нами прежде всего была изучена возможность дериватизации именно этого класса соединении. Поскольку аминокислоты очень плохо растворимы в органических растворителях, для дериватизации используют упаренные досуха водные растворы. Необходимо заметить, что аминокислоты в водном растворе при рН1 существуют в виде внутренних солей, и для разрушения этой струїсгуріл их стандартные растворы всегда готовят в ОЛ М І-ІС1.
В литературе описано применение ГМДС для дериватизации аминокислот [23], однако в работе были получены ТМС производные только 4 соединений (аланнна, ссрина, пролініа и глютамовой кислоты), и оставался открытым вопрос, связано ли это поставленной авторами задачей, млн является принципиальным ограничением данного способа дериватизации.
Проведение дериватизации модельного раствора аминокислот в оптимальных условиях, выбранных в результате эксперимента (100С в течение 1 ч), показало, что были получены производные только для аланнна, глицина, валшш, лейцина, пзолеГщнна, пролила, серила, треошша, метношша, тирозина и триптофана, т.е. 11 из 17 соединений. Более того, масс-спектрометричсское исследование выявило, что и ряде случаев происходило образование не JV-тримстил-силил-0-ТМС эфнров аминокислот, а ТУ-трифторацетил-О-ТМС эфиров. Это означает, что ТФУК сама взаимодействовала с аминокислотами, ацилируя их по аминогруппе, а реакционной способности ГМДС не хватало для замещения трифторацетильной группы на ТМС группу. К недостаткам этой реакции следует отнести необходимость работы с агрессивной ТФУК, выделение аммиака (а значит, опасность проведения реакции із замкнутом объеме) и образование осадка NH4CF3COO, па котором может происходить адсорбция образующихся производных. Поэтому, в дальнейших исследованиях мы отказались от использования ГМДС в качестве дерииатизирующего реагента.
Дериватизация Л/,0-бис(триметилсилил)трифторацетамидом ЛГ,0-бнс(трнмстшісіілші)трііфторанстамнд (рис. 2) является наиболее универсальным реагентом, который часто применяется в настоящее время для дс-риватнзацин широкого круга полярных соединений и отличается сравнительно невысокой стоимостью. Как правило, в КСТФА добавляют 1% триметилхлор-енлана, который является катализатором и повышает выход производных. Именно такую смесь использовали в настоящей работе.
БСТФА был применен для дерпватнзацнп всех изучаемых соединений. Обычно при проведении этой реакции требуется присутствие полярного растворителя - имеющиеся в литературе данные указывают на то, что выход ТМС производных в этом случае выше. Чаще всего используют такие растворители, как пиридин, ацетонитрил, димстнлформамид и, реже, тстрагидрофуран. На основании проведенных исследований нами было установлено, что пиридин является лучшим растворителем для всех изучаемых соединений (за исключением аминокислот), тогда как при использовании ацетонитрил а или тетрагидрофу-рана полного растворения Сахаров и некоторых других веществ добиться не удавалось. Модельные соединения были разбиты на несколько групп (см. табл. 2), поскольку в противном случае наблюдалось частичное либо полное перекрывание хроматографических никои, отвечающих соответствующим производным.
Перед дернвапгзацпен оксокнелот и Сахаров, как правило, проводят ок-симпроваиие. В нервом случае это необходимо для защиты реакционноспо 80 собноіі кстогрупны (особенно в омоложении), а в случае Сахаров — для разрушения апомерного центра в фуранозном или ниранозном кольце, чтобы предотвратить образование нескольких производных для каждого соединения, отвечающих а- и /?-апомсрам (может образоваться 4 продукта: а-фуранознд, (3-фуранозид, ог-нпранознд и /?-пиранозпд в виде ТМС эфиров). Однако оксимам также свойственна изомерия, поэтому для ТМС производных оксокислот и Сахаров может наблюдаться дна пика, соответствующих сип- и дш/ш-изомерам одного и того же соединения. Соотношение сип- и аити-изомеров индивидуально для каждого соединения, однако иногда эти изомеры элюируются одновременно. ІІапш исследования показали, что оксимировапис не является критичным этапом дернватизацни и его можно опустить без потери чувствительности определения.
При поиске условий дершттизации, которые были бы применимы ко всем модельным соединениям (за исключением аминокислот, требующих иной нробоподготовки), варьировали соотношение реагента и растворителя, а также температуру и время проведения реакции. Исследование показало, что максимальный выход производных наблюдался при соотношении объемов пиридина (содержащего дернватизнруемыс соединения) и БСТФА 1:2, температуре 100С и времени проведения реакции 1 час.
Было обнаружено, что при хранении в холодильнике при 6С через 12 часов площади пиков соответствующих производных уменьшались на 10%, а затем оставались постоянными в течение недели. В табл. 3 приведены времена удерживания ТМС эфиров, которые были получены для всех изученных модельных соединений, за исключением аминокислот.
Изучение масс-спектров силильных эфиров жирных, дикарбоновых, гидрокси-, оксо- и аминокислот, Сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования
Режим электронной ионизации в масс-спектрометр и и в сочетании с газовой хроматографией применяется наиболее часто, поскольку он обеспечивает получение важной информации о структуре соединения, а существующие обширные базы масс-спсктральпых данных во многих случаях позволяют проводить достоверную идентификацию компонентов, элюирующихся из хроматографиче-ской колонки. К другим достоинствам ЭИ следует отнести высокую чувствительность (на уровне 10 12г и иногда ниже) и сравнительную простоту реализации (по сравнению с химической ионизацией).
Одновременно с поиском оптимальных условий дериватизацпи модельных соединений памп были изучены масс-спектры соответствующих производных и установлены характеристичные попы, что было необходимо для достоверной идентификации и оценки пределов детектирования.
Исходя из молекулярных масс ожидаемых производных (188-918 Д), после ряда проведенных исследований нами был выбран диапазон сканирования 80-650Д. Нижняя граница обусловлена присутствием в масс-спектрах всех тримстнл сил ильных эфиров интенсивного пика иона с m/z = 73, отвечающего ТМС группе. Вклад профиля ионного тока по этому иону в полный ионный ток был очень значительным, и поэтому мы исключили этот малоинформативпый ион из диапазона сканирования. Надо заметить, что чем меньше величина m/z у осколочных ионов, тем ниже их информативность. Верхняя граница диапазона была выбрана исходя из максимальной массы регистрируемых осколочных ионов.
В табл. 9 приведены характеристичные ноны в масс-спектрах ТМС и ТБДМС производных всех модельных соединений, полученных в выбранных нами оптимальных условиях.
Как видно из табл. 9, большинство соединений претерпевало значительную фрагментацию. Интенсивность пика молекулярного иона [М\+ была незначительной, либо ион [Л/]+ отсутствовал в масс-спектрах. У всех ТМС производных (а также некоторых ТБДМС эфиров аминокислот) в масс-спектре присутствовал малопитеиспвньні пик иона [М-СНзУ- Для ТБДМС эфиров аминокислот типичным являлся отрыв третбутнльнои группы, что приводило к появлению соответствующих ионов [М-С4Нд]+. Ион с m/z = 147 типичен для большинства силмльных эфиром, содержащих как минимум две ТМС группы, и обладает следующим строением:
Показано, что в случае жирных кислот соотношение интенсивиостей пиков ионов с m/z 129 и 132 может служить показателем насыщенности / ненасыщенности: так, для насыщенных жирных кислот I (m/z 129) й I (m/z 132), а при наличии двойных связей -/ {m/z 129)» / (m/z 132).
В масс-спектрах ТМС производных изомерных Сахаров, фруктозы и галактозы, присутствовали одинаковые ионы, однако их интенсивности существенно отличались.
Следует заметить, что использованная нами версия библиотеки масс-спек-тральпых данных NIST (за 1998 год) содержала сведения не для всех ггроизвод пых изученных соединенпіі: в ней отсутствовали масс-спектры ТМС эфиров упдекаповоп кислоты, всех ненасыщенных жирных кислот (за исключением лпнолеповоп), 15-гндроксппснтадскаповой, 22-гидроксидокозаповой, хинной, шикнмовой (приведена ошибочная формула, ID U 84729), хлорогеиовой кислот, «-октил- /З-глюкопираиозида, сахарозы, трегалозы, лииалоола и всех стеролов (за исключением катсхола), и кроме этого - ТБДМС эфиров изолейцииа и аргинина. Масс-спектр ТМС эфира а-кетопропионовой кислоты, полученный нами, не соответствует масс-спектру, приведенному п NIST, при этом у нас есть все основания полагать (исходя из возможных направлений фрагментации), что в библиотеке представлены ошибочные данные (номер спектра и базе ID U 65893).
С целью проверки линейности отклика детектора масс-спектры всех производных регистр провал и для количеств 5xl0 s - 2х10"10г в пробе. Исследование показало, что в этом диапазоне концентраций для каждого соединения зависимость площади пика от введенного количества представляет собой прямую линию. Получение масс-спектров для малых количеств веществ было необходимо как для корректной оценки пределов детектирования, так и само по себе, поскольку известно, что вид масс-спеїора может сильно зависеть от концентрации.
Оценку пределов детектирования для ТМС / ТБДМС производных всех изученных соединений проводили в режиме регистрации полного ионного тока (ПИТ) и селективного ионного детектирования (СИД). В последнем случае собирается только профиль ионного тока по некоторому заданному (характеристичному) иону. Довольно часто (при высоком уровне фонового тока — например, при анализе реальных проб) режим СИД позволяет дополнительно снизить пределы детектирования в 3-10 раз и более. Однако, если в масс-спектре присутствует несколько интенсивных пиков, отвечающих различным in/z, то выигрыша в чувствительности может и не быть.
В табл. 10 приведены пределы детектирования енлилышх эфиров изучаемых соединении, рассчитанные экстраполяцией высот пиков к тому количеству too вещества, при котором соотношение сигнал/шум состаиит 3:1. Оценку пределов детектирования в режиме ПИТ проводили но масс-хроматограмме, построенной но наиболее интенсивному иону. Эти же попы использовали для получения профиля ионного тока в режиме СИД.
Как видно из табл. II, нон [М-101] отвечающий отщеплению группы СД ОСО, присутствовал и масс-спектрах производных всех аминокислот, за исключением лизина, триптофана и цнетииа, причем его интенсивность во многих случаях была максимальной. Ион с m/z 91 [С СНгТ характерен для производных ароматических аминокислот, феиилаланина и тирозина, причем в последнем случае интенсивность этого иона очень низка из-за присутствия гидроксигрунпы в кольце. Рассмотрение масс-спектра производного аспарагина позволило предположить, что его амидогруппа не только не деривати-зировалась, по и элиминировала воду с образованием нитрила. По всей видимости, это происходило в инжекторе, поскольку пик производного аспарагина был несимметричным
