Содержание к диссертации
Введение
1. Хроматофокусирование на анионообменных и катионообменных колонках. 13
1.1. Принципы разделения цвиттер-ионных макромолекул методом ХФ 15
1.2. Разделение переходных металлов методом ХФ 17
1.3. Ионообменные сорбенты для хроматофокусирования 19
1.3.1. Матрица 21
1.3.2. Функциональные группы 23
1.4. Катионообменные сорбенты 27
1.4.1. Разделение белков 28
1.4.2. Разделение пептидов 32
1.5. Подвижные буферные фазы в градиентном элюировании 35
1.5.1. Стартовые (уравновешивающие) растворы 35
1.5.2. Элюенты, используемые в хроматофокусировании 37
1.5.2.1. Полибуферные элюенты (полиамфолиты, полибуферы) 38
1.5.2.2. Многокомпонентные буферные смеси 40
2. Изучение особенностей формирования градиентов PH 43
2.1. Моделирование градиентов рН. 43
2.1.1. Модель Слайтермана 43
2.1.2. Модель Мурела 44
2.1.3. Модель Фрея 44
2.1.4. Модель Тессмана 45
2.2. Изучение процессов формирования градиентов рН 46
2.2.1. Влияние ионной силы 46
2.2.2. «Аномальный» подъем 50
2.2.3. Совместное влияние ионной силы и слабого основания в подвижных фазах 54
2.2.4. Примеры разделения 56
3. Индуцированные градиенты ph 58
4. Аппаратура, реагенты, методики экспериментов. 61
4.1. Аппаратура 61
4.2. Сорбенты, реагенты, растворы. 62
4.3. Методики экспериментов 64
5. Свойства карбоксильных сорбентов. 67
5.1. Выбор сорбента для ХФ металлов 67
5.2. Кислотно-основные свойства карбоксильных сорбентов 68
5.3. Комплексообразующие свойства СМ-52 69
5.4. Сравнение свойств карбоксильных сорбентов 73
5.4.1. Кинетика сорбции 73
5.4.2. Комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов 74
5.4.3. Сорбционная емкость 75
5.4.4. Селективность сорбции 78
5.4.5. Извлечение ионов Си2+ в зависимости от рН 78
6. Нисходящие градиенты рн в хроматофокусировании 81
6.1. Выбор подвижных фаз 81
6.1.1. Полиамфолитные элюенты 82
6.1.2. Влияние природы стартового раствора 85
6.1.3. Простые элюенты 86
6.2. Влияние ионной силы элюента 92
6.3. Разделение переходных металлов 95
6.4. Градиент ионной силы 97
7. Индуцированные нисходящие градиенты РН. 101
7.1. Выбор подвижных фаз 102
7.1.1. Влияние концентрации ИР 103
7.1.2. Влияние концентрации элюента 105
7.1.3. Влияние слабого основания в составе элюента 106
7.1.4. Влияние природы элюента 108
7.1.5. Влияние ионной силы подвижных фаз 109
7.1.6. Влияние природы электролита в составе элюента 111
7.1.7. Ацетатная система 112
7.2. Разделение ионов металлов 114
8. Восходящие градиенты рн в хроматофокусировании 118
8.1. Выбор подвижных фаз 118
8.1.1. Влияние природы и концентрации стартового раствора 120
8.1.2. Влияние природы элюента 121
8.1.3. Влияние слабого основания в составе стартового раствора 122
8.2. Влияние ионной силы элюента 123
8.3. Разделение модельной смеси белков. 127
8.4. Влияние ионной силы стартового раствора 128
8.5. Восходящие градиенты рН на сорбенте для ВЭЖХ 129
8.5.1. Влияние ионной силы подвижных фаз 129
8.5.2. Разделение изоформ ферментов 132
8.6. Восходящие градиенты рН на сильных катионообменниках 133
8.6.1. Влияние ионной силы элюента 133
8.6.2. Разделение пептидов 134
8.6.2.1. Выбор подвижных фаз 134
8.6.2.2. Влияние ионной силы стартового раствора 135
8.6.2.3. Влияние добавок ацетонитрила 137
8.6.2.4. Влияние ионной силы элюента 139
8.6.2.5. Одновременное влияние ионной силы и добавок ацетонитрила 142
Выводы 144
- Разделение переходных металлов методом ХФ
- Изучение процессов формирования градиентов рН
- Сорбенты, реагенты, растворы.
- Влияние ионной силы элюента
Введение к работе
Актуальность работы. Ионообменная и комплексообразовательная хроматография находят все большее применение в аналитической химии за счет расширения круга определяемых соединений и появления все новых модификаций данных вариантов жидкостной хроматографии. Одним из важнейших параметров, позволяющих повышать селективность разделения, является рН подвижной фазы. Часто в хроматографии используют градиентное элюирование, т.е. изменяют состав элюента по определенному правилу. Так, в 1979 г. Слайтерман разработал хроматофокусирование (ХФ) - метод ионообменной хроматографии, основанный на элюирований с внутренним (создаваемым внутри колонки) градиентом рН. В настоящее время используют две техники формирования градиентов рН - «классическое» хроматофокусирование и индуцирование. ХФ обычно применяют для разделения биологических объектов - белков, пептидов, аминокислот, реже азокрасителей и других цвиттер-ионных соединений. В начале 1990-х П.Н. Нестеренко и А.В. Ивановым был предложен метод концентрирования и разделения переходных металлов на одной колонке с использованием техники хроматофокусирования. Традиционно для этих целей формируют нисходящие градиенты рН на анионообменных сорбентах. Однако комплексообразование ионов металлов с аминогруппами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой, в связи с чем целесообразен переход к катионообменным карбоксильным сорбентам.
Хроматофокусирование на катионообменных сорбентах является малоизученным, развивающимся методом разделения и концентрирования цвиттер-ионных соединений. Метод применим для разделения цвиттер-ионов с положительным зарядом в кислой среде, становящихся незаряженными в целом в нейтральной или щелочной средах, что характерно для белков и пептидов. Традиционно в данном методе используют подходы, характерные для ХФ на анионообменных сорбентах. В частности, применяют полиамфолитные элюенты, обладающие рядом недостатков - высокой ценой, склонностью к биодеградации, взаимодействием с разделяемыми компонентами и значительным светопоглощением в используемой для детектирования области спектра. Актуальна замена подобных подвижных фаз на более простые, не имеющие таких ограничений.
Перспективно изучение нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок из-за возможности применения их для разделения и концентрирования переходных металлов. Несмотря на высокий уровень развития метода ХФ в целом, в литературе отсутствуют данные по нисходящим внутренним градиентам на катионообменных колонках. Также не изучен другой вариант хроматофокусирования - индуцирование градиентов рН в слое катионообменного сорбента.
При хроматофокусировании пептидов не удается проводить УФ детектирование при оптимальных длинах волн (ниже 254 нм) из-за высокого фонового поглощения компонентов подвижных фаз. Поиск простых элюентов, позволяющих регистрировать сигнал пептидов при 214 нм, является очень важной задачей при анализе гидролизатов белков.
Цель и задачи исследования,
Изучение кислотно-основных и комплексообразующих свойств карбоксильных сорбентов. Определение селективности данных сорбентов по отношению к ионам переходных металлов в зависимости от рН в статических условиях.
Формирование внутренних, нисходящих и восходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок при использовании техники «классического» хроматофокусирования и техники индуцирования.
Изучение влияния на профиль градиентов рН состава, концентрации и ионной силы подвижных фаз (стартовых и индуцирующих растворов, элюентов) с целью получения линейных градиентов в широком диапазоне рН.
Демонстрация принципиальной возможности разделения ионов переходных металлов на катионообменниках при использовании вышеупомянутых техник формирования градиентов рН внутри хроматографических колонок.
Разделение переходных металлов методом ХФ
В 1990-х гг. появились первые публикации об использовании градиентного элюирования для разделения смесей неорганических веществ. Нестеренко и Иванов впервые применили элюирование с внутренним линейным градиентом рН для разделения смеси 3-5 ионов переходных металлов на хелатообразующем сорбенте [17]. В основу метода положена способность ионов переходных металлов удерживаться в хроматографической колонке за счет комплексообразования с аминогруппами при исходно более высоких значениях рН элюента с последующим разрушением поверхностных комплексов при скачкообразном уменьшении рН элюента и плавном его снижении вдоль слоя сорбента в колонке [17, 38]. Изучены комплексообразующие свойства РВЕ-94 [17] и сорбентов на основе кремнезема с привитыми прапиламином (АП-), этилендиамином (ЭДА-), диэтилентриамином (ДЭТА-), тетраэтиленпентамином (ТЭПА-) [39] по отношению к переходным металлам; показана возможность разделения переходных металлов при элюировании с внутренним градиентом рН [17, 18, 39-42] (рис. 1, 2). Детектирование металлов при хроматофокусировании в виде комплексов с ПАН, ПАР и другими реагентами в результате соответствующей послеколоночной реакции является наиболее эффективным 43-48]. К особенностям метода можно отнести высокую селективность и эффективность хроматографического разделения, а также расширенные возможности по применению в аналитической химии. В первую очередь это обусловлено возможностью концентрирования и разделения с использованием одной хроматографической колонки, что позволяет снизить пределы обнаружения. Так, даже при использовании крупнозернистого Силохрома с привитыми группами тетраэтиленпентамина в варианте колоночной хроматографии низкого давления возможно разделение пяти переходных металлов (рис. 2), Выраженная комплексообразующая способность аминосодержащих химически модифицированных кремнеземов (ХМК) по отношению к ионам переходных металлов в растворах с рН 6-8, позволяет проводить их предварительное концентрирование после уравновешивания колонки стартовым буферным раствором, Из сравнения рисунков 1 и 2 видно, что различие типа привитых аминогрупп и влияние матрицы сорбента приводит к изменению порядка выхода ионов металлов из колонки. Исходя из принципов, заложенных в основу метода, можно сказать, что большую роль в ХФ играет выбор сорбента: его буферные и сорбционные свойства, тип функциональных групп, матрица.
Поэтому в следующем разделе подробно остановимся на известных сорбентах, использующихся для ХФ и в некоторых смежных методах разделения цвиттерионных соединений. 1.3, Ионообменные сорбенты для хроматофокусирования Помимо обычных требований, предъявляемых к сорбентам в ионообменной хроматографии: низкого сопротивления массообмену; отсутствия набухания в органических растворителях и воде; наличие развитой удельной поверхности; стабильности свойств сорбентов (например, несмываемость стационарной фазы при использовании различных элюентов в широком интервале рН) и некоторых других, для сорбентов в ХФ существует ряд специальных требований. К ионообменникам не предъявляются особенно жесткие требования по однородности поверхности, так как электростатические взаимодействия значительно сильнее ван-дер-ваальсовых. Сорбенты должны обладать гидролитической стабильностью в широком диапазоне рН от 1-2 до 10-11. Это определяется тем, что при решении различных задач требуется получение градиентов в ограниченных, но совершенно разных диапазонах рН. Например, для отделения лизоцима (р! 11) нужно создавать градиент в сильнощелочном диапазоне, а для разделения некоторых пептидов (pi 3) до рН 2.5 и ниже [13]. В ХФ применяют ионообменные сорбенты на основе органических полимеров (полисахаридов, полиакриламидов), а в последние 15 лет и на основе неорганических полимеров (химически модифицированных кремнеземов (ХМК)) [43-46]. Все чаще используют смешанные матрицы -кремнеземы, покрытые слоем органополимера [25, 30-32, 34, 54]. По типу функциональных групп сорбенты в ХФ можно классифицировать следующим образом: полифункциональные анионообменники; монофункциональные анионообменники; монофункциональные катионообменники. Ионообменная емкость для сорбентов в ХФ, как правило, составляет 1,0-10 ммоль/г для ХМК и 3-50 ммоль/г для модифицированных сополимерных сорбентов, что на 1-2 порядка выше, чем для сорбентов, применяемых в ионной хроматографии (ИХ). В ИХ используют разбавленные элюенты, обеспечивающие низкий уровень электропроводности, на фоне которой происходит детектирование разделяемых ионов. Соответственно, применяемые в ИХ ионообменники должны иметь невысокую ионообменную емкость. Высокая емкость органополимерных ионитов по сравнению с кремнеземными [55] обусловлена, прежде всего, их способностью набухать в растворе и относительно узкими порами.
Для органических молекул (особенно большого размера, например, полимерных) большинство ионообменных групп после набухания сорбента остаются недоступными [56]. Кроме того, в ХФ сорбент должен обладать достаточной буферирующей способностью в широком интервале рН, чтобы обеспечить формирование максимально плавного градиента, без резких снижений рН. Для этого необходимо большое количество ионообменных групп (ел або кислотных или слабоосновных) на поверхности сорбента. Таким образом, сорбенты для ХФ характеризуются высокой ионообменной емкостью. Сорбенты на основе органополимерных матриц устойчивы в широком диапазоне рН 1-11, но они набухают в воде, подвергаются воздействию микроорганизмов (особенно в случае с полисахаридной матрицей); их частицы менее устойчивы при высоких давлениях, что ограничивает применение таких сорбентов в системах с высоким рабочим давлением. В качестве матрицы для сорбентов применяют сефадекс, представляющий собой полисахаридные декстрановые цепи, поперечно сшитые между собой цианурхлоридом для получения более жесткой пространственной структуры [25], с размером частиц 40-120 мкм: DEAE-Sephadex, TETA-Sephadex и др. (табл. 1) [57]. Известен ряд сорбентов для ХФ на основе полисахаридных матриц - агарозы, целлюлозы, а также на основе полиакриламидных гелей: А-17, DEAE-Bio-gel A, CM-Bio-gel А, DEAE-Bio-gel Р и др. [23, 24, 29, 54, 50-52] (табл. 1). Сорбенты на их основе чаще применяют в препаративном варианте ХФ низкого давления, чем в аналитическом варианте, требующем более высокого рабочего давления [30-34]. В последние годы сорбенты на основе полиакриламида стали применять в ХФ шире. Показано, что DEAE-Bio-gel с размером частиц 10-20 мкм (табл. 1) можно успешно использовать в микроколоночном варианте хроматофокусирования белков и аминокислот [53-55]. Макропористая матрица имеет существенные преимущества перед использованной ранее непористой матрицей, так как обладает меньшим сопротивлением массообмену и способствует повышению эффективности колонки и разрешению пиков [54]. Кроме того, использование мелкодисперсных частиц (5-7 мкм) с высокоразвитой поверхностью (200-400 м2/г) и более высокой концентрацией привитых функциональных групп повышает линейность внутреннего градиента за счет увеличения буферной емкости в более широком диапазоне рН [64]. В наши дни все больше развивается высокоэффективное хроматофокусирование [30-32, 34, 54]. В связи с этим шире используют сорбенты на основе кремнеземов, поскольку они обладают высокой прочностью и несжимаемостью частиц при давлениях до 60-80 МПа. Также к плюсам кремнеземов относятся: оптимальная геометрическая структура, высокоразвитая поверхность, малый размер частиц (2,5-5 мкм), узкое распределение фракций (+ 20%), гидролитическая стабильность в интервале рН 1-8, устойчивость к воздействию микроорганизмов. Такие сорбенты не набухают в растворителях и имеют низкое сопротивление массообмену.
Изучение процессов формирования градиентов рН
Компьютерные эксперименты показали, что при определенном соотношении сильного электролита в подвижных фазах происходит сглаживание некоторых участков градиента рН. Так, при пропускании через колонку со слабоосновным анионообменником (предварительно уравновешенную стартовым растворам) элюента простейшего состава, содержащего только NaCI и один активный (рН-определяющий) компонент в форме одноосновной кислоты НА, на выходной кривой эффлюента наблюдаются два фронта. На рис. 10 приведен ряд градиентов рН для элюентов, различающихся концентрацией инертного компонента NaCI. На профиле расчетного градиента рН можно выделить те же участки -начальный подъем рН до 7.6, плавное уменьшение рН до 6.9, резкий спад до второй ступени (рН 5.3) и далее - плавное уменьшение до рН элюента (рис. 13, кривая 2). Различие в форме и положении второй ступеней авторы связывают с недостаточно точным моделированием свойств сорбента, в частности, в модель заложено описание сорбента Tetren-SiC 2 с привитыми группами тетраэтиленпенамина, по свойствам близкого к Dien-SiC 2. Однако, несмотря на некоторое различие между экспериментальным и расчетным градиентами рН, но, учитывая большую сложность процессов, протекающих в системе, подобное совпадение можно считать удовлетворительным. Более того, как отмечают некоторые исследователи, точное совпадение форм расчетного и экспериментального градиентов рН в большинстве случаев и не требуется. Наличие характерных участков на профиле расчетного градиента рН и форма градиента в целом уже позволяют опытным экспериментаторам судить о пригодности или непригодности для разделения градиента, рассчитанного в заданных хроматографических условиях. Как уже упоминалось выше, другим «тонким» эффектом является повышение рН на начальном участке градиента выше рН стартового раствора. Нестеренко с сотр. [114, 115] связывает появление "аномального подъема" на начальном участке градиента рН либо с высокой ионной силой элюента, либо с присутствием слабого основания в составе подвижных фаз. Для подтверждения данной гипотезы Тессман и Иванов [112] провели ряд экспериментов, в которых в качестве элюентов использовали гомологический ряд двухосновных кислот - щавелевую, малоновую и янтарную кислоты. Во всех случаях, кроме янтарной кислоты, на профиле градиента рН наблюдалось увеличение рН на начальном участке (рис. 14). Далее Нестеренко и сотр. [111] показали, что, варьируя ионную силу стартового раствора, можно полностью избавиться от подъема рН на начальном участке.
На рис. 15 представлены градиенты рН, полученные при различной ионной силе СР и постоянной собственной ионной силе элюента. Для того, чтобы показать, как меняется положение и форма участка градиента, связанного с влиянием слабого основания, при увеличении ионной силы СР, кривые на рис. 15 размещены последовательно. Авторы связывают это с тем, что при повышении ионной силы подвижной фазы происходит увеличение условных констант протонирования аминогрупп сорбента, и, следовательно, дополнительное протонирование этих групп, В итоге, часть протонов из подвижной фазы переходит в неподвижную, а в качестве противоионов связываются хлорид-ионы, которых в элюенте в избытке из-за присутствия NaCI (уравнение 4), Таким образом, соотношение концентраций оснований, находящихся в подвижной фазе (Трис, оксалат-ион}, и концентраций их протонированных форм изменяется в пользу первых, рН эффлюента повышается. С другой стороны, можно предложить универсальное объяснение для явлений, обуславливающих повышение рН выше рН стартового раствора в первых порциях эффлюента. Непротонированный Трис при пропускании стартового раствора связывается с сорбентом за счет неспецифичных взаимодействий, а затем, элюируется при пропускании элюента, в котором содержание Трис меньше, чем в СР (рис, 15, кривая 1). Исчезновение подъема на начальном участке при увеличении ионной силы стартового раствора будет объясняться ослаблением дисперсионных взаимодействий и невозможностью связывания Трис при уравновешивании колонки (рис. 15, кривая 3). В случае рис. 16 (кривая 4), т.е. когда ионная сила элюента высока, и концентрация сильного электролита (NaCI) на 1-2 порядка выше, чем концентрация слабой кислоты в элюенте, играют роль несколько процессов. Это и дополнительное протонирование сорбента, и смывание Трис с колонки за счет ослабления дисперсионных взаимодействий (схема 4). Далее Ивановым с сотр. [116] было продемонстрировано совместное влияние ионной силы и слабого основания в подвижных фазах на начальный участок градиента рН. На рис. 17 (кривые 1-3} представлены градиенты рН, полученные при различной ионной силе элюента, создаваемой NaCI. При /э -0,5 на профиле градиента рН наблюдается два участка с увеличением рН (кривая 1). Авторы объясняют это тем, что при пропускании элюента сначала происходит дополнительное протонирование сорбента со связыванием оксалат- и хлорид-ионов, за счет увеличения условных констант протонирования аминогрупп сорбента и повышения концентрации протонов в подвижной фазе. В результате, как и в вышеописанном случае (схема 4), соотношение концентраций щавелевой кислоты и Трис в подвижной фазе смещается в сторону основания (Трис), что приводит к повышению рН эффлюента (первый подъем рН на профиле градиента), Затем, из-за очень высокой концентрации СГ, начинается анионный обмен, с вытеснением оксалат-ионов в подвижную фазу. Таким образом, из колонки элюируются ионы С2042"г НС204 или ионные пары RNH3+C204 , что также приводит к повышению рН (второй подъем на профиле градиента). При равенстве ионной силы СР и элюента (0,01) подъемы на начальном участке градиента не наблюдаются (рис. 17, кривая 3). Это объясняется тем, что оксалат-иона в элюенте в 2 раза больше, чем СГ, поэтому процессы анионного обмена незначительны. Константы протонирования групп сорбента в этом случае не изменяются, в результате происходит постепенное оттитровывание аминогрупп щавелевой кислотой, а резкого повышения концентрации Трис в эффлюенте не возникает.
При использовании иодида калия вместо хлорида натрия для создания ионной силы в элюенте при сохранении условий градиента 1 (рис. 17 кривая 4), подъемы на начальном участке проявляются в меньшей степени. Иодид-ион проявляет большее сродство к аминогруппам сорбента, чем СГ[85], поэтому при анионном обмене во время пропускания элюента через колонку, иодид-ион составляет большую конкуренцию оксалат-иону, нежели хлорид-ион. Таким образом, влияние ионной силы на профиль градиента рН носит сложный характер, В анионообменной системе правильный выбор ионной силы стартового раствора и элюента (/ср /э) позволяет получать практически линейные градиенты в диапазоне до 2 ед. рН при использовании элюента простейшего состава. В результате проведенных исследований авторы [102, 112] рекомендуют для формирования квази-линейных градиентов рН внутри слабоосновных ионообменных колонок использовать: полифункциональные сорбенты; элюенты с минимальным содержанием слабоосновных компонентов; элюенты с ионной силой ниже, чем у стартового раствора; Под квази-линейными принято понимать градиенты, имеющие на профиле два или более линейных участка с разным углом наклона, но при этом должны отсутствовать явно выраженные ступени (участки с минимальным изменением рН) [95]. В целом, для создания протяженного градиента ионную силу элюента следует понижать, а для более резкого градиента - повышать. Стоит особо подчеркнуть, что в катионообменных системах подобные исследования не проводились. Кроме техники классического хроматофокусирования для формирования внутренних градиентов рН, существует техника индуцирования [27]. Рассмотрим, например, формирование нисходящего градиента рН (схема 5). В этом случае через колонку постоянно пропускают элюент при низком значении рН (3-4), затем вводят небольшой объем ( 1 мл) концентрированного индуцирующего раствора при более высоком рН (выше 9). При этом система быстро переуравновешивается, и на выходе из колонки наблюдается резкое изменение рН. Далее происходит постепенное возвращение к исходному рН элюента и, тем самым, формирование нисходящего градиента рН.
Сорбенты, реагенты, растворы.
Сорбенты и хроматографические колонки. В работе использовали следующие катионообменные карбоксильные сорбенты (табл. 5). Хроматографические колонки для ВЭЖХ заполняли суспензионным способом из смеси изопропанол-вода с предварительной обработкой на ультразвуковой бане. Стеклянную колонку 300x9 мм заполняли суспензионным способом из воды, с предварительной ультразвуковой обработкой сорбента и удалением микрочастиц декантацией. Подвижные фазы и растворы. В качестве подвижных фаз для формирования градиентов рН с помощью «классической» техники хроматофокусирования использовали следующие растворы переменных концентраций: Трис (трис(гидроксиметил)аминометан), приготовленный из сухого препарата квалификации ч.д.а. фирмы "Serva" (Германия); фосфатный буферный раствор (рН -7,5); растворы уксусной кислоты из препарата фирмы J.T.Baker (США), щавелевой, винной, лимонной, глутаминовой и аминогексановой кислот, NaH2P04, приготовленные из препаратов ("Реахим", Россия; "Merck", Германия) квалификации "ч.д.а."; Полибуфер-74 и Полибуфер-96 (Polybuffer), приготовленные разбавлением препарата фирмы "Pharmacia" (Швеция). Кислотность растворов создавали добавлением конц, НС!, ионную силу -добавлением рассчитанного количества 2 М раствора NaCI. В некоторых случаях в подвижные фазы добавляли CH3CN (5-10 об.%) («Криохром», Россия). При использовании техники индуцирования в качестве основного компонента в элюенте применяли растворы переменной концентрации лимонной и уксусной кислот, приготовленные из препаратов квалификации "ч.д.а." и "для ВЭЖХ", соответственно. Также применяли 1-2 мМ растворы 6-аминогексановой кислоты квалификации "ч.д.а." наряду с основным компонентом элюента. В отдельных случаях использовали растворы Трис различной концентрации, приготовленные так же, как и для "классического" варианта. Для создания необходимого значения рН в раствор Трис добавляли рассчитанное по программе "Acid-Base Calculator" [127] количество конц. НС1 или лимонной кислот квалификации "ч.д.а.". Для создания необходимого рН в кислотных элюентах использовали 0,1 М раствор Трис. В отдельных экспериментах в состав элюента вводили 2 мМ растворы оснований гексамина, имидазола и гистидина, приготовленные по навескам препаратов "ч.д.а," фирм "Merck" и "Reanal". Ионную силу создавали добавлением 0,1 М сильных электролитов - хлоридов и нитратов лития, калия, натрия и цезия, а также перхлората натрия квалификации "ч.д.а.".
В качестве индуцирующих растворов применяли растворы Трис, аммиака и ацетата натрия переменной концентрации, приготовленные из препаратов фирмы Germed (ГДР) или Merck (Германия). Кислотность варьировали добавлением 1 М гидроксида натрия и 0,1 М раствора Трис в индуцирующий раствор. Ионную силу создавали при помощи 0,1-1 М раствора хлорида натрия, Модельные смеси металлов готовили из растворов соответствующих хлоридов, сульфатов или нитратов препаратов квалификации "ч.д.а.". При изучении градиентов ионной силы готовили растворы КЫОз из сухих навесок препарата квалификации "ч.д.а." ("Merck", Германия). Растворы солей меди(II), цинка(И), кадмия(М), кобальта(Н), никеля(П), марганца(И) и свинца(Н) готовили растворением точных навесок соответствующих хлоридов и нитратов квалификации "ч.д.а." в бидистилляте, подкисленном НС]. 4-(2 Пиридилазо)резорцин (ПАР) (0.025%-ный) готовили из препарата квалификации "ч.д.а." (Reanal, Венгрия) растворением точной навески в 0,05 М боратном буферном растворе (рН 9,18). Ацетатный 0,2 М буферный раствор готовили смешиванием соответствующих объемов растворов СН3СООН и CH3COONa квалификации "ч.д.а.", а затем доводили до требуемого значения рН (от 2 до 8) добавлением конц. HCI или 0,1 М NaOH. В отдельных случаях (например, при изучении сорбции ІМі2+) в растворе создавали рН ниже 2. Боратный 0,05 М буферный раствор готовили из фиксанала МагВ ЮНгО фирмы Germed (ГДР). 4.3. Методики экспериментов. Формирование внутренних градиентов рН. Хром ато графическую колонку уравновешивали стартовым буферным раствором до значения рН, соответствующего начальной точке градиента, затем пропускали элюент со значением рН, соответствующим конечной точке градиента. Кислотность эффлюента контролировали в проточной микроячейке и регистрировали сигнал цифрового рН-метра с помощью самописца или в некоторых случаях через АЦП с помощью компьютера и программы "Экохром" (ИОХ, Россия). При разделении модельных смесей в начальной точке градиента в колонку вводили 20-50 мкл смеси и регистрировали сигналы рН-метра и УФ-детектора с помощью двухканального самописца. В ряде экспериментов при использовании УФ-детектора "MicroUvis 20" ("Carlo Erba Instruments", США) сигнал регистрировали через АЦП на компьютере с программой «Мультихром» (Ampersand, Россия). Индуцированный нисходящий градиент создавали, постоянно пропуская через колонку заполненную сорбентом Масго-Ргер 50 СМ, буферный элюент с низким значением рН (3,5-4,5). После уравновешивания в поток элюента периодически вводили до 1-2 мл концентрированного индуцирующего раствора при высоком значении рН (выше 8). Кислотность эффлюента контролировали в проточной микроячейке для измерения рН и регистрировали сигнал цифрового рН-метра с помощью самописца. При разделении модельной смеси ионов металлов вводили пробу (50 мкл) при рН эффлюента не выше 8, во избежание образования гидроксидов, и регистрировали сигналы рН-метра и УФ-детектора (при 254 нм) с помощью двухканального самописца. Кислотно-основное потенциометрическое титрование сорбентов.
Навеску сорбента 0,30 г промывали на стеклянном фильтре 20 мл 0.10 М NaOH и затем таким же объемом дистиллированной воды, помещали в стакан емк. 30 мл, добавляли 20 мл дистиллированной воды или раствора NaCI рассчитанной концентрации. Ионную силу варьировали в пределах 0.01 - 1. Сорбент титровали 0.10 М раствором HCI порциями по 5-50 мкл при перемешивании магнитной мешалкой в течение 15 мин после добавления очередной порции титранта. Стакан сверху закрывали парафиновой пленкой, чтобы избежать насыщения титруемого сорбента углекислым газом. Контролировали рН на рН-метре; для создания ионной силы добавляли рассчитанные количества З М раствора NaCI. Изучение сорбции ионов металлов. При изучении сорбции ионов металлов на карбоксильных сорбентах в статическом режиме вносили в пластиковые сосуды емк. 15 мл 0,20 г сорбента, 5,0 мл ацетатного буферного раствора при определенном рН, 0,20 мл 20 мМ раствора соли металла и разбавляли бидистиллятом до 10,0 мл. Раствор встряхивали около 5 мин, а после удерживали сорбент и раствор в контакте еще около 5 - 7 мин и отбирали аликвотную часть (0,1 - 0,5 мл). Для контроля равновесной концентрации иона металла в аликвоте после сорбции использовали стандартную методику фотометрического определения по реакции с ПАР [122]. Для этого в колбы емк. 10 мл вносили 2,5 мл боратного буферного раствора, 2,5 мл 0,025%-ого раствора ПАР, добавляли аликвоту, доводили до метки и измеряли оптическую плотность раствора на КФК-2 при 540 нм относительно контрольного опыта. Содержание ионов металлов (мкг/25 мл) определяли по уравнениям градуировочных графиков [122]. Для Мп2+ и Катионообменные сорбенты на основе кремнеземов и органических полимерных матриц с привитыми карбоксильными группами все шире применяют для концентрирования и разделения ионов металлов [56, 109-112]. Интерес к карбоксильным катионообменникам вызван сочетанием ионообменных свойств по отношению к щелочным и щелочноземельным металлам и возможного комплексообразования с переходными металлами. Ко мплексо образующие свойства привитых карбоксильных групп существенно зависят от кислотности контактирующего раствора, таким образом, варьируя рН среды, можно добиваться более высокой селективности сорбентов, или, наоборот, создавать условия для неселективной групповой сорбции.
Влияние ионной силы элюента
Как отмечалось выше, в случае, если ионная сила стартового раствора выше, чем элюента, то на начальном участке градиента рН наблюдали подъем выше значения рН стартового раствора. От этого эффекта можно избавиться повышением ионной силы элюента. Так, при относительно высокой ионной силе в элюенте и стартовом растворе удается получить достаточно плавный градиент рН без подъема на начальном участке, зато с более протяженным квазилинейным участком (рис. 33, кривая 3; таблица 13). Вероятно, при увеличении ионной силы в подвижных фазах карбоксильные группы катионообменника частично депротонируются, в результате чего не происходит повышения рН в первых порциях эффлюента. Видимо, также увеличивается буферная емкость сорбента за счет изменения соотношения незаряженных групп к заряженным. Как мы уже отмечали ранее [102, 111], с помощью изменения ионной силы подвижной фазы можно влиять на профиль градиента рН. Для дальнейшей экспериментальной проверки наших предположений получили градиенты рН внутри колонки, заполненной сорбентом МасгоРгер 50 СМ, имеющим достаточно высокую ионообменную емкость (табл. 5). В качестве элюентов для формирования градиента рН также выбрали растворы лимонной кислоты. При этом потребовалось перейти к более концентрированным элюентам - 0.05 и 1 мМ, а концентрация стартового раствора осталась прежней. В стартовом растворе и в элюенте создавали равную ионную силу с помощью NaCI (табл. 14). В обоих случаях получили достаточно линейное снижение рН, более плавное для 0.5 мМ раствора кислоты при ионной силе 0.1 (рис. 34). Градиенты, подобные приведенному на рисунке 34 (кривая 1), принято относить к квазилинейным [95]. На профиле градиента, полученного при использовании 1 мМ лимонной кислоты (/ = 0.01), наблюдали незначительный подъем рН - на 0.03 ед. (рис. 34, кривая 1; табл. 14). Тем не менее, такой градиент тоже подходит для разделения веществ методом хроматофокусирования. При сохранении концентрации лимонной кислоты в элюенте (1 мМ) профиль градиента можно В препаративном варианте хроматографии на катионообменной колонке Масгоргер 50 СМ показали возможность разделения катионов переходных металлов в условиях нисходящего градиента рН (рис, 36), полученного с использованием однокомпонентного элюента. Для ионов металлов получили симметричные пики, примерно одинаковой ширины независимо от времени выхода, что свидетельствует о наличии фокусирующего эффекта. Марганец выходит при рН выше 6, цинк 5.5, а кобальт ниже 5. Это указывает на сродство данных металлов и сорбента - марганец и цинк образуют менее прочные комплексы, чем кобальт.
Порядок выхода переходных металлов часто зависит от конкретного используемого сорбента, т.к. при разделении, как правило, имеет место смешанный механизм взаимодействия ионов металлов с функциональными группами и в некоторых случаях матрицей сорбента. В нашем случае порядок выхода металлов совпадает с приведенным для сульфо-катионообменной колонки Hamilton PRP-X800 [140]. Этот результат, вероятно, близок с нашим из-за использования авторами градиентного элюирования (система; ЮмМ ацетат аммония (рН = 3.4) - трифторуксусная кислота (рН = 1.5)). В других работах порядок элюирования изменялся, вплоть до обращения ряда [141]. Наши исследования катионообменных карбоксильных сорбентов (Ольвагель-СООН) в статических условиях указывают на то, что Со2+ должен десорбироваться позже остальных, а Мп2+ и Zn2+ примерно в одно время (таблица 15). Для сорбента СМ-52 значения рН 50%-й сорбции свидетельствуют о схожей селективности данного сорбента и Масгоргер 50 СМ. С другой стороны, данные по константам устойчивости комплексов рассматриваемых металлов с карбоновыми кислотами (уксусная, щавелевая) показывают, что наименее прочные комплексы Чтобы проверить существование солевого градиента (градиента ионной силы) при формировании градиента рН, в потоке измеряли концентрацию компонентов сильного электролита на выходе из колонки в процессе формирования градиента рН при одинаковых стартовом растворе и элюенте, но с разной ионной силой. В качестве регистрируемого выбрали нитрат-ион, т.к. ион-селективный электрод на данный ион оказался наиболее доступным и имеющим линейную электродную функцию в достаточно широком диапазоне концентраций. В качестве электрода сравнения использовался хлорид-серебряный электрод, поэтому из-за влияния на его сигнал хлорид-ионы не могли служить показателем изменения ионной силы на выходе из колонки. Так, на рисунке 37 приведен градуировочный график для ион-селективного электрода на NCV. В качестве модельной системы для формирования нисходящих градиентов рН внутри катионообменной колонки выбрали стартовый раствор на основе слабого основания Трис и полибуферный элюент. Получили градиенты рН со стартовым раствором 10 мМ Трис-HCl (рН=7.5) и элюентом 1:20 "Полибуфер 96" (рН-3.0) для двух случаев изменения ионной силы при переходе от стартового раствора к элюенту. /ср везде обозначает ионную силу стартового раствора, созданную добавлением KN03, и /э- элюента, соответственно.
Для первой системы (рис. 38), когда 1ср=0.1, а 1Э=0, получена кривая изменения потенциала для ионов N03" (рис. 38, кривая 1). Приведенный на рисунке 38 градиент (кривая 2) имеет характерный участок с подъемом рН выше рН стартового раствора. Этот эффект был подробно разобран нами в предыдущих главах. На данном этапе работы основное внимание уделялось тому, как изменяется концентрация сильного электролита на выходе из колонки, и как градиент ионной силы соотносится с градиентом рН. Как видно из рисунка 38, градиент ионной силы имеет достаточно плавную форму, без ступеней и перегибов. Основное уменьшение концентрации нитрат-иона происходит как раз во время слабого изменения рН в эффлюенте - при выходе «аномального» участка с подъемом рН выше стартового раствора. Данное поведение градиента ионной силы подтверждает то, что природа «аномального» участка обусловлена изменением ионной силы подвижных фаз, как и было предложено нами ранее на основе теоретического рассмотрения системы. На его профиле не наблюдали аномальных подъемов или ступеней. Поскольку этот градиент был получен при равной ионной силе, то для иона N03" потенциал на протяжении всего градиента не изменялся - оставался на значении Е=0.226 В, что и соответствует концентрации нитрат-иона, равной 0.1 М. Таким образом, экспериментально подтверждено, что при ионной силе стартового раствора большей, чем в элюенте, наблюдается плавный, достаточно протяженный градиент ионной силы (концентрации нитрат-иона) симбатно градиенту рН. Также подтверждено, что причиной «аномального» подъема на начальном участке градиента рН является изменение ионной силы в подвижной фазе (рис. 38). Некоторые другие эффекты, проявляющиеся на профиле градиента рН, например, ступени, изменение угла наклона градиента, могут быть связаны с резким увеличением концентрации сильного электролита в подвижной фазе (рис. 39). Кроме техники классического хроматофокусирования, для формирования внутренних градиентов рН, существует техника индуцирования [43, 64, 117]. В этом случае через колонку постоянно пропускают элюент при низком значении рН (3-4), затем вводят небольшой объем ( 1 мл) концентрированного индуцирующего раствора при более высоком рН (выше 9). При этом система быстро переуравновешивается, и на выходе из колонки наблюдается резкое изменение рН. Далее происходит постепенное возвращение к исходному рН элюента и, тем самым, формирование нисходящего градиента рН (схема 10). Основным преимуществом техники индуцирования является отсутствие необходимости заново переуравновешивать колонку до начального значения рН градиента, что в 3-5 раз сокращает время анализа по сравнению с техникой классического хроматофокусирования.
