Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Хроматофокусирование 13
1.1. Принципы, на которых основано разделение амфолитрв 14
1.2. Применяемые ионообменные сорбенты 15
1.2.1. Протолитические и ионообменные свойства сорбентов, применяемых в хроматофокусировании 18
1:2.1.1. Константа протонирования функциональных групп сорбента 18
1.2.1.2. Коэффициенты анионного обмена С Г на A" /<(CI,A) 19
1.2.1.3. Коэффициенты катионного обмена K(H,Na) 21
1.3. Элюенты, используемые в хроматофокусировании 22
1.4. Стартовые (уравновешивающие) растворы. 28
1.5. Модели формирования градиента рН в хроматофокусировании.:...29
1.5.1. Модель Слайтермана - Элгерсмы... 30
1.5.2. Модель Мурела и сотрудников ...32
1.5.3. Модель Фрея, Барнеса и Стронга ,.35
1.5.3.1. Модель локальных равновесий 36
1.5.3:2. Численное изучение формирования внутреннего градиента рН 40
1.5.3.3. Расчет по модели локальных равновесий и точный численный расчет с учетом массопереноса в системе ,.42
Глава 2. Математическое моделирование ионообменных равновесий . 45
2.1. Ионный обмен как химическая реакция .45
2.2. Ионный обмен с позиции теории растворов электролитов ... 47
2.3. Учет осмотического давления 47
2.4. Применяемые математические методы .47
Методы .оптимизации.. , 48
Глава 3. Аппаратура, реагенты, методика эксперимента, расчеты . 51
3.1. Аппаратура 51
3.2. Сорбенты, реагенты, растворы . 53
3.3. Методики эксперимента 54
Глава 4. Модельные внутренние градиенты рН 57
4.1. Выбор и описание модели 57
4:1.1. Ионообменные гетерогенные равновесия., --.58
4.1.2. Физико-химическая модель ,.61
4.1.3. Математическая модель 62
4.1.4. Параметры модели 64
4.2. Влияние параметров модели на форму выходных кривых... 65
4.2.1. Состав элюента... 66
4.2.1.1. Состав активных компонентов. Одноком'понентные системы: одноосновные кислоты 66
4.2.1.2. Многокомпонентные системы: одноосновные кислоты ...70
4.2.1.3. Однокомпонентные системы: многоосновныё кислоты 72
4.2.1.4. Инертнью компоненты 74
4.2.2. Параметры колонки , 77
4:2.3. Сорбент 78
4.3. Соответствие рассчитанных профилей внутренних градиентов рН литературным данным 82
4.4. Сравнение с моделями Слайтермана-Элгерсмы, Мурела и сотр., Фрея и сотр. и пути проверки модели 83
4.5. Экспериментально определенные значения параметров модели .86
4.5.1. Константа протонирования аминогрупп сорбента 86
4.5.2. Коэффициенты анионного обмена хлорид-иона-на анион слабой кислоты/C(CI,A) на кремнеземах с.привитыми олигоэтилена.минами 95
4.5.3. Коэффициенты катионноґо обмена протона на натрий K(H,Na) на дикарбоновых кислотах, сорбированных на кремнеземах с привитыми олигоэтиленаминами .97
Глава 5. Экспериментальные внутренние градиенты рН 99
5.1. Влияние состава элюента на профиль градиента рН ...100
5.1.1. Однокомпонентные системы: одноосновные кислоты 100
5.1.2. Однокомпонентные системы: двухосновные кислоты 101
5.1.3. Проверка влияния ионной силы 105
5.1.4. Влияние слабого основания.. 108
5.2. Природа аномального участка :110
5.3. Рекомендации по.формированию квази-линейных внутренних градиентов рН 121
5.4. Примеры разделения аминокислот и белков на квази-линеином градиенте, полученном по нашему способу .122
5.4.1. Модельная смесь аминокислот ...122
5.4.2. Разделение Изоформ плазминогена 123
5.5. Сравнение экспериментальных и модельных градиентов рН .125
Глава 6. Программное обеспечение 128
6.1. Программа расчета выходных кривых рН 128
6.2. База данных по внутренним градиентам рН . 133
6.2.1. Причины создания специализированной базы данных по внутренним градиентам рН... ..133
6:2.2. Структура базы данных... 136
6.2.3. Диалоговые окна. 136
6.3. Программа Acid-Base Calculator 142
6.3.1. Причины создания программы Acid-Base Calculator.. 142
6.3.2. Физико-химические положения, используемые в программе 144
6.4. Программа Альфа для расчета степени протонирования слабоосновных групп сорбента .147
Выводы 150
Список литературы 151
- Применяемые ионообменные сорбенты
- Ионный обмен с позиции теории растворов электролитов
- Сорбенты, реагенты, растворы
- Инертнью компоненты
Введение к работе
Актуальность работы. Среди гибридных методов в аналитической химии в последние годы широкое распространение получили ионообменная, комплексообразовательная и другие варианты жидкостной хроматографии. Развитие и совершенствование этих методов связано с расширяющимся кругом определяемых компонентов, анализируемых объектов, возможностью сочетания хроматографии с другими методами анализа. В 1979 г. Слайтерманом был создан новый метод препаративного разделения и определения белков на ионообменных колонках, основанный на элюировании с внутриколоночным (внутренним) градиентом рН, - хроматофокусирование. Выбор компонентов хроматографическои системы - сорбента, стартового раствора и элюента - в методе хроматофокусирования в большинстве случаев основан на эмпирическом подходе, а существующие модели формирования внутреннего градиента рН дают лишь крайне упрощенное представление о системе. Многие характерные участки градиента рН невозможно объяснить с помощью существующих моделей. В то же время стоимость химических реактивов, используемых для получения внутренних градиентов рН, достаточно высока. Особенно это относится к буферным элюентам, составленным из синтетических полиамфолитов, свойства которых могут быть плохо воспроизводимы. Кроме того, подобные элюенты под действием бактерий быстро разрушаются. В целом это приводит к высокой стоимости метода хроматофокусирования при его рутинном использовании. В связи с этим актуально изучение процессов формирования внутренних градиентов рН и создание физико-химической и математической модели, описывающей все особенности градиента. На основании полученных закономерностей, связывающих форму внутреннего градиента рН с параметрами хроматографическои системы, можно будет подбирать элюенты, составленные из небольшого числа дешевых реагентов простого состава. Кроме того, необходимо создать программу или пакет программ, позволяющих до начала эксперимента подобрать его условия, что сэкономит время, химические реактивы и снизит стоимость анализа в целом, а также поможет исследователю подобрать градиент требуемой формы.
Цель работы:
разработка методов расчета профилей внутренних градиентов рН;
поиск закономерностей, связывающих форму градиента рН с параметрами системы;
поиск дешевых элюентов, составленных из небольшого числа простых протолитов, для получения рабочих градиентов рН требуемой формы;
создание информационной базы данных по внутренним градиентам рН.
Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач
-
Анализ литературных данных по формированию внутренних градиентов рН хроматофокусировании (теоретические принципы, модельные представления практическое применение);
-
Разработка физико-химической и математической модели формировані внутреннего градиента рН, учитывающей гомогенные и гетерогенні химические равновесия, протекающие в системе, и описывающей в основные особенности профиля градиента рН;
-
Анализ модели, т.е. выявление закономерностей, связывающих форі градиента с параметрами модели;
-
Получение экспериментальных значений отдельных параметров модел (констант протонирования аминогрупп для сорбентов Еп-БІОг, Оіеп-БіОг Tetren-Si02' коэффициентов ионного обмена хлорида на анионы слабы кислот и коэффициентов обмена протона на натрий на сорбированны дикарбоновых кислотах);
-
Проверка адекватности модели литературным и собственнь экспериментальным данным;
-
Разработка аппаратурного оформления для получения экспериментальнь внутренних градиентов рН;
-
Поиск дешевых элюентов, составленных из небольшого числа прость протолитов;
-
Разработка пакета программ, позволяющих до начала эксперимента подобра-его условия (сорбент, стартовый раствор, элюент, требуемая форма градиент рН), для экономии времени и стоимости химического анализа.
Научная новизна. Найдены основные закономерности формировав внутриколоночных градиентов рН в хроматофокусировании и требования сорбентам и составу подвижных фаз стартового раствора и элюента.
Впервые для получения квази-линейных внутренних градиентов р применены системы, включающие кремнеземы с привитыми олигоэтиленаминами одно- двухкомпонентные элюенты на основе слабых низкомолекулярных кисло Определены константы протонирования аминогрупп этих сорбентов, а так» коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы органических кислот коэффициенты катионного обмена протона на натрий на сорбированнь дикарбоновых кислотах.
Изучено влияние природы и состава стартового раствора и элюент: составленного из простых протолитов, на форму градиента рН. Впервые показан влияние ионной силы на форму градиента рН.
Разработана физико-химическая и математическая модель формировани внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смес протолитов в качестве элюента, учитывающая ионообменные равновесия
гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитные и полифункциональные свойства сорбента. Модель описывает все известные из экспериментальных данных характерные участки на профиле градиента рН.
Профили градиентов рН, рассчитанных на основе модели, хорошо согласуются с полученными экспериментально в аналогичных условиях. Модель впервые позволила объяснить образование так называемых "аномальных" участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора), что в принципе невозможно было объяснить с помощью моделей, учитывающих только буферные свойства системы, и лишь частично - с помощью модели локальных равновесий Фрея*.
Практическая значимость работы. Даны практические рекомендации по созданию дешевых элюентов простого состава и способы управления формой градиента рН за счет изменения ионной силы подвижных фаз. Показана возможность применения однокомпонентных элюентов для хроматофокусирования на примере разделения изоформ плазминогена и модельной смеси аминокислот. Создан пакет программ для операционной системы Windows 9x/NT - Acid Base Calculator, Cfocusing, Alpha и база данных "pH-gradients". Эти программы позволяют до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент, состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых вещестз форму градиента рН).
Положения, выносимые на защиту:
-
Физико-химическая и математическая модель формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси протолитов в качестве элюента, учитывающая кислотно-основные и ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитную и полифункциональную природу сорбента.
-
Результаты моделирования внутренних градиентов рН и их сравнение с экспериментальными данными.
-
Найденные закономерности, связывающие форму градиента с параметрами хроматографической системы.
-
Способы получения квази-линейных градиентов рН с использованием одно-двух компонентных элюентов на основе простых протолитов и использование таких градиентов рН для разделения белков и аминокислот.
-
Программное обеспечение - информационная база данных по модельным и экспериментальным внутренним градиентам рН с интегрированными с ней программами расчета внутренних рН-градиентов, рН и ионной силы смесей кислот и оснований в водных растворах, степени протонирования сорбента.
'Frey D.D.. Barnes A.. Slrong-J. ffAIChE Journal 1995. V.41 N 5. P 1171-1183
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VI Всероссийской конференции "Физико-химические основы и практически применение ионообменных процессов" (Воронеж, 1996 г.); Международно конгрессе по аналитической химии (ICAC-97) (Москва, 1997 г.); Международно конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносое 98" (Москва, МГУ, 1998 г.); Всероссийском симпозиуме по теории и практик хроматографии и электрофореза (Москва, 1998 г.); Всеукраинской конференции п аналитической химии (Ужгород, 1998 г.); 2-й Всероссийской конференции п истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) (Москва, 1999 г. Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографи (SCAC99) (Москва, 1999 г.); VII Всероссийской конференции "Органически реагенты в аналитической химии" (Саратов, 1999 г.); Всероссийской конференції "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 1 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух гла обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов и списк литературы. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, включає 70 рисунков и 14 таблиц. Список литературы содержит 110 работ зарубежных отечественных авторов.
Применяемые ионообменные сорбенты
В качестве ионообменников в хроматофокусировании используют моно- и полифункциональные сорбенты на основе полисахаридов, полиакриламидов и кремнеземов. На поверхности матрицы обычно закреплены олигоэтиленамины, например, триэтилентетрамин (ТЭТА или триен), тетраэтиленпентамин (ТЭПА или тетрен), пентаэтиленгексамин (ПЭГА или пентен); диэтиламиноэтил (ДЭАЭ) или полиэтиленимины (ПЭИ); реже - соединения, содержащие карбоксильные функциональные группы [4, 16-19]. Поэтому по типу функциональных групп сорбенты можно классифицировать следующим образом: а) монофункциональные анионообменники; б) полифункциональные анионообменники; в) монофункциональные катионообменники. По типу матрицы сорбенты для хроматофокусирования можно классифицировать следующим образом: а) на основе полисахаридной матрицы; б) на основе полиакриламидной матрицы; в) на основе кремнеземов. Характеристики некоторых сорбентов, относящихся к соответствующим классам, приведены в табл. 1 [2, 4, 8, 15, 17, 20-27]. В качестве матрицы для сорбентов применяют сефадекс, представляющий собой полисахаридные цепи, сшитые между собой для получения более жесткой пространственной структуры [17, 27]с размером частиц 40-120 мкм [17, 27, 28]. Известен ряд сорбентов для хроматофокусирования на основе полиакриламидных гелей: DEAE-Bio-gel, CM-Bio-gel, и др. [7, 16, 20, 27, 29, 30]. Подобные сорбенты чаще применяют в препаративном, чем в аналитическом варианте хроматофокусирования в системах с высоким рабочим давлением [5-7, 31-33]. В последние годы применение в хроматофокусировании сорбентов на основе полиакриламида увеличилось.
Так, показано, что DEAE-Bio-gel с размером частиц 10-20 мкм можно успешно использовать в микроколоночном варианте хроматофокусирования белков и аминокислот [28, 34]. Для получения линейных градиентов в широком диапазоне рН (3-5 ед.) предпочтительней использовать полифункциональные сорбенты, хотя для многих практических задач, связанных с разделением и выделением белков, вполне достаточно монофункциональных сорбентов. Для хроматофокусирования переходных металлов одной линейности градиента в широком диапазоне рН, а соответственно, и связанной с ней полифункциональности сорбента, недостаточно, так как большое значение для разделения имеют процессы комплексообразования ионов металлов с функциональными группами сорбента и с компонентами элюента. В целом требования, предъявляемые к сорбентам в хроматофокусировании, совпадают с требованиями к сорбентам в ионообменной хроматографии: сорбенты должны быть устойчивы в широком диапазоне рН от 1 - 2 до 10 - 11, иметь низкое сопротивление массообмену, а также быть устойчивыми к воздействию микроорганизмов [18, 19, 35]. Поэтому при работе в варианте ВЭЖХ предпочтительнее использовать сорбенты на основе кремнеземной матрицы, обладающей высокой прочностью и выдерживающей давления до 60 МПа. Единственным ограничением таких сорбентов является диапазон рН от 2 до 8 [18, 19]. Сорбенты на основе органополимерных матриц устойчивы в широком диапазоне рН от 1 - 2 до 10 - 11, но они набухают в воде, подвергаются воздействию микроорганизмов, их частицы обладают большей деформируемостью при высоких давлениях, что ограничивает применение таких сорбентов в системах с высоким рабочим давлением [4, 35, 36]. Концентрация функциональных групп для сорбентов в ХФ составляет 1.0-10 ммоль/г для химически модифицированных кремнеземов и 3-50 ммоль/г для модифицированных сополимерных сорбентов [37]. Эта величина называется максимальной удельной обменной емкостью (Q). Реальная обменная емкость является переменной величиной, что связанно с полиэлектролитными свойствами подобных сорбентов, например, для анионообменника с аминофункциональными группами она соответствует концентрации протонированных аминогрупп и зависит от условий процесса [38].
Характеристикой эффективности колонки применительно к процессам хроматофокусирования служит величина, называемая числом зон фокусирования. По смыслу понятие зоны фокусирования аналогично понятию теоретической тарелки. Однако в силу специфики процессов градиентного элюирования, как правило, число зон фокусирования меньше, чем число теоретических тарелок для той же колонки (обычно в 4-5 раз). Приводимые в литературе числа зон фокусирования, полученные в реальных экспериментах, составляли от 200 до 400 [4, 10, 21]. Форма внутреннего градиента рН существенно зависит от физико-химических свойств сорбента, основными из которых константа протонирования слабоосновных функциональных групп (в случае анионообменников) или константа диссоциации слабокислотных функциональных групп (в случае катионообменника) и коэффициенты ионного обмена. Протолитические свойства сорбентов обычно исследуют методом потенциометрического титрования при постоянном значении ионной силы раствора (/) [38]. Рассмотрим слабоосновный содержащий аминогруппы анионообменник типа RNH2, где R - это матрица сорбента. Запишем для него кислотно-основное равновесие в виде:
Ионный обмен с позиции теории растворов электролитов
Следует отметить, что процесс сверэквивалентного ионного обмена для определенного электролита сильно зависит от его природы и концентрации, а также от природы и концентрации ионообменника. По данным Гельфериха [64], сверхэквивалентная сорбция сильных электролитов, в отличие от неэлектролитов и слабых электролитов, практически не происходит. Этому способствует малая концентрация раствора, высокая емкость и большая степень поперечной связанности ионообменника, а также большой молярный объем электролита. Сильное сродство иона электролита к ионообменнику благоприятствует его сверхэквивалентной сорбции. В случае анионообменника сверхэквивалентная сорбция, например, будет более выражена для электролита, состоящего из однозарядного катиона и двухзарядного аниона, менее для дву-двухзарядного и меньше всего для одно-однозарядного электролита [64]. С позиции теории растворов электролитов процесс ионного обмена состоит в перераспределении противоионов А и В, коиона X и растворителя S между двумя фазами, только одна из которых содержит ион R. Все равновесия рассматриваются как мембранные (доннановские). Выражение для константы ионного обмена, полученное при таком подходе, аналогично приведенному выше (33), а численное значение константы при этом зависит от способа выбора стандартного состояния для иона R. При надлежащем выборе такого состояния константы равновесии, полученные в рамках обеих теорий, численно равны друг другу [44, 62, 63]. При учете осмотического давления, возникающего за счет набухания обменника в процессе ионного обмена, константы всех равновесии следует рассматривать как переменные, зависящие от осмотического давления п и парциальных мольных объемов частиц, участвующих в равновесии.
Отметим, что при использовании реальных констант (коэффициентов) равновесии такой учет формально возможен путем соответствующей "подгонки" коэффициентов активности, т.е. без изменения математической модели [44, 62, 63]. Система алгебраических уравнений, описывающая кислотно-основые и ионообменные процессы, протекающие в хроматографической системе, является нелинейной и в общем случае не может быть сведена к одному уравнению. Для ее решения необходимо использовать специальные математические методы. Наиболее распространенный способ решения системы нелинейных алгебраических уравнений (40) и нахождению минимума f(x). Для решения последней задачи разработано достаточно много численных методов оптимизации [65, 66]. Все существующие методы оптимизации являются итерационными, т.е. используют некоторое начальное приближение для х-\, ... , хп, которое впоследствии уточняется с помощью того или иного алгоритма. Важнейшими характеристиками итерационных алгоритмов оптимизации являются скорость сходимости и устойчивость к выбору начального приближения. Методы оптимизации принципиально можно разделить на две группы: - методы прямого поиска (использующие только значения функции); - градиентные методы (использующие значения функции и ее производных). Среди последних можно выделить методы, использующие значения только первых производных, и производных высших порядков (обычно ограничиваются вторыми производными). Методы прямого поиска [65, 66] обычно отличаются относительно малой чувствительностью к выбору начального приближения, однако скорость сходимости у них, как правило, гораздо ниже, чем у градиентных методов. Поэтому методы прямого поиска целесообразно использовать для грубой оптимизации, особенно в случаях, когда выбор начального приближения, достаточно близкого к конечному решению, затруднен. Методы прямого поиска эффективны применительно к функциям сложного вида, имеющим много локальных минимумов и т.д. Наибольшее распространение среди методов этой группы нашли метод Хука-Дживса и метод Нелдера-Мида [65, 66]. Метод Хука-Дживса. Это весьма эффективный и оригинальный метод. Поиск состоит в последовательности шагов исследующего поиска вокруг базисной точки, за которой в случае успеха следует поиск по образцу. При поиске по образцу используется информация, полученная в процессе исследования, и минимизация функции завершается в направлении, заданном образцом [65, 66]. Метод Нелдера-Мида. Метод является развитием симплексного метода Спендли, Хекста и Химсворта. Множество (п+1)-й равноудаленной точки в n-мерном пространстве называется регулярным симплексом. Нелдер и Мид предложили метод, допускающий, чтобы симплексы были неправильными.
В результате получился очень надежный и эффективный метод для п 6 [65, 66]. Использование градиентных методов основано на аппроксимации произвольной функции несколькими первыми членами ряда Тейлора в окрестности ее минимума: Вектор Wfxj или д(х) с компонентами {—, ,..., } называется функции, а симметрическая n х n-матрица с элементами условие минимума функции: Vf(xo) = 0 и G(x0) - положительно определена. В противоположность методам прямого поиска, градиентные методы характеризуются более быстрой сходимостью, но и меньшей устойчивостью к выбору начального приближения: если начальное приближение отстоит достаточно далеко от решения, итерационный цикл может расходиться. Особенно это касается методов, использующих производные высших порядков. При использовании градиентных методов наилучшие результаты достигаются применительно к квадратичным функциям: в этих случаях возможно нахождение точного минимума за
Сорбенты, реагенты, растворы
Сорбенты и хроматографические колонки. В работе использовали следующие сорбенты, синтезированные доктором химических наук П.Н.Нестеренко по методикам [26, 73-75] (табл. 8). Хроматографические колонки для ВЭЖХ заполняли суспензионным способом из смеси изопропанол-вода с предварительной обработкой на ультразвуковой бане. Стеклянную колонку 300x9 мм заполняли суспензионным способом из воды, с предварительной ультразвуковой обработкой сорбента и удалением микрочастиц декантацией. Навески сорбентов Dien-Si02 и Tetren-Si02 на основе Силохрома С-120 также использовали в кислотно-основном потенциометрическом титровании и при определении коэффициентов ионного обмена. Подвижные фазы и растворы. В качестве стартовых растворов для уравновешивания хроматографических колонок при формировании градиентов рН использовали растворы переменной концентрации Трис, приготовленные по точным навескам препарата "ч.д.а." фирмы "Merck" (Германия). Для создания требуемого значения рН в стартовый раствор добавляли рассчитанное по программе "Acid-Base Calculator" [76] количество соляной или щавелевой кислоты квалификации "ч.д.а." В качестве элюентов при формировании внутренних градиентов рН использовали растворы Полибуфера-74 (Polybuffer-74) с буферной емкостью 75 мкмоль/ед.рН/мл, приготовленные разбавлением препарата фирмы "Pharmacia" (Швеция), рН 3,5 создавали добавлением HCI; растворы переменной концентрации уксусной и щавелевой кислот. Для создания рН 3-3,5 в ряде случаев в элюент добавляли рассчитанное количество раствора Трис [76]. Ионную силу подвижных фаз создавали добавлением З М раствора NaCI.
При определении коэффициентов катионного и анионного обмена в качестве элюента использовали растворы фталевой или бензойной кислот, рН создавали добавлением 1 М раствора LiOH. Растворы исследуемых кислот - уксусной, муравьиной, щавелевой, малоновой, янтарной, фумаровои, малеиновой и винной - готовили из препаратов квалификации "ч.д.а.". Модельные смеси аминокислот готовили из сухих препаратов квалификации "ч.д.а.". В работе использовали также плазминоген (смесь двух изоформ) и неочищенный овальбумин, полученный разбавлением вытяжки белка куриного яйца. Для кислотно-основного потенциометрического титрования сорбентов применяли 0.100 М HCI и 0.100 NaOH, приготовленные из фиксаналов. Формирование внутренних градиентов рН. Хроматографическую колонку уравновешивали стартовым раствором до значения рН, соответствующего начальной точке градиента (6 - 7.5), затем пропускали элюент со значением рН, соответствующим конечной точке градиента (2.9-3.5). Кислотность эффлюента контролировали в проточной микроячейке и регистрировали сигнал цифрового рН-метра с помощью самописца. При разделении модельных смесей аминокислот в начальной точке градиента в колонку вводили 20 мкл смеси и регистрировали сигналы рН-метра и УФ-детектора (при 280 нм) с помощью двухканального самописца. Кислотно-основное потенциометрическое титрование сорбентов. Навеску сорбента 0.30 г промывали 10 мл 0.025 М NaOH и затем 30 мл дистиллированной воды, помещали в стакан емк. 30 мл, добавляли 20 мл дистиллированной воды и титровали 0.1 М раствором HCI порциями по 0.005 мл при перемешивании магнитной мешалкой в течение 15 мин после добавления очередной порции титранта.
Стакан сверху закрывали парафиновой пленкой, чтобы избежать насыщения титруемого сорбента углекислым газом. Контролировали рН на рН-метре; для создания ионной силы добавляли рассчитанные количества З М раствора NaCI. Определение коэффициентов анионного обмена хлорида на анион органической кислоты К(С1,А). Точную навеску сорбента (0,50 г) промывали на стеклянном фильтре 20 мл смеси 0.1 М HCI и 1 М NaCI. Затем промывали сорбент 20 мл дистиллированной воды и количественно переносили навеску в пластмассовую пробирку емк. 15 мл. Добавляли 10 мл 0.01-0.02 М раствора исследуемой органической кислоты. Встряхивали пробирку в течение 1 мин, отбирали пробу с помощью микрошприца емк. 25 мкл и вводили в хроматограф. Состав эффлюента контролировали кондуктометрически. Измеряли высоты хроматографических пиков и рассчитывали содержание кислоты и хлорида по градуировочным графикам. Определение коэффициентов катионного обмена K(H,Na) на сорбированных дикарбоновых кислотах. Точную навеску сорбента (0,50 г) вносили в пластмассовую пробирку емк. 15 мл: добавляли 10 мл 0,1 М раствора щавелевой, малоновой, янтарной, или малеиновой кислоты; встряхивали в течение 5 мин; сорбент отфильтровывали на стеклянном фильтре и промывали 10 мл деионизованной воды. Объединяли фильтрат и промывные воды, отбирали аликвоту 2-5 мл и разбавляли до 10 мл водой. Из полученного раствора отбирали пробу микрошприцем на 25 мкл и вводили в хроматограф.
Состав эффлюента контролировали кондуктометрически. Измеряли высоты (в случае щавелевой кислоты -площади) хроматографических пиков и рассчитывали содержание кислоты по градуировочному графику. В случае фумаровой кислоты к точной навеске сорбента (0,25 г) добавляли 10 мл 0,05 М раствора кислоты. Оставшийся на стеклянном фильтре сорбент промывали 10 мл 0,020 М раствором NaCI, отбирали микрошприцем пробу фильтрата и вводили в хроматограф. Состав эффлюента контролировали кондуктометрически. Измеряли высоты хроматографических пиков и рассчитывали содержание натрия, хлорида и десорбированной кислоты по градуировочному графику. Для определения констант обмена при 50%-ной запротонированности аминогрупп точную навеску сорбента (0,30 г) вносили в пластмассовую пробирку емк. 15 мл, добавляли рассчитанное по программе "Acid-Base Calculator" [76] количество 0,050 М раствора кислоты, доводили объем до 10 мл (рН 5); встряхивали пробирку в течение 5 мин; сорбент отфильтровывали на стеклянном фильтре. Отбирали аликвоту микрошприцем на 25 мкл и вводили в инжектор хроматографа. Оставшийся на стеклянном фильтре сорбент промывали 10 мл 0,010 М раствором NaCI, отбирали микрошприцем пробу фильтрата и вводили в хроматограф. Состав эффлюента контролировали кондуктометрически. Построение градуировочных графиков. Готовили ряд стандартных растворов дикарбоновых кислот и хлорида натрия с концентрацией 0,001 -0,005 М, отбирали микрошприцем пробу (2-20 мкл) и вводили в хроматограф при кондуктометрическом детектировании. Строили зависимость высоты (или площади) хроматографического пика от содержания компонента в пробе.
Инертнью компоненты
Как описано ранее, при пропускании через колонку со слабоосновным анионообменником (предварительно уравновешенную стартовым раствором) элюента простейшего состава, содержащего только NaCI и один активный компонент в форме одноосновной кислоты НА, на выходной кривой эффлюента наблюдаются два фронта. Вызывает интерес то, что в формировании фронтов при создании внутреннего градиента рН большую роль играют инертные компоненты элюента. На рис. 25, а (для всех выходных кривых объем эффлюента приведен в относительных единицах, соответствующих объему подвижной фазы в колонке) приведен ряд рН-выходных кривых для элюентов, различающихся концентрацией инертного компонента NaCI. Соответствующие концентрационные выходные кривые приведены на рис. 25, 6 - г. На кривых 2,3 рис. 25, а, и, соответственно, на рис. 25,б,г в пределах заданных объемов эффлюента наблюдается только первый фронт. Как видно из рис. 25, для обеспечения максимально плавного градиента рН при выбранных параметрах модели концентрации инертного и активного компонента должны быть соизмеримы: при слишком малых или слишком больших концентрациях NaCI градиент рН приобретает ярко выраженный резкий характер. Тот же эффект проявляется при использовании элюента на основе девятикомпонентной смеси слабых одноосновных кислот (рис. 26). Ряд дополнительных компьютерных экспериментов позволил установить, что этот вывод является весьма общим: при использовании других параметров модели (емкость О, природа и концентрация активного компонента и т.д.) максимально плавный линейный градиент также Из сравнения рис. 25,а и 25,г хорошо видна корреляция между формами градиента рН и ионообменного фронта (фронтов): чем более плавно изменяются концентрации NaCI и НА, тем более плавный и градиент рН.
Интересным способом управления формой градиентов рН может явиться использование элюентов, содержащих смесь нескольких инертных компонентов с различными ионообменными характеристиками. Пример выходной кривой для подобной системы приведен на рис. 27 (кривая 2). Для сравнения на этом же рисунке (кривая 1) приведена выходная кривая для системы, содержащей только один инертный компонент. Как видно из сравнения этих кривых, введение в элюент смеси нескольких инертных компонентов, различающихся константами анионного обмена, позволяет увеличить протяженность суммарного фронта инертных компонентов (и тем самым "задержать" выход активного компонента НА). В качестве параметра, характеризующего хроматографические свойства колонки, мы варьировали число зон фокусирования N. Как было отмечено ранее, использованное нами в компьютерных экспериментах число зон фокусирования N = 50 существенно меньше, чем описанное в литературе для реальных экспериментов ( 400). С целью изучения возможных эффектов, связанных с фронтальным разделением компонентов, приводящих к нежелательному ступенчатому характеру изменения рН выходных кривых, был проведен ряд расчетов для девятикомпонентной системы при значении N = 200 (время расчета одной выходной кривой в этих случаях составило 10-25 ч). Было обнаружено, что для системы: элюент - девятикомпонентная смесь одноосновных кислот, рКа в интервале 3.0 - 7.0, сорбент - анионообменник с \дКр = 8.0 эффекты фронтального разделения при увеличении N от 50 до 200 выражены незначительно, однако рН-градиент становится немного более резким. При расчете внутренних градиентов мы использовали четыре модели анионообменника: монофункциональные 1 - сорбент с величиной \дКр = 8.0, 2 - AP-Si02; lgKp = f(a,Vl); полифункциональные 3 - En-Si02, \дКр = f(a,Vl); 4 - Tetren-Si02, \дКр = f(a,Vl). Результаты моделирования выходных кривых с учетом непостоянства \дКр для элюента, содержащего одну одноосновную кислоту, приведены на рис. 28 (кривые 2, 3). Для сравнения на этом же рисунке (кривая 1) приведена и рН-выходная кривая при постоянном значении \дКр = 8.0, близком к средней величине \дКр как для AP-Si02, так и Tetren-Si02. Как видно из этого рисунка, применение полифункционального анионообменника (кривая 3) позволяет существенно сблизить между собой зоны обоих фронтов выходной кривой и обеспечить их относительно плавный ход (особенно второго фронта), что позволяет считать такие анионообменники весьма перспективными для создания внутренних градиентов рН. В то же время первый фронт оказывается более растянутым и плавным для монофункционального анионообменника (кривая 2). Поэтому для ряда задач хроматофокусирования и такие анионообменные сорбенты тоже могут найти применение.
При сравнении трех моделей анионообменников AP-Si02, En-Si02, Tetren-Si02 с учетом непостоянства величины Кр (рис. 29) видно, что введение дополнительной ионной силы в СР и, соответственно, учет модели сорбента уже на стадии расчета равновесных концентраций при пропускании СР, приводит к изменению формы градиента - растяжению обоих фронтов и получению более плавных градиентов рН. Причем различие в природе и концентрации функциональных групп для монофункционального AP-Si02 и полифункциональных En-Si02 и Tetren-Si02 прослеживается на данном рисунке очень отчетливо. Исходя из градиентов, изображенных на этом рисунке можно рекомендовать для получения протяженных градиентов с помощью малокомпонентных элюентов использовать полифункциональные сорбенты и дополнительную ионную силу в СР. Для градиентов, полученных на полифункциональных сорбентах En-SiC 2 и Tetren-Si02 на начальном участке наблюдается небольшое увеличение рН эффлюента примерно на 0.1 ед. выше рН СР (так называемый "аномальный скачок"). Это связано с тем, что для таких сорбентов величина lgKp при низких значениях степени протонирования (меньше 0.5) имеет достаточно большое значение, что приводит к сорбции хлорид-иона в начальных порциях элюента и выходу из колонки некоторого количества ацетата натрия, что и увеличивает значение рН эффлюента. Образование аномального участка рН (выше рН СР) было воспроизведено на модели сорбента Tetren-SiC 2 при пропускании 9-ти компонентного элюента, который можно рассматривать как аналог полиамфолитного элюента, и при создании в элюенте ионной силы выше, чем ионная сила СР (рис. 30). Более отчетливо различие в моделях анионообменников проявляется на рН-выходных кривых девятикомпонентной смеси одноосновных кислот (рис. 31). Особенно плавный, близкий к линейному, градиент получается при использовании полифункционального анионообменника (рис. 31, кривая 3), хотя в этом случае протяженность градиента рН по оси абсцисс несколько меньше, чем при использовании монофункционального анионообменника (кривая 2). Мы провели также компьютерные эксперименты по изучению влияния на форму рН-выходной кривой величины IgKp, которую варьировали в интервале значений от 4 до 13, при этом в качестве элюента использовали одноосновную кислоту с рКа=5.0, СНА = 2.0-10"3 М, инертный компонент - NaCI, cNaCi = 1.0-Ю"3 М. Установлено, что более плавный градиент рН получается для анионообменника с ІдКр=8-10. В случае сильноосновного анионообменника с 1д/Ср=11-13 происходит резкое падение значения рН первых порций эффлюента, а затем его плавное увеличение до рН элюента. Такое поведение рН-выходной кривой считалось аномальным в рамках модели Слайтермана [1, 10, 15] и модели Мурела [54, 55], на самом деле оно связано с протонированием аминогрупп анионообменника в кислой среде.
