Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 11
2.1 Аффинная хроматография как важнейший метод аналитической и препаративной биосепарации 11
2.2 Современные стационарные фазы для динамических процессов, основанных на аффинных взаимодействиях 12
2.2.1 Традиционные пористые носители (высокопроницаемые частицы) 13
2.2.2 Непористые сорбенты 15
2.2.3 Перфузионные или гигапористые носители 16
2.2.4 Непрерывные разделительные слои (сорбенты монолитного типа)... 19
2.2.5 Тонкие мембраноподобные слои 21
2.3 Макропористые полимерные сорбенты 29
2.3.1 Особенности синтеза 29
2.3.2 Морфология поровой структуры 34
2.3.3 Функционализация поверхности посредством иммобилизации аффинных лигандов 37
2.4 Особенности аффинного комплексообразования в растворе и с участием неподвижной фазы (сорбента) 43
2.4.1 Определение количественных характеристик специфического комплексообразования с использованием подхода аффинной хроматографии 44
2.4.2 Аффинные лиганды: лиганды высокой специфичности и общеспецифические аффинные лиганды 47
2.5 Проточные биореакторы на основе комплементарного связывания 51
2.6 Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными ферментами.54
2.7 Использование макропористых метакрилатных дисков монолитного типа в качестве носителей для твердофазного синтеза пептидов 58
3 Обсуждение результатов 62
3.1 Анализ поровой структуры монолитных сорбентов динамическим методом 62
3.2 Ковалентная иммобилизация биологически активных лигандов на ГМА-ЭДМА дисках 65
3.2.1 Влияние внешних параметров процесса, осуществляемого в статических условиях, на эффективную адсорбционную емкость сорбента 66
3.2.2 Сравнение процессов иммобилизации белков и пептидов, осуществляемых в статических и динамических условиях 69
3.2.3 Влияние промежуточного спейсера на количественные характеристики аффинных взаимодействий 72
3.3 Влияние внешних условий на параметры аффинных взаимодействий, реализованных на монолитных носителях 77
3.3.1 Зависимость эффективности аффинного связывания от скорости подвижной фазы (зональное элюирование) 77
3.3.2 Использование фронтального анализа для сравнения аффинного комплексообразования при различных скоростях подвижной фазы 79
3.3.3 Влияние поверхностной концентрации иммобилизованного лиганда на аффинные параметры исследуемых пар 84
3.3.4 Влияние температуры на термодинамическую прочность аффинных комплексов 85
3.4 Практические приложения исследованных процессов, основанных на межфазовом распределении вещества 87
3.4.1 Аффинное фракционирование пулов поликлональных антител 87
3.4.2 Создание проточного ферментативного биореактора на основе химотрипсина, иммобилизованного на ГМА-ЭДМА монолитных дисках 95
3.4.3 Прямой синтез адсорбционных лигандов на макропористых монолитных носителях (ГМА-ЭДМА дисках) с использованием подхода твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) 107
4.Экспериментальная часть 114
4.1 Материалы и приборы 114
4.2 Методы 117
4.2.1 Ковалентное связывание лигандов с монолитными стационарными фазами 117
4.2.2 Высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография (ВЭМДАХ) 120
4.2.3 Количественное определение параметров аффинного взаимодействия методом фронтального элюирования 122
4.2.4 Мультифункциональная иммуноаффинная хроматография 122
4.2.5 Приготовление сывороток антител .123
4.2.6 Твердофазный пептидный синтез (ТФПС) 123
4.2.7 Синтез конъюгата БК-С-БСА 126
4.2.8 Иммуноферментный анализ 127
4.2.9 Ферментативный гидролиз 1Ч-бензоил-Ь-тирозин этилового эфира (БТЭЭ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) 129
4.2.10Анализ продуктов ферментативного гидролиза БСА с использованием метода капиллярного электрофореза 130
4.2.11 Ферментативный синтез дипептида BocLeuPheOMe с использованием химотрипсина, иммобилизованного на ГМА-ЭДМА диске 131
4.2.12Химический синтез аминокислотных производных BocLeuOMe, PheOMe и дипептида BocLeuPheOMe 131
4.2.13Твердофазный пептидный синтез на ГМА-ЭДМА дисках 133
4.2.14Гель-электрофоретический анализ ВЭМДАХ элюатов, содержащих тканевый активатор плазминогена (ТАЛ) 135
Выводы 138
Список литературы 140
Приложения 153
- Современные стационарные фазы для динамических процессов, основанных на аффинных взаимодействиях
- Проточные биореакторы на основе комплементарного связывания
- Влияние промежуточного спейсера на количественные характеристики аффинных взаимодействий
- Мультифункциональная иммуноаффинная хроматография
Введение к работе
Выделение и очистка белков, пептидов и полинуклеотидов, а также исследование их взаимодействий в растворе и в локализованном состоянии играет ключевую роль как в решении фундаментальных задач теоретической биологии, так и реализации практических планов, направленных, прежде всего, на создание лекарственных препаратов на их основе. В этой области современные генно-инженерные методы получения подобных лекарственных препаратов на настоящий момент являются наиболее перспективными как из-за отсутствия ограничений по источнику сырья, так и относительно низкой стоимости конечного продукта. Генно-инженерные технологии находят широкое применение в промышленном производстве ряда биологически активных белков и пептидов, как, например, инсулина, интерферонов, окситоцина, тканевого активатора плазминогена и др. Очевидно, что в дальнейшем спектр генно-инженерных лекарственых препаратов будет только расширяться. При этом важнейшей задачей является разработка методологических подходов для аналитического и препаративного обеспечения биотехнологических процессов, позволяющих достоверно оценить структуру, степень конверсии и чистоту целевых пептидов или белков на каждой производственной стадии, а также достичь высокой эффективности их выделения из сложных сред. Грамотно построенные методы позволяют сократить время и экономические затраты на разработку всего процесса в целом. Для решения указанных задач необходимо создание и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию, так и достоверную идентификацию продукта. Таким образом, все цели и задачи представленной работы, направленные именно на создание и детальное исследование новых сепарационных и биоконверсионных процессов для нужд современной биотехнологии, являются актуальными.
7 В качестве одного из наиболее популярных методов разделения веществ, основанного на их распределении между двумя фазами, можно назвать жидкостную хроматографию (ЖХ).
Межфазовое распределение вещества в жидкостной хроматографии является основным условием функционирования слоя как разделительной матрицы. Именно поэтому хроматографический процесс может служить логичным инструментом анализа пористых стационарных фаз, предназначенных для более тонких методов моделирования и практической реализации биокомплементарных взаимодействий. Очевидно, что для корректного построения и описания подобных взаимодействий необходимо свести к минимуму (или приблизить к естественному) влияние искусственной поддерживающей среды, используемой для локализации (иммобилизации) одного из активных компонентов. Идеальная стационарная фаза не должна провоцировать неспецифических взаимодействий между биологическим веществом и собственной поверхностью, обеспечивая при этом равную доступность активных поверхностных лигандов и осуществляя функцию незатрудненного транспорта как аффинанта, так и продукта.
Новыми и весьма перспективными сорбентами, удовлетворяющими всем требованиям, выдвигаемым к современным стационарным фазам, являются так называемые монолитные носители, занимающие в последние годы бесспорную лидерскую позицию в данной научной и практической области. Среди них, в первую очередь, могут быть названы макропористые сополимеры 2,3- эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата, ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА), выполненные в форме цельных тонких дисков. Успешно развиваемый несколькими мировыми исследовательскими группами новейший метод динамического разделения веществ с использованием данных оригинальных сорбентов получил название высокоэффективной мембранной (или, в настоящее время - монолитной дисковой) хроматографии (ВЭМХ или ВЭМДХ).
Осуществление эффективных азделительных процессов на ультракоротких непрерывных (монолитных) слоях сорбента оказалось революционным решением, внесшим серьезные коррективы в традиционные представления об основополагающих принципах хроматографии. Во-первых, привычные, так называемые проницаемые, материалы, используемые в данном сепарационном методе в качестве стационарных фаз и представляющие собой мелкодисперсные макропористые или сетчатые сорбенты, были заменены на полностью протекаемые (конвекционные) носители. Во-вторых, было доказано, что эффективный процесс разделения может осуществляться без участия стандартной длинной колонки, функцию которой успешно выполняют тонкие мембраноподобные слои. Малая толщина (длина) разделительного слоя ГМА-ЭДМА сорбентов, а также открытая структура проточных каналов, на поверхности которых происходит адсорбционное разделение, обеспечивают минимальное диффузионное сопротивление нормальному массопереносу вещества, а также, что весьма существенно, низкие рабочие давления. Таким образом, реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных материалов-носителей.
Процессы синтеза и химической модификации поверхности ГМА-ЭДМА сорбентов, а также ионообменный и гидрофобный варианты ВЭМДХ различных классов веществ представляют собой достаточно изученную научно-практическую область. Однако, закономерности подхода биоаффинного разделения с использованием ультракоротких монолитных стационарных фаз до сих пор не исследовались. Таким образом, научная новизна представляемой работы не подлежит сомнению.
Генеральной целью настоящего исследования являлось моделирование и изучение динамических процессов, основанных на распределении веществ между двумя фазами, происходящих с участием адсорбционных биологически-комплементарных взаимодействий. При этом в качестве стационарной фазы использовались макропористые ГМА-ЭДМА монолитные слои.
9 Для достижения стратегической цели решались следующие тактические задачи:
Разработка и оптимизация методов функционализации монолитных сорбентов, заключающейся в ковалентной иммобилизации различных белков и пептидов (биоспецифических лигандов) на поверхности ГМА-ЭДМА носителей; определение влияния способа ковалентного связывания лиганда на параметры последующего аффинного комплексообразования.
Исследование влияния внешних параметров (скорости потока подвижной фазы, температуры, поверхностной концентрации лиганда) на процесс образования биокомплементарных пар.
Разработка метода скоростного фракционирования сложных смесей, основанного на комбинации сорбентов различной адсорбционной функциональности.
Разработка метода твердофазного синтеза модельных пептидных последовательностей с использованием ГМА-ЭДМА монолитов; количественное сравнение аффинных пар, образованных с участием лигандов, синтезированных и иммобилизованных на поровой поверхности сорбента.
Исследование возможности создания скоростных проточных биореакторов на основе иммобилизованного на ГМА-ЭДМА монолитах фермента (химотрипсина), катализирующего реакции как расщепления (прямой катализ), так и образования (обратный катализ) пептидной связи.
Научная значимость работы заключается в формулировании новых принципов динамического образования высокоспецифических пар, которые открывают новые горизонты в исследовании биокомплементарных взаимодействий, имеющих место в живой природе. С практической точки зрения, результаты работы также представляют безусловную ценность. В качестве лишь одного примера можно назвать использование
10 мультифункционального подхода фракционирования сложных смесей при анализе и выделении белков плазмы крови.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Современные стационарные фазы для динамических процессов, основанных на аффинных взаимодействиях
В качестве матриц для иммобилизации биологических лигандов, как правило, используют нерастворимые твердые носители. До недавнего времени, подавляющая доля используемых в современной ВЭЖХ стационарных фаз приходилась на неорганические пористые носители (силикагель, макропористые стекла, силохромы и т. д.) [7]. Однако недостаточная химическая стойкость этих сорбентов побудила исследователей к активным поискам альтернатив с новыми свойствами, направленным как на улучшение самой природы сред, так и их морфологии. За последние 20 лет произошел значительный прорыв в области усовершенствования сорбентов для хроматографии вообще, и аффинного варианта, в частности. Каковы же основные требования, предъявляемые к стационарным фазам (или сорбентам) для аффинной хроматографии [6]?
При разработке новых стационарных фаз во внимание принимаются, прежде всего, такие параметры, как высокая емкость, высокая производительность (проницаемость), биосовместимость, механическая, химическая и антимикробная (биологическая) стабильность, наличие групп, способных к дериватизации (функционализации), отсутствие неспецифической адсорбции, низкие рабочие давления и т. д. В завершение параграфа, уместно привести цитату Hjerten, "не нужно создавать и выдумывать нечто новое, надо переделать и усовершенствовать имеющиеся в распоряжении материалы" [8]. Аналитические и препаративные хроматографические колонки, упакованные обычными пористыми частицами, отвечают только части требований, названных выше [9]. Необходимая высокая адсорбционная емкость площади поверхности проницаемых частиц обеспечивается оптимальной пористостью сорбента. Для достижения адсорбционно-активной поверхности молекулы анализируемого вещества, путем собственной диффузионной подвижности, должны проникнуть внутрь поры, преодолев слой стагнантной жидкости, а затем, уже внутри порового пространства подойти к самой поверхности (Рис. 1). Таким образом, именно геометрия поровой структуры создает диффузионные ограничения нормальному массопереносу. При этом требуемое время анализа может быть очень длительным. Данный факт оказывается особенно важным, когда в качестве объектов разделения рассматриваются белки, имеющие значительно более низкие коэффициенты диффузии по сравнению с низкомолекулярными веществами. Кроме того, для обеспечения потока подвижной фазы с достаточно большой скоростью сквозь слой упакованных проницаемых частиц необходимы высокие давления. Существенное улучшение эффективности разделения наблюдалось при использовании новых типов дисперсных сорбентов, а также новых методов биосепарации с их использованием. В их числе непористые [10, 11], микропелликулярные [12-15] и гигапористые структуры, представленные в перфузионных [16-19] и комбинированных гелевых (gel in a shell) [20] сорбентах. Чрезвычайно важным шагом в направлении усовершенствования стационарных сред явилось введение в хроматографическую практику макропористых полимерных сорбентов [21]. Предложены и другие оригинальные дизайны разделительных модулей и методов, как, например, радиальная хроматография и хроматография протяженного слоя [22]. Для ликвидации проблем, связанных с ограниченным движением молекул внутрь частиц, идеальными представляются непористые сорбенты (Рис. 2 в).
Впервые полностью ликвидировать поры из разделительной среды и использовать очень маленькие размеры частиц предложил Unger с соавт. [10, 11]. В таких сорбентах, массоперенос происходит непосредственно на поверхности зерен, что обуславливает ускоренный массообмен, и как следствие, высокие скорости анализа [23]. Правда, для получения необходимой емкости, которая может быть ограничена в этом варианте низкой специфической площадью поверхности, частицы должны быть очень малых размеров (обычно их диаметр 1.5-3 мкм [11]), что влечет за собой значительные увеличения рабочих давлений.
Проточные биореакторы на основе комплементарного связывания
Хроматографический реактор представляет собой хроматографическую колонку, в которой вещества претерпевают частичные или полные превращения с образованием продуктов. Реакционная смесь вводится в реактор с помощью насоса. И конверсия субстрата, и разделение продуктов происходят в условиях потока жидкой фазы, т. е. устройство работает и как реактор, и как хроматограф [103]. Таким образом, динамические (проточные) реакторы представляют собой систему, состоящую из стационарной фазы с иммобилизованным биокатализатором и насоса, обеспечивающего поток через нее реакционной смеси. Такие реакторы также могут быть одновременно снабжены аналитическим устройством. Идея хроматографических реакторов была воплощена впервые в начале 60-х годов сразу несколькими исследовательскими группами [104, 105]. Основным преимуществом называлась возможность последовательного удаления продуктов из реакционной среды в процессе реакции, что особенно важно для обратимых процессов. Хорошо известно, что лишь немногие биокатализаторы действительно существуют in vivo в виде свободного белка в водной среде. Большинство из них связано с мембранами или нерастворимыми ансамблями [3]. Таким образом, ферменты, присоединенные к хорошо охарактеризованным носителям, могут служить упрощенными моделями биологических систем. Естественно, что синтетические матрицы, не могут точно воспроизвести природную ситуацию, однако исследование таких моделей может оказаться очень полезным и важным этапом в рассмотрении ферментативного катализа как гетерогенного процесса.
Данные процессы, также как и хроматографические, характеризуются распределением биологической субстанции между подвижной и неподвижной фазами, однако они могут быть отнесены уже не к классу биосепарации, а к более сложному разделу - биоконверсии. В обоих случаях происходит образование специфического (аффинного) комплекса между компонентами, находящимися в подвижной и неподвижной фазах. Понятно, что в случае иммобилизации фермента с целью продуктивного использования его энзиматической функции, комплекс фермент-субстрат должен быть максимально адекватным подобной паре, образующейся в природных (нативных) условиях, а поэтому параметры выбираемого носителя в этой ситуации становятся особенно важными. В качестве твердой матрицы могут быть использованы все вышеупомянутые типы стационарных фаз для аффинной хроматографии. При этом стационарная фаза должна обеспечивать иммобилизацию без затрагивания активных центров катализатора, беспрепятственное взаимодействие фермента с субстратом, сохранение каталитической активности в течение длительного времени, а также сведение к минимуму всех видов диффузионных ограничений. Поэтому все вышесказанное в отношении стационарных фаз для аффинной хроматографии можно применить и к носителям для биореакторов. Иммобилизация ферментов приводит к получению специфических катализаторов, которые при достаточной стабильности могут быть повторно использованы. Одновременное или последовательное действие нескольких ферментов может быть легко достигнуто смесью ферментов, иммобилизованных на носителе, или послойным наполнением колонки сорбентами с различными присоединенными катализаторами. Реакции, катализируемые таким образом можно легко контролировать.
Так, например, время реакции можно контролировать, регулируя скорость потока через колонку [6]. При присоединении ферментов к носителю чаще всего они приобретают дополнительную устойчивость по сравнению со свободными белками. Стабильность и активность ферментов, ковалентно связанных с нерастворимыми носителями, определяется физической и химической природой матрицы, а также характером химической иммобилизации. Не останавливаясь подробно на многочисленных типах ферментативных реакторов, приведем лишь несколько наиболее современных примеров. В работе [106] приводятся сравнительные характеристики двух типов биореакторов. Первый представлял собой монолитную стержневую колонку, а второй - колонку, заполненную сферическими частицами той же химической природы (ГМА-ЭДМА макропористый сополимер). В обоих случаях, иммобилизованный трипсин осуществлял каталитическое расщепление Цитохрома С. При этом отмечалось, что протеаза, иммобилизованная на монолитном носителе, обнаруживала более высокую кажущуюся активность.
Несмотря на большее количество присоединенного к дисперсным частицам трипсина, скорость расщепления в данном случае определялась лимитирующей диффузией высокомолекулярного субстрата в поры и, в результате, число фрагментов, полученных на сферических частицах, оказалось меньшим. Мембраны, которые могут служить носителями для клеток, фрагментов тканей или ферментов, также находят широкое применение в качестве основы для биокаталитических реакторов. Так, мембранные реакторы используются в пищевой промышленности для гидролиза лактозы, высокомолекулярных белков молока, ферментации сахара, конверсии глюкозы, гидролиза целлюлозы, фумаровой кислоты и т. д. [107]. В работе [108] для иммобилизации различных ферментов (оксидазы, трипсина, инвертазы) авторы использовали монолитные макропористые ГМА-ЭДМА диски. На полученных сорбентах успешно проводили превращения как низко-, так и высокомолекулярных субстратов. В этой же работе описана возможность одновременного использования нескольких дисков, что является несомненным преимуществом этих модусов. Появление ферментативных реакторов нового поколения связано с новыми областями исследования, как, например, неводная энзимология, использование антител в качестве высокоспецифических катализаторов, использование небиологических катализаторов (например, циклодекстринов), а также конструирование биосенсоров, используемых для диагностических целей [107]. Это стимулирует поиск оптимальных путей реализации процессов на их основе, а значит, все задачи, связанные с усовершенствованием стационарных фаз, остаются актуальными и сегодня, предоставляя широкий простор для исследовательской деятельности. Высокая стоимость и трудоемкость химического синтеза пептидов побуждают искать принципиально иные подходы к решению многих задач. Одним из них являются попытки использования ферментов в качестве катализаторов. Еще в 1937 г М. Bergmann и Н. Fraenkel-Conrat впервые сообщили о возможности обращения протеолитической реакции в сторону образования пептидной связи [109].
Влияние промежуточного спейсера на количественные характеристики аффинных взаимодействий
Как уже было сказано выше, обычно, для иммобилизации большинства белков используется хорошо контролируемая и воспроизводимая процедура, основанная на ковалентном присоединении аминогрупп лиганда к эпоксидным группам матрицы (Рис. 10 а). В то же время, иногда иммобилизация отличных от нативного белка структур (например, сукцинилированного БСА, БСА-С, или сложного конъюгата брадикинина с бычьим сывороточным альбумином, БСА-С-БК [127]), у которых реакция с аминогруппами либо невозможна, либо затруднена, осуществляется другим способом. Например, в структуру сорбента могут предварительно вводиться якорные аминогруппы. После такой первичной функционализации, осуществляется реакция между аминогруппами сорбента и карбоксильными группами лиганда с участием водорастворимого карбодиимида (Рис. 10 б). Более того, иммобилизация на поровой поверхности носителя коротких пептидов, также используемых в качестве эффективных аффинных сайтов, имеет свои специфические особенности [6]. В литературе по традиционной аффинной хроматографии (особенно в случае использования сорбентов гелевого типа) предлагается, как правило, использовать промежуточные спейсеры, пространственно отделяющие иммобилизованный лиганд от поверхности стационарной фазы.
Использование спейсера выглядит особенно оправданным для случая введения в качестве адсорбционных центров коротких пептидных последовательностей [3]. Существует мнение, что подобные спейсеры улучшают подвижность лиганда, увеличивая, таким образом, доступность реакционных центров в процессе их взаимодействия с аффинным партнером, находящимся в подвижной фазе (растворе). Правильный выбор природы и длины промежуточного "мостика" может также уменьшать вероятность нежелательного, или неспецифического, взаимодействия биомолекул с поверхностью сорбента. Таким образом, нам показалось целесообразным исследовать влияние подобных структурных интермедиатов на биологические функции макромолекул, связанных ковалентно с поверхностью жестких макропористых стационарных фаз монолитного типа. С точки зрения биологического подобия, чрезвычайно привлекательной является идея использования в качестве линейных спейсеров синтетических пептидов. В наших экспериментах, в качестве пространственных "мостиков" использовались адсорбционно-инертные по отношению к растворенному биологическому партнеру пептидные последовательности - трипептид GGG (Gly-Gly-Gly) и нонапептид GVVKNNFVP (Gly-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro). Сравнение проводили на примере процесса биоаффинного выделения моноспецифических антител, полученных в ответ на иммунизацию кроликов ковалентным конъюгатом БСА-С-БК. В качестве стационарных фаз использовали монолитные диски, функционализированные белковым (БСА) или пептидным (БК) лигандами. Аффинные лиганды вводили в структуру сорбента либо непосредственно (одностадийная реакция с участием нативных эпоксидных групп), либо путем их присоединения к предварительно иммобилизованным пептидным спейсерам (Рис. 10 в). Аналогично предыдущим экспериментам, для определения аффинных характеристик всех исследованных в данном случае взаимодействий использовали подход фронтального анализа с последующим построением изотерм адсорбции в координатах С , мг/мл раствора - Q , мг/мл сорбента. Линеаризация полученных изотерм, удовлетворяющих уравнению Langmuir, обычно позволяет вычислить кажущиеся константы диссоциации аффинных комплексов, Kdiss, со стандартным отклонением г2 0.9800-0.9995 (по данным 10 анализов). Те же линейные зависимости дают возможность определить величину максимальной адсорбционной емкости используемого сорбента.
На Рис. 11 представлен пример одной экспериментальной изотермы и ее линеаризованной формы, полученной для одной из исследуемых пар. В обсуждаемой серии определяемые константы диссоциации можно определить как кажущиеся, поскольку их значения обусловлены вкладом адсорбции как моноспецифических к данному лиганду, так и перекрестных антител [130]. Несмотря на это обстоятельство, данный количественный подход может быть использован для сравнительной оценки эффекта промежуточного спейсера. Табл. 4 демонстрирует отсутствие как положительного, так и отрицательного эффекта обоих пептидных спейсеров. Во-первых, результаты показывают, что длина пептидов, используемых в качестве интермедиата, не отражается на константе диссоциации аффинных комплексов. Кроме того, очевидно, что значения обсуждаемых констант практически одинаковы для взаимодействий, включающих как белковый, так и пептидный лиганды. Эти результаты подтверждают оптимальную поровую структуру полимерных носителей, в которых образование аффинного комплекса происходит без стерических ограничений. Можно предположить, что роль нативного короткого промежуточного спейсера играет фрагмент 2-гидроксипропила, который образуется в результате раскрытия эпоксидного кольца глицидильной группы. Длины этого "мостика" (0.9 нм), вероятно, достаточно для обеспечения оптимального взаимодействия как низко-, так и высокомолекулярного лиганда с растворенными антителами. Таким образом, полученный результат показывает, что в случае использования для биоаффинных разделений сорбентов-монолитов обсуждаемого типа введение промежуточного спейсера не является обязательной процедурой. При этом термодинамические характеристики образующихся комплексов оказываются близкими к значениям, полученным
Мультифункциональная иммуноаффинная хроматография
Количественные аффинные характеристики рассматриваемых пар, такие как максимальная адсорбционная емкость (Qmax) и константа диссоциации аффинного комплекса (Kdiss), вычисляли путем математической обработки экспериментальных изотерм адсорбции, полученных способом фронтального элюирования (фронтальный анализ). В данном варианте, осуществляли полное насыщение адсорбционных центров поверхности сорбента молекулами выделяемого вещества. После удаления неспецифически связанной части вещества (ионные или гидрофобные взаимодействия), осуществляли стадию десорбции специфически адсорбированной доли образца. Для регистрации зон элюируемого белка использовали спектрофотометрическое детектирование при длине волны 278 нм. Десорбированную фракцию собирали в градуированные пробирки и определяли концентрацию белка (и, соответственно, его количество в зоне десорбции), используя количественные аналитические методы (метод прямого спектрометрического определения, стандартный тест Lowry [127]). Кажущиеся константы диссоциации аффинных комплексов определяли линеаризацией экспериментальных изотерм адсорбции [92]. Четыре диска с лигандами, соответствующими трем составным частям комплексного конъюгата, использованного для экспериментальной иммунизации кролика (а именно, БСА, БК и БСА-С), а также самому конъюгату (БСА-С-БК) были установлены в один и тот же картридж. 0.5 мл смеси антител (полученных трехкратным осаждением из сывороток крови 35% сульфатом аммония) с концентрацией 2 мг/мл пропускали сквозь стопу монолитных сорбентов. В качестве подвижной фазы использовали 0.01 М натрий фосфатный буфер, рН 7.0, содержащий 0.15 М NaCl. По завершении адсорбции, стопу дисков промывали 2 М раствором NaCl.
После этой процедуры, диски извлекали из картриджа и антитела, адсорбированные на каждом диске, десорбировали отдельно с каждой единицы сорбента, используя 0.01 М НС1, рН 2.0. Последовательность дисков, устанавливаемых в картридж, изменялась, что позволило определить долю перекрестных антител. 4.2.5 Приготовление сывороток антител Приготовленный 30-35% раствор сульфата аммония добавляли в 10-ти кратном избытке в сыворотку крови предварительно иммунизированных животных. После тщательного перемешивания и отстаивания, гетерогенную смесь разделяли центрифугированием в течение 40 минут со скоростью 6000 об/мин. Выделенную нерастворимую фракцию повторно заливали 10-ти кратным избытком раствора (NH SCM и оставляли на ночь. Осадок отделяли, центрифугируя смесь с той же скоростью, растворяли в воде и очищали диализом против дистиллированной воды в течение 20 часов при комнатной температуре. Полученную гетерогенную смесь снова центрифугировали при тех же условиях, и конечную надосадочную жидкость лиофильно высушивали. 4.2.6 Твердофазный пептидный синтез (ТФПС) Синтетический нонапептидный гормон брадикинин (RPPGFSPFR - Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg), а также два пептидных лиганда, использованных в качестве адсорбционно-инертных промежуточных спейсеров - нонапептид GVVKNNFVP (Gly-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Val-Pro) и трипептид GGG (Gly-Gly-Gly) - синтезировали с использованием стандартного подхода твердофазного пептидного синтеза на смолах Merrifield, осуществляемого по Boc/Bzl стратегии. В качестве деблокирующего агента в ТФПС использовали 1 М раствор п-толуолсульфокислоты в ледяной уксусной кислоте и 10% раствор триэтиламина в диметилформамиде.
Синтез проводили по следующей программе: Ацилируюшую смесь готовили следующим образом: в 1.5 мл ДМФА растворяли по 3 эквивалента (по отношению к емкости смолы) 1-оксибензатриазола (HOBt), диизопропилкарбодиимида и аминокислоты; смесь выдерживали в течение 40 минут и добавляли в реактор. Растворители брали из расчета 20 мл на 1 г полимера. Присоединение первой аминокислоты проводили по программе: 1x30 мин ДМФА 1 х 1 мин ТЭА/ДМФА 1 х 2 мин ТЭА/ДМФА 3x2 мин ДМФА 1 х 2.5 часа ацилирующая смесь Наращивание полипептидной цепи осуществляли в соответствии со следующей программой: Синтезированный пептид снимали с полимерной смолы следующим способом. К 1 г пептидил-носителя при охлаждении до -5С (лед с солью) и интенсивном перемешивании добавляли последовательно 1 мл тиоанизола, 0.5 мл этандитиола, 10 мл трифторуксусной кислоты (ТФУК) и, по каплям, 1 мл трифторметансульфокислоты. Через 15 минут охлаждение прекращали и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 2.5 часа. Снятый с полимера пептид, находящийся в растворе ТФУК, осаждали добавлением 100 мл высушенного над щелочью диэтилового эфира и отделяли фильтрованием. Полученный пептид осаждали добавлением супернатанта в 200 мл диэтилового эфира, смывая его с фильтра с помощью ТФУК. Продукт отделяли от низкомолекулярных компонентов методом гель-хроматографии, используя для этого колонку, заполненную сефадексом G-10, а в качестве элюента - 50% раствор уксусной кислоты. Далее определение степени чистоты полученного пептида и конечное выделение продукта производили методом обращенно-фазовой хроматографии (см. Материалы и приборы). Для определения полноты проведения реакции ацилирования использовали следующие качественные реакции: Обнаружение первичной аминогруппы с помощью реакции с нингидрином Используемые реагенты: 6% раствор нингидрина в абсолютном
