Содержание к диссертации
Введение
1. ДНК-сенсоры для определения низкомолекулярных соединений (Литературный обзор) 11
1.1. ДНК как элемент биохимического распознавания 14
1.2. Методы иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности сенсоров 19
1.3. Применение ДНК-сенсоров дли определения низкомолекулярных соединений 29
1.3.1. Определение лекарственных препаратов 31
1.3.2. Определение ДНК-повреждающих факторов и загрязнителей окружающей среды 36
1.3.3. Определение производных фенотиазина и феноксазина 38
1.3.4. Применение ферментов в составе ДНК-сенсоров 44
2. Экспериментальная часть 52
2.1. Материалы и реагенты 52
2.2. Приборы и оборудование 54
2.3. Методы исследования 56
2.3.1. Изготовление биосенсоров 56
2.3.2. Электрохимические измерения 57
2.3.3. Измерение сигнала биосенсоров 58
3. Выбор условий измерения сигнала днк-пероксидазного сенсора 63
3.1. Обоснование выбора электрохимического маркера и способа регистрации сигнала 63
3.2. Электрохимическое поведение метиленового синего и метиленового зеленого на стеклоуглеродном электроде 65
3.3. Окисление фепотиазиновых красителей на пероксидазном сенсоре 61
3.4. Влияние ДНК. на пероксидазное окисление маркеров 71
4. Определение лекарственных препаратов с помощью днк-пероксидазного сенсора 83
4.1. Определение сульфаниламидных препаратов 83
4.1.1. Определение сульфаниламидов с МС в качестве маркера 86
4.1.2. Оценка правильности определения сульфаметоксазола 93
4.1.3, Определение сульфаниламидов с МЗ в качестве маркера 99
4.2. Определение других лекарственных препаратов 101
5. Применение днк-пероксидазного сенсора для контроля загрязнителей окружающей среды 110
5.1. Определение модельных токсикантов 110
5.2. Изучение повреждающего действия гидроксилъных радикалов 118
Заключение 123
Выводы 125
Список использованных библиографических источников 127
- Методы иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности сенсоров
- Изготовление биосенсоров
- Электрохимическое поведение метиленового синего и метиленового зеленого на стеклоуглеродном электроде
- Определение других лекарственных препаратов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействия низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами лежат в основе самых разнообразных биохимических процессов, играющих фундаментальную роль в передаче генетической информации, биосинтезе белка и ряде других биохимических процессов. Изучение таких реакций современными инструментальными методами во многом предопределило прорыв в нашем понимании фундаментальных закономерностей молекулярной биологии и генетики. Составной частью таких исследований является использование биосенсоряых технологий, основанных на изучении аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности преобразователя сигнала с помощью оптических, масс-селективньгх и электрохимических методов анализа. Несмотря на то, что условия взаимодействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными регуляторами и эффекторами различной природы отличаются от таковых в живой клетке, биосенсоры с ДНК в качестве элемента распознавания дают ценную информацию о специфичности связывания, молекулярных механизмах и биохимических реакциях организма в целом. Исследования в области ДНК-сенсоров активно стимулируются также исследованиями в области ранней диагностики и химиотерапии онкологических заболеваний. Здесь основной задачей является оценка доз противораковых препаратов и их концентраций в биологических жидкостях и лекарственных формах. ДНК-сенсоры активно применяются для скрининга новых потенциальных лекарств противоракового действия и в исследовании их ф армакокинетики.
Перспективы биосенсорных технологий в решении фундаментальных и прикладных задач биохимии нуклеиновых кислот, токсикологии и фармакологии не в последнюю роль определяются совершенствованием принципов регистрации аналитического сигнала. В отличие от обнаружения определенных последовательностей олигонуклеотидов в диагностике генетического материала, взаимодействие аффинных реагентов с нуклеиновыми
кислотами на поверхности преобразователя сигнала не приводят к существенным изменениям свойств поверхности. Это затрудняет применение масс-селективиых детекторов, определяющих изменение массы поверхностного слоя, либо оптических методов, основанных на контроле характеристик самих нуклеиновых кислот. Как и в иммунохимических методах анализа, при разработке ДНК-сенсоров основной упор делают на использовании меток - низкомолекулярньгх соединений или фрагментов, включаемых в состав биологических мишеней. Изменение их сигнала в результате биохимического распознавания сенсоров позволяет установить присутствие определяемого вещества в растворе и оценить параметры его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В качестве таких меток применяют комплексы переходных металлов, некоторые органические медиаторы электронного переноса (ферроцены, витаминоподобные вещества, замещенные ароматические спирты и амины). Принципиальным недостатком такого подхода является необходимость в предварительном синтезе «меченых» последовательностей олигонуклеотидов или низкомолекулярных компонентов реакции, а также a priori невысокая чувствительность определения, связанная с конкурентным характером реакции.
Поэтому в последнее время большое внимание уделяется применению диффузионно свободных (растворимых) меток, называемых также маркерами. Их внедрение в поверхностный слой биосенсора происходит за счет электростатических взаимодействий либо специфического связывания с ДНК (интеркалирования). Несмотря на то, что использование маркеров усложняет процедуру измерения, достигаемые за счет этого преимущества в чувствительности и селективности определения заставляют совершенствовать структуру и способ измерения маркеров в зависимости от характера их взаимодействия с ДНК.
Применительно к электрохимическим способам регистрации сигнала, характеристики определения маркеров не в последнюю очередь зависят от характера их электрохимических превращений на электроде. Многие соединения, будучи эффективными интер-
7 каляторами, окисляются на электродах с большим перенапряжением, необратимо, иногда
с образованием нерастворимых продуктов олигомеризации и/или хемосорбции. Это не только затрудняет регенерацию биосенсора после измерения, но и осложняет интерпретацию сигнала, поскольку параллельно взаимодействию с ДНК происходит изменение условий пассивного диффузионного переноса маркеров к поверхности сенсора.
В этой связи, большой потенциал имеет включение в генерирование сигнала ДНК-сенсора дополнительных стадий каталитического превращения маркера, "отодвигающих" реакцию от поверхности и повышающую эффективность определения концентрации и окислительно-восстановительного статуса как индикатора аффинных взаимодействий с ДНК.
В этой связи, целью данной работы явилась разработка нового ДНК-сенсора, включающего для усиления сигнала маркеров (производных фенотиазииа) индикаторный фермент (пероксидаза), обеспечивающий каталитическую регенерацию активной формы маркера в электродной реакции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
определить условия взаимодействия фенотиазиновых маркеров (метиленового синего и метиленового зеленого) с компонентами биочувствительного слоя (ДНК и пероксидаза), необходимые для регенерации активной формы индикатора и регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности сенсора;
найти рабочие условия иммобилизации пероксидазы и наганной ДНК в поверхностном слое, обеспечивающие воспроизводимый сигнал ДНК-пероксидазиого сенсора и высокую чувствительность определения низкомолекулярных соединений - участников аффинных взаимодействий;
изучить механизм взаимодействия фенотиазиновых маркеров, лекарственных препаратов, загрязняющих веществ с ДНК и установить механизм влияния природы маркеров,
8 определяемых соединений и условий измерения на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, его аналитические и операционные характеристики;
разработать высокочувствительные методы определения указанных соединений и предложить способы контроля селективности отклика биосенсора путем варьирования природы медиатора и условий измерения сигнала.
Научная новизна работы заключаются в том, что: предложен и реализован на примере определения различных низкомолекулярпых соединений биологического значения новый способ регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК, основанный на вовлечении электрохимически активного маркера -производного фенотиазина - в сопряженную реакцию ферментативного окисления с электрохимической регенерацией активной формы маркера;
обосновано использование в составе ДНК-пероксидазиых сенсоров для регистрации аффинных взаимодействий двух маркеров - метиленового синего и метиленового зеленого, обеспечивающих дифференциацию сигнала в зависимости от природы определяемого соединения;
установлен механизм генерирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора для соединений, различным образом реагирующих с ДНК, и предложены способы направленного изменения чувствительности сигнала ДНК-пероксидазного в отношении определяемых соединений - сульфаниламидов, антрациклинов, загрязняющих веществ; доказана возможность использования ДНК-пероксидазного сенсора для регистрации повреждающего действия на ДНК радикалов гидроксида и защитного действия антиок-сидантов.
Практическая значимость работы состоит в том, что: предложены простые и удобные в использовании способы модификации стеклоуглерод-ных злеісгродов нативной и денатурированной ДНК и пероксидазой, обеспечивающие
9 возможность каталитической регенерации маркера в сопряженной электрохимической и
биохимической реакции;
разработаны методики определения сульфаниламидных препаратов, рубомицина, док-сорубицина, промазина, цефтазидима в нано- и микромолярном диапазоне их концентраций;
предложены подходы к оценке генотоксических свойств загрязнителей окружающей среды по их влиянию на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора.
На защиту выносятся:
результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых маркеров на стек-лоуглеродном электроде, модифицированном ДНК, пероксидазой и их смесью и вывод о механизме взаимодействия маркеров с компонентами биочувствительного слоя и его влиянии на сигнал биосенсора;
новый способ регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений с нативной ДНК по току восстановления маркеров — метиленового синего и метиленового зеленого - в присутствии определяемых соединений, отражающему скорость каталитической регенерации маркера в каталитическом цикле;
результаты изучения влияния лекарственных соединений на сигнал ДНК-перокидазного сенсора и вывод о влиянии механизма их взаимодействия с ДНК на характеристики их определения в зависимости от природы маркера и условий измерения сигнала;
оценка влияния ДНК-повреждающих факторов (на примере шдроксильньгх радикалов) и загрязняющих веществ на поведение ДНК-пероксидазного сенсора и вывод о возможности его использования для предварительного скрининга уровня загрязнения окружающей среды.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме по биокатализу «Biocatalysis-2002. Fundamentals and Applications» (Москва, 2002), 12 Мелсдународной конференции по аналитической химии EUROANALYSIS 12
10 (Дортмунд, Германия, 2002), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), Международном симпозиуме по ДНК-сенсорам «New trends in nucleic acid based biosensors» (Флоренция, Италия, 2003), . VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы анализа» (Саратов, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (Екатеринбург, 2005), Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004» (Москва), III научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ. «Материалы и технологии XXI зека», Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2003).
Основные результаты изложены в 3 статьях и 7 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 44 рисунка и 14 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета при поддержке РФФИ (грант № 03-03-32492 "Электрохимические ДНК-сенсоры с ферментативным усилением сигнала»), Санкт-Петербургского конкурсного центра в области естественных наук, научно-образовательной программы CRDF и Ми-нобрнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007), ИНТАС (грант 00-0870 "Простые и чувствительные способы определения ксенобиотиков в окружающей среде и продуктах питания").
Методы иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности сенсоров
В большинстве вариантов генерирования сигнала ДНК-сенсоров предполагается формирование комплексов ДНК - определяемое вещество (в том числе, комплементарных двунитевых олигонуклеотидов в случае гибридизационных сенсоров) на поверхности пре образователя сигнала. Поэтому основной стадией создания ДНК-сенсора является выбор оптимального способа иммобилизации ДНК-зонда. Разработанные для этого протоколы методологически незначительно отличаются от методов иммобилизации других биополимеров, прежде всего, белков. Их можно условно разделить на следующие группы: а). Физическая иммобилизация: - сорбция на электроде, в том числе с образованием ионных комплексов и в самоорганизующихся слоях; - включение в инертные носители - гели или полимерные пленки, содержащие ДНК, стерически удерживаемые в объеме полимера; - б). Ковалентная иммобилизация: - пришивка к носителю или поверхности электрода специальными бифункциональными реагентами; - модификация молекул ДНК (олигонуклеотидов) с последующей химической реакцией с носителем или преобразователем сигнала ДНК-сенсора. Главной особенностью ДНК, определяющей особенности ее поведения при иммобилизации по сравнению с белками, является высокая плотность отрицательного заряда биомолекулы, формируемая фосфатным остовом, а также стерические ограничения доступа молекул ДНК к поверхности электрода (границе раздела фаз) в силу особенностей ее трехмерной структуры. Физическая сорбция является самым простым способом иммобилизации ДИК. Из электродных материалов наибольшее сродство к ДНК проявляет ртуть, при этом сорбция сопровождается значительным искажением трехмерной структуры ДНК. Это выражается, в частности, в проявлении электрохимической активности сорбированной ДНК, впервые обнаруженной на ртутном стационарном электроде [40]. Далее по мере убывания прочности сорбционного связывания располагаются серебро [41], графит [42], платина и стекло-углерод [43]. Для иммобилизации электроды помещают в раствор ДИК на определенный промежуток времени и далее высушивают для лучшего закреплении биополимера за счет удаления пленки воды с его поверхности.
Перед измерением электроды отмывают ДЛЯ удаления непрочно связанных молекул ДНК. Несмотря на то, что физическая сорбция позволяет получить электроды с достаточно высокой степенью покрытия поверхности, в ДНК-сенсорах в настоящее время ее почти не используют, поскольку в условиях измерения сигнала и при изменении состава среды всегда происходит плохо контролируемый процесс десорбции части ДНК, что снижает воспроизводимость и затрудняет интерпретацию сигнала сенсора. Эффективнее проходит сорбция ДНК на анодно поляризованном электроде. Положительный заряд поверхности удерживает отрицательно заряженную молекулу ДНК за счет электростатических взаимодействий. Электрод поляризуют при +600 ... +800 мВ OTH.Ag/AgCl и далее погружают в раствор ДНК на определенное время, после чего, не размьжая цепь, переносят в раствор, содержащий определяемое вещество. Электростати-ческую иммобилизацию используют, прежде всего, для регистрации гибридизации, поскольку в таких сенсорах сигнал обычно измеряют при высоких положительных значениях потенциала [42]. Таким же образом измеряли повреждение ДНК под действием высоких температур [44] и ее взаимодействие с интеркалирующими лекарственными препаратами [45].
Недостатками таких сенсоров является необходимость создания слоя ДНК непосредственно перед измерением, вручную, и узкая область рабочих потенциалов, ограниченная потенциалом накопления ДНК. Электростатические взаимодействия можно использовать и для регулируемого обратного переноса накопленной на поверхности электрода ДНК в раствор. Для этого необходима катодная поляризация электрода (-1.7 В отн. Ag/AgCl для золотого электрода) [46]. Включение в инертные носители. В данной группе методов иммобилизации инертный носитель (обычно полимер) препятствует вьшосу ДНК с поверхности сенсора в раствор. Предполагается, что включение в полимер незначительно влияет на пространст
Изготовление биосенсоров
Изготовление пероксидазпого сенсора. На рабочую поверхность стеклоуглерод-ного электрода наносили 3 мкл раствора пероксидазы из корней хрена (250 Е/мг, производство "Sigma") и давали подсохнуть до образования гладкой пленки в токе воздуха. Затем наносили 3 мкл 0.01% раствора желатина и высушивали. Далее проводили кросс-сшивку белков 1% глутаровым альдегидом. Для этого 3 мкл раствора сшивающего агента с помощью микродозатора распределяли по поверхности электрода и сушили в токе воздуха при комнатной температуре. Затем полученные электроды промывали дистиллированной водой до исчезновения запаха глутарового альдегида и высушивали. Пероксидаз-ные сенсоры хранили при 4С.
Изготовление ДНК-пероксидазного сенсора. На рабочую поверхность стеклоуг-леродного электрода наносили 3 мкл раствора ДНК (0.025-25 мкг/мл), подсушивали до образования гладкой влажной пленки в токе воздуха при комнатной температуре, далее проводили иммобилизацию пероксидазы как описано выше для пероксидазпого сенсора. Готовые биосеисоры промывали дистиллированной водой и высушивали. Готовые ДНЮ пероксидазные сенсоры хранили при 4С. Изготовление денДНК-пероксидазного сенсора. Раствор 0.0025 мг/мл ДНК тер-мостатировали в течение 30 мин. при 95С, затем переносили в ледяную баню на 5 мин. После этого 3 мкл раствора денатурированной ДНК наїїосили на очищенную поверхность стеклографитового электрода, высушивали под потоком воздуха и иммобилизовали совместно с пероксидазой, как описано выше. Изготовление ДНК-сенсора. На рабочую поверхность стеклоуглеродного электрода наносили 3 мкл раствора ДНК (0.025-25 мкг/мл), подсушивали до образования гладкой пленки под потоком воздуха. Затем наносили 3 мкл 0.01% раствора желатина, подсу 57 шивали до образования влажной пленки и наносили 3 мкл 1 % раствора глутарового альдегида. После высушивания электроды промывали в течение 10 мин. в дистиллированной воде и сушили. Готовые ДНК-сенсоры хранили в холодильнике при 4С. Изготовление денДНК-сенсора. Раствор 0.0025 мг/мл ДНК подвергали термической денатурации, как описано выше, после чего 3 мкл раствора наносили на электрод и иммобилизовали в присутствии желатина. В режиме постояннотоковой вольтамперометрии измерения проводили при скорости развертки потенциала 50 мВ/с.
Аналитическим сигналом служил ток пика восстановления продукта ферментативной реакции либо окисления исходного маркера, измеряемый относительно фоновой кривой, регистрируемой в рабочем буферном растворе в отсутствие субстратов пероксидазы (контрольное измерение). В качестве примера на рис.2.3 представлены циклические вольтамперограммы 20мкМ МС и 20 мкМ МЗ. В режиме квадратно-волновой вольтамперометрии измерения проводили в следующих условиях: амплитуда 25 мВ, шаг изменения потенциала 4 мВ, частота 15 Гц. Примеры вольтамперограмм представлены на рис.2.4. При проведении измерения в ячейку заливали 5 мл 2.0 мМ фосфатного буферного раствора, рН 6.8-7.0, содержащего 0.1 М сульфат натрия, помещали электроды и регистрировали фоновую вольтамперограмму (контрольное измерение) в диапазоне потенциалов -400 до +300 мВ при скорости развертки 50 мВ/с. Затем в ту же ячейку добавляли аликво-ту раствора фенотиазинового красителя. Раствор перемешивали с помощью магнитной мешалки 5 мин., после чего повторяли сканирование потенциала. Сигналом служила разность токов окисления фенотиазинового красителя и фонового тока при потенциале пика (- 170 мВ при линейном сканировании потенциала и -150 мВ в квадратноволновой вольт-амперометрии). Между измерениями рабочую поверхность электрода полировали на замше. 2.3.3. Измерение сигнала биосенсоров
Пероксидазный сенсор. В ячейку заливали 5 мл 2.0 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7.0, содержащего 0.1 М сульфат натрия, добавляли 50 мкл 0.1 М раствора Н202, помещали электроды и регистрировали вольтамперограмму как описано выше (контрольное измерение). Далее в ту же ячейку добавляли раствор фенотиазинового красителя, рас твор перемешивали с помощью магнитной мешалки 5 мин. и повторяли измерение сигнала в диапазоне от +200 до -400 мВ. Рабочим сигналом служила разность между током восстановления окисленной формы фенотиазинового красителя и фоновым сигналом контрольного измерения при -250 мВ. После этого пероксидазный сенсор отмывали в рабочем буферном электроде при постоянном потенциале -250 мВ в течение 3 мин. Изучение влияния лекарственных препаратов на пероксидазу проводили аналогичным образом при использовании в качестве органического субстрата пероксидазы 1.0 мМ гидрохинона. Для этого после проведения измерения сигнала пероксидазный сенсор инкубировали в растворе исследуемого препарата в течение 5 мин. и далее измеряли сигнал в том же растворе, как описано выше. Сигналом служило изменение тока восстановления бензохинона -продукта ферментативного окисления гидрохинона до и после контакта пероксидазного сенсора с исследуемым препаратом ДНК- и денДНК-сеисор. В ячейку с 5 мл 0.002 М фосфатного буферного раствора, рН 7.0, содержащего 0.1 М сульфат натрия, помещали электроды и регистрировали вольтамперограмму. Далее добавляли раствор фенотиазинового красителя, раствор перемешивали с помощью магнитной мешалки 5 мин. и повторяли измерение сигнала в диапазоне от -400 до +200 мВ. Рабочим сигналом служила разность между током окисления восстановленной формы фенотиазинового красителя и фоновым сигналом контрольного измерения при -200 мВ.
После этого пероксидазный сенсор отмывали в рабочем буферном электроде при постоянном потенциале -200 мВ в течение 3 минут. ДНК-пероксидазный и денДНК-перокидазныйо сенсор. Измерение сигнала проводили как описано выше для пероксидазного сенсора. Сенсор отмывали в рабочем буферном растворе при потенциале -250 мВ в течение 7 минут. Оценка влияния токсикантов и лекарственных, препаратов. Сначала проводили контрольное измерение и регистрировали фоновую вольтамперограмму в растворе перок-сида водорода, как описано выше для пероксидазного сенсора. Затем биосенсор промывали для удаления остаточного пероксида водорода и помещали в раствор определяемого соединения (стадия инкубирования) на 10 мин. Биосенсор ополаскивали дистиллированной водой и помещали в ячейку с рабочим буферным раствором и пероксидом водорода. После кондиционирования и повторного измерения фоновой вольтамперограммы добавляли раствор фенотиазинового красителя, содержимое ячейки перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 5 минут и повторяли измерение сигнала. Рабочим сигналом служила разность токов пика восстановления окисленной формы маркера и фонового сигнала контрольного измерения. Биосенсор отмывали в рабочем буферном растворе при потенциале -250 мВ в течение 10 минут. Измерение также проводили, добавляя маркер и пероксид водорода в раствор лекарственного препарата после стадии инкубирования. Оценка влияния гидроксидных радикалов. В рабочую ячейку заливали 5 мл 0.002 М фосфатного буферного раствора, рН 7.0, содержащего 0.1 М сульфат натрия, и 1.0 мМ пероксида водорода, помещали электроды и регистрировали вольтамперограмму (контрольное измерение). Далее добавляли раствор фенотиазинового красителя, раствор церемешивали с помощью магнитной мешалки 5 мин. и повторяли измерение сигнала в диапазоне потенциалов +250 ... -450 мВ. После этого ДНК-пероксидазный сенсор отмывали в рабочем буферном электроде при постоянном потенциале -250 мВ в течение 5 минут. Далее ДНК-пероксидазный сенсор инкубировали в смеси, состоящей из 0.4 мМ ЭДТА, 0.1 М FeS04, 2.0 М NaOH и 0.1 мМ Н202 в течение 5 мин. После этого ДНК
Электрохимическое поведение метиленового синего и метиленового зеленого на стеклоуглеродном электроде
Фенотиазиновые красители метиленовый синий (МС) и метиленовый зеленый (МЗ) относятся к числу лекарственных препаратов фотосенсибшшзирующего действия. В ходе окисления они инициируют образование активных форм кислорода, разрушающих углеводных остатки олигонуклеотидов и нативной ДНК [157,158]. На стеклоуглеродном электроде МС и МЗ окисляются с образованием сопряженных пиков окисления-восстановления в области потенциалов -250 мВ... +250 мВ (рис.2.3). В отличие от окисления на золотом электроде [159], катодный пик восстановления окисленной формы МС менее выражен, чем анодный пик, возможно, в силу хемосорбции промежуточных продуктов переноса электрона. О прочной сорбции МС свидетельствует невозможность полного его удаления с электрода при промывке буферным раствором. Для этого необходима механическая полировка поверхности стеюгоуглерода между измерениями. Поскольку для биосенсоров это неприемлемо, нами была предложена электрохимическая очистка электрода, состоящая в его поляризации при + 800 мВ в течение 5 мин. При этом в силу электростатического отталкивания положительно заряженных молекул красителя происходит его полное удаление с поверхности сенсора. Качество отмывки контролировали по величине фонового тока (см. Экспериментальную часть). Инкубирование стеклоуглеродного электрода в растворе 1-100 мкМ МС приводило к закономерному увеличению пика его окисления. Анализ зависимости сигнала от времени инкубирования показал наличие на ней двух участков. При небольших временах инкубирования сигнал линейно увеличивался со временем контакта, стабилизируясь к 5 мин. Дальнейшее увеличение продолжительности инкубирования приводило к росту сигнала до 200% исходной величины, синхронно уменьшалась степень отмывки электрода, что, по-видимому, может косвенно служить доказательством частичной полимеризации МС при анодном окислении либо необратимой хемосорбции образующихся низкомолекулярных продуктов. Влияние продолжительности инкубирования на сигнал более заметно при измерениях в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии. Сигнал окисления при инкубировании в течение 1 7 мин менялся незначительно, после чего с увеличением времени контакта происходил его рост почти в три раза (рис.3.1). Это согласуется с литературными данными [157-159], описывающими вольтамперограммы, полученные при многократном циклировании потенциала в растворе МС. В результате электрополимеризации катодные и анодные пики прогрессирующие росли с увеличением числа циклов сканирования потенциала. Нами также были обнаружены эти признаки электрополимеризации МС, но только если его концентрация превышала 0.1 мМ.
Вероятно, рост пиков связан с образованием полимерных проводящих слоев, окисляющихся легче исходных соединений,, в том числе в силу отсутствия диффузионных потерь растворимых промежуточных продуктов и вследствие более глубокого превращения исходного МС. Циклические вольтамперограммы МЗ содержат два сопряженных редокс-пика. Первый анодный пик при -50 мВ носит необратимых характер и меняется с концентраци ей деполяризатора незначительно, тогда как второй при -250 мВ линейно возрастает с концентрацией МЗ. В отличие от МС сорбция МЗ на электроде выражена слабее и носит обратимый характер. Для удаления МЗ в промежутке между измерениями электрод отмывали в рабочем буферном растворе при разомкнутой цепи в течение 5-10 мин. Зависимость анодного тока пика і от концентрации С изученных производных фе нотиазииа, полученная на стеклоуглеродном электроде, выражается ур. (3.1, 3.2) (для шести измерений на одном стеклоуглеродном электроде, инкубирование 10 мин.). Как видно, токи окисления МЗ намного ниже токов окисления МС, что, возможно, объясняется различной степенью сорбционного накопления деполяризатора на электроде. Кроме того, проявляется расщепление анодного пика окисления МЗ на вольтамперограм-мах, затрудняющее совокупную оценку параметров окисления. Для создания пероксидазных сенсоров стеклоуглеродный электрод покрывали белковой пленкой, формируемой из желатина и пероксидазы из хрена в процессе кросс-сшивки глутаровьш альдегидом. Состав поверхностного слоя и параметры иммобилизации были определены ранее в связи с изготовлением ДНК-пероксидазного сенсора для определения антител к ДНК [27]. Пероксидазный сенсор показывал воспроизводимый сигнал при добавлении субстратов фермента (гидрохинон и пероксид водорода) в течение, по крайней мере, двух недель после изготовления при хранении между измерениями при 4С. Сначала нами были изучено электрохимическое поведение МС и МЗ на пероксидазном сенсоре в отсутствие пероксида водорода. В этом случае фермент не функционирует, играя роль пассивного диффузионного барьера переноса деполяризатора. По сравне нию с чистым стеклоуглеродным электродом наличие белковой пленки на поверхности сенсора несколько сглаживало вольтамперограммы фенотиазиновых красителей при сохранении их общей морфологии. Диффузионное торможение переноса деполяризатора проявлялось также в уменьшении абсолютных значений токов окисления на 20-30%. Несмотря на некоторое подавление неспецифической сорбции МС, его полное удаление с поверхности сенсора после измерения достигалось также при анодной поляризации электрода, В присутствии 0.1-10 мМ пероксида водорода наблюдалось выраженное увеличение катодного пика восстановления окисленных форм МС и МЗ, что свидетельствует об их участии в ферментативной реакции. На катодной ветви вольтамперограммы окисленная форма деполяризатора восстанавливается с образованием лейко-формы, которая снова окисляется в биохимическом процессе. Таким образом, на электроде реализуется своеобразный субстратный цикл, в котором электрохимическая реакция обеспечивает регенерацию активной формы субстрата (3.3). В результате токи восстановления, регистрируемые на пероксидазном сенсоре в присутствии пероксида водорода, на 60-120% выше токов окисления, регистрируемых на том же электроде в его отсутствие.
Характеристики сигнала пероксидазного сенсора зависят от концентрации пероксида водорода. Наиболее стабильный сигнал получен при его концентрации 1.0 мМ. Среднее значение тока восстановления 1 мкМ МС составило 1.8 мкА при относительной погрешности 4.2% для шести измерений из одного раствора. Повышение концентрации пероксида водорода увеличивает погрешность до б % (5.0 мМ Н2О2), дальнейшее увеличение приводит к некоторому снижению токов, возможно, в силу неферментативного окисления субстрата или частичного разложения самого пероксида водорода. Фосфатный буферный раствор в диапазоне его концентраций 0.001-0.1 М на сигнал пероксидазного сенсора не влияет. По сравнению с немодифицированным электродом время сигнала пероксидазного сенсора на МС увеличилось с 3-5 до 10-15 мин. Сорбционное накопление субстрата выражено слабее. С увеличением продолжительности инкубирования прирост тока составил только 15-20% исходной величины. Влияние рН на активность иммобилизованной пероксидазы показано на рис.3.2. Максимальный сигнал получен при рН 6.9-7,0. Иммобилизация пероксидазы несколько повьппает рН-максимум ферментативной реакции: для нативного фермента он составляет 5.5-6.5 (субстрат гидрохинон 1.0 мМ и Н2О2 2.0 мМ).
Определение других лекарственных препаратов
Помимо сульфаниламидов, нами были изучены и другие лекарственные препараты, способные взаимодействовать с ДНК по различному механизму. Антрациклиновые антибиотики (рубомицин и доксорубицин) ингибируют синтез ДНК и РНК, встраиваясь между парами азотистых оснований, что приводит к нарушению вторичной спирализации ДНК, и подавляя активность топоизомеразы II [168]. Как было показано в литературном обзоре, при взаимодействии с короткоцепочеч-ными олигонуклеотидами наблюдалось закономерное снижение сигнала окисления антрациклинов в результате снижения их доступности в составе комплекса с ДНК [43,80]. При длительном контаїсте с ДНК, сорбированной на электродах, антибиотики способствовали частичному окислению гуаниновых оснований, что проявлялось в появлении пиков 8-оксигуанидина, маркера окислительного стресса клетки. Поскольку анодное окисление антрациклинов протекает необратимо с большим перенапряжением, метод оценки состава и повреждения двунитевых нуклеотидов с их помощью нельзя признать очень удачным с электрохимической точки зрения. В качестве модельных антрациклинов нами были выбраны два наиболее изученных -рубомицин и доксорубицин. Предварительно было рассмотрено их влияние на иммобилизованную пероксидазу. Как оказалось, в интервале концентраций 0.1-10 мкМ антрацик-лины не меняют активности фермента и скорости пероксидазного окисления гидрохинона. В случае ДНК-пероксидазного сенсора при использовании в качестве маркера МС оба препарата повышали сигнал биосенсора, если продолжительность контакта не превышала 20 мин. (рис.4.10), Влияние антрациклинов закономерно возрастало при уменьшении концентрации маркера. Максимальное значение отклика было получено при продолжительности инкубирования 10 мин. Если увеличить время инкубирования до 60 минут, сигнал снижался, что можно отнести к частичной десорбции маркера с поверхности электрода. Максимальное снижение сигнала составило 40% для МС и 45% для МЗ и не отличалось для обоих препаратов.
В области микромолярных концентраций изменение сигнала ДНК-пероксидазного сенсора линейно зависело от концентрации антрацшслина (4.1,4.2. постояннотоковаяволътамперометрия). Диапазоны определяемых концентраций составили 0.5-5 мкМ для рубомицина и 0.6-25 мкМ для доксорубицина. Полученные данные хорошо соответствуют литературным данным: в соответствии с ними рабочие концентрации адриамицина (доксорубицина) и дауномицина (рубомицина), используемые в гибридизационньгх сенсорах и при изучении электрохимических свойств интеркаляторов, составляют nxlO" М [43,80-82]. Следует отметить, что при определении антрациклиновых препаратов нами использовались достаточно большие концентрации маркеров (60 мкМ), заведомо искшо чающие возможное мешающее влияние сульфаниламидов. То, что даже при таких высоких концентрациях сигналы доксорубицина и рубомицииа достаточно велики, объясняется тем, что превалирующим процессом, объясняющим изменение сигнала биосенсора, является вытеснение интеркалированной формы маркера.
Поскольку количество ДНК в составе поверхностного слоя во всех биосенсорах было одинаковым, абсолютное значение изменения сигнала ДІ, мкА, должно определяться исключительно количеством высвобождающегося маркера и не зависеть от концентрации маркера в объеме раствора. Тот факт, что МЗ обеспечивает меньшую чувствительность определения антрациклиновых интерка-ляторов, связан с его меньшей эффективностью в реакции с ДНК. Как отмечалось выше, по-видимому, МЗ преимущественно взаимодействует с ДНК электростатически, и его отклик на присутствие других интеркаляторов носит неспецифический характер. В качестве другого модельного препарата был выбран цефтазидим, антибиотик цефалоспоринового ряда III поколения. Цефалоспорины относятся к р-лактамам и представляют один из наиболее обширных классов антимикробных препаратов. Благодаря высокой эффективности и низкой токсичности, цефалоспорины занимают одно из первых мест по частоте клинического использования среди всех антимикробных средств. Цефтазидим в лекарственных формах и биологических дикостях определяют методами ВЭЖХ, в том числе с электрохимическим детектированием сигнала [169,170]. Также предложены иммуноферментные методы определения препарата в воде и воздухе рабочей зоны [171]. Цефтазидим в наномолярном диапазоне концентраций оказывает ингибирующее действие на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора (рис.4.11). В его присутствии наблюдалось резкое снижение тока восстановления метиленового синего. Напротив, в микромолярных концентрациях тот же препарат активирует сигнал, увеличивая его. Такое разнонаправленное изменение сигнала может быть связано, в первую очередь, с различным характером процессов, протекающих на электроде.
В молекуле цефтазидима есть центры связывания, аналогичные сульфаниламидным группам сульфаметоксазола и родственных В то же время, в силу значительного объема молекулы можно ожидать проявления стерических эффектов, способных влиять как на электростатические взаимодействия с участием цефтазидима и маркеров, так и на индикаторную пероксидазную реакцию. Вероятно, в малых количествах цефтазидим занимает свободные центры поверхности электрода, не конкурируя с МС за центры связывания ДНК. Этот процесс стерически тормозит электродную реакцию восстановления окисленной формы маркера, что приводит к снижению регистрируемого сигнала сенсора. Косвенно в пользу данного механизма свидетельствуют обратимость действия препарата и отсутствие зависимости наблюдаемого уменьшения сигнала в присутствии цефтазидима от концентрации МС в растворе. Этим поведение цефтазидима отличается от сульфаниламидных препаратов, для которых умеїіьшение концентрации МС приводило к повьплению их влияния на сигнал биосенсора. При более высоких концентрациях цефтазидима (0.5-10 мкМ) он начинает вытеснять МС с поверхности спирали ДНК. Поскольку этот процесс протекает непосредственно в поверхностном слое, влияние собственного объема молекул на их пассивный перенос к электроду проявляется меньше. В результате увеличение сигнала биосенсора в данном ин
