Содержание к диссертации
Введение
1. Функционирование днк и ее эффекторов в организме и электрохимические методы их определения, в том числе с использованием ДНК-биосенсоров (литературный обзор) 14
1.1. Роль ДНК в организме человека. Взаимодействие ДНК с ионами металлов и их комплексами 14
1.2 Биологическая роль кобальта и меди в организме человека и их действие на ДНК 21
1.3. Взаимодействие ДНК с антибиотиками и алкалоидами, обладающими противоопухолевой активностью 26
1.3.1. Методы для изучения взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и для их определения 33
1.4. Биохимический процесс гибридизации ДНК и его использование в аналитических целях
1.5. Электрохимические методы определения эффекторов ДНК на основе ДНК-биосенсоров 37
1.5.1. Иммобилизация ДНК и ее фрагментов 41
1.5.2. Электрохимические методы определения металлов, в том числе, на основе ДНК-сенсоров 44
1.5.3. Электрохимические методы определения антибиотиков и алкалоидов, в том числе, на основе ДНК-сенсоров 50
1.5.4. Электрохимические методы изучения процесса 54 гибридизации на основе ДНК-сенсоров (геносенсоров)
2. Постановка задачи, аппаратура, объекты исследования и условия проведения эксперимента
2.1. Постановка задачи 57
2.2. Аппаратура, объекты исследования 58
2.3. Приготовление биочувствительной части амперометрических ДНК-сенсоров 59
2.3.1. Методика иммобилизации д-ДНК 59
2.3.2. Методика иммобилизации р-ДНК 60
2.4. Обработка спектрофотометрических данных комплексообразования тяжелых металлов с д-ИДНК 60
2.5. Методика построения изотерм адсорбции ионов тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора 61
2.6. Методика определения констант аффинного связывания комплексов М(Н) - д-ИДНК и фармпрепарат - р-ИДНК и 62 эффективных констант устойчивости комплексов фармпрепарат - р-ИДНК
3. Взаимодействие тяжелых металлов с ДНК: комплексообразование с иммобилизованной 63 формой днк и биоаффинная сорбция на ДНК-содержащей мембране биосенсора. определение тяжелых металлов с помощью днк-сенсора на основе СРПЭ
3.1. Комплексообразование ионов тяжелых металлов с денатурированной иммобилизованной ДНК на примере 63 ионов Со(П)
3.2. Биоаффинная сорбция тяжелых металлов на д-ИДНК-содержащей мембране 69
3.3. Определение константы аффинного связывания 74 комплекса Со(П) - д-ИДНК
3.4. Разработка способа определения ионов Со(Н) и ионов Со(И) и Cu(II) при совместном присутствии с помощью амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК 78
3.4.1. Выбор оптимальных условий определения тяжелых металлов с помощью амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК 83
3.4.2. Методика определения ионов тяжелых металлов в модельных растворах с помощью амперометрического ДНК-сенсора 86
4. Взаимодействие противоопухолевого антибиотика адрибластина с иммобилизованной ДНК в составе амперометрического ДНК- сенсора на основе српэ и его определение 90
4.1. Выбор формы ДНК для иммобилизации в составе амперометрического ДНК-сенсора и изучение комплексообразования противоопухолевых препаратов с иммобилизованной ДНК 92
4.2. Электрохимическое и спектрофотометрическое изучение комплексообразования адрибластина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК) 93
4.3. Определение константы аффинного связывания комплекса адрибластин - р-ИДНК 97
4.4. Разработка способа определения противоопухолевых препаратов с помощью амперометрического биосенсора на основе р-ИДНК 98
4.4.1. Выбор оптимальных условий определения фармпрепаратов с помощью амперометрического биосенсора на основе р-ИДНК 98
4.4.2. Методика определения адрибластина и онковина в модельных растворах с помощью амперометрического ДНК-сенсора 100
5. Взаимодействие природного алкалоида онковина, обладающего противоопухолевой активностью, с иммобилизованной ДНК в составе амперометрического днк-сенсора на основе СРПЭ и его определение
5.1. Электрохимическое изучение комплексообразования онковина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК) 104
5.2. Определение константы аффинного связывания комплекса онковин - р-ИДНК 108
5.3. Разработка способа определения онковина с помощью амперометрического БС на основе р-ИДНК 109
5.3.1. Выбор оптимальных условий определения онковина с помощью амперометрического ДНК-сенсора 110
5.3.2. Методика определения онковина с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе СРПЭ 112
6. Применение амперометрических ДНК-сенсоров в анализе реальных объектов
6.1. Применение амперометрического ДНК-сенсора в анализе природных вод и биологических объектов на содержание ионов Со(П) и Cu(II) 115
6.2. Применение амперометрического ДНК-сенсора в анализе сыворотки крови на содержание адрибластина и онковина 120
Выводы 124
Список литературы 126
- Методы для изучения взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и для их определения
- Методика построения изотерм адсорбции ионов тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора
- Разработка способа определения ионов Со(Н) и ионов Со(И) и Cu(II) при совместном присутствии с помощью амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК
- Электрохимическое и спектрофотометрическое изучение комплексообразования адрибластина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК)
Введение к работе
Актуальность темы. Определение и изучение взаимодействия эффекторов ДНК различной природы является актуальной проблемой современной аналитической химии. К таким эффекторам относятся, в частности, тяжелые металлы и противоопухолевые препараты. Эти эффекторы имеют высокое сродство к молекулам ДНК организма, поэтому их определение с помощью ДНК как аналитического реагента и ДНК-содержащих аналитических систем очень перспективно и актуально.
Известно, что тяжелые металлы, попадая в организм из среды промышленных предприятий и природных вод, вызывают повреждения в цепи ДНК, что говорит о потенциальной мутагенности и генотоксичности даже таких металлов, которые до недавнего времени считались относительно безопасными, например меди и кобальта. С одной стороны, эти металлы являются необходимыми (эссенциальными) для организма, так как они, наряду с железом, принимают участие в образовании гема и их недостаток приводит к развитию злокачественных анемий. С другой стороны, содержание данных тяжелых металлов в биосфере должно строго контролироваться, согласно решению Целевой группы по выбросам Европейской экономической комиссии ООН и данные металлы признаны генотоксичными Межународным агентством по исследованию раковых заболеваний, поскольку возможна интоксикация организма данными тяжелыми металлами при массовых выбросах на производстве, а также при нарушениях в биохимических процессах организма, приводящих к денатурации ДНК клеток. В этом плане особенно актуальна проблема исследования малоизученной системы эффектор-денатурированная односпиральная ДНК (д-ДНК), которая максимально адекватно моделирует процессы, происходящие в организме под действием денатурирующих агентов. Результаты таких исследований могли бы помочь в предсказании механизма такого воздействия и в выборе детоксикантов.
Эффекторами ДНК являются также цитостатики противоопухолевые препараты, которые прочно связываются с ее цепями и подавляют синтез ДНК раковых клеток. Однако с целью снижения возможных побочных эффектов и подбора правильной индивидуальной дозировки препаратов, выяснения их фармакокинетики является актуальным определение фармпрепаратов в многокомпонентных биологических жидкостях, в том числе в сыворотке крови человека.
В эколого-аналитическом мониторинге тяжелых металлов и в анализе противоопухолевых препаратов применяется ряд стандартных методов для определения данных эффекторов в объектах окружающей среды и в биологических жидкостях (кровь, сыворотка, моча) - это методы масс-спектрометрии, атомно-абсорбционной спектрометрии, спектрофотометрии и др. Однако применение их на практике имеет ряд недостатков, например дорогостоящее оборудование, длительность проведения анализа и пробоподготовки и др.
В случае мониторинга противоопухолевых препаратов в условиях отечественных клинических лабораторий регулярного контроля за содержанием данных фармпрепаратов в сыворотке крови пациентов не проводится.
Электрохимические биосенсоры на основе ДНК позволяют изучать взаимодействие эффекторов с ДНК и определять их достаточно быстро, без дорогостоящего оборудования, без длительной пробоподготовки, достаточно специфично и селективно, на уровне малых концентраций.
Таким образом, актуальна разработка биоаффинных методов определения различных эффекторов ДНК на основе амперометрических ДНК-сенсоров.
Цель исследования. Разработка и оптимизация биоаффинных способов определения эффекторов ДНК различной природы - тяжелых металлов на примере ионов кобальта (II), в том числе при совместном присутствии на примере ионов кобальта (II) и меди (II), а также противоопухолевых препаратов - антибиотика адрибластина и алкалоида онковина амперометрическими ДНК-сенсорами на основе стационарных электродов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• получить количественные характеристики процесса комплексообразования эффекторов с различными формами иммобилизованной ДНК с целью оптимизации биоаффинных методов их определения;
• выяснить роль специфической адсорбции тяжелых металлов в процессе их мембранного концентрирования на БС и определение аффинной константы связывания ионов кобальта (II) с иммобилизованной на мембране д-ДЫК (д-ИДНК);
• на основании полученных данных разработать биоаффинный способ определения кобальта(П) в присутствии матричных компонентов в модельных растворах и реальных образцах природной воды и сыворотки крови с помощью д-ИДНК-содержащего БС;
• разработать биоаффинный способ определения антибиотика антрациклиновой группы на примере адрибластина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ в модельных растворах и в образцах сыворотки крови;
• разработать биоаффинный способ определения алкалоида индолового ряда на примере онковина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ в модельных растворах и в образцах сыворотки крови.
Научная новизна полученных в диссертации результатов заключается в том, что
• получены количественные характеристики комплексообразования денатурированной иммобилизованной ДНК с ионами тяжелых металлов и эффективные константы устойчивости и доли комплексных форм для ионов кобальта (II) и константы аффинного связывания ионов кобальта (II) для целенаправленной разработки способа определения тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе стационарного ртутно-пленочного электрода (СРПЭ);
• рассчитана максимальная сорбционная емкость биочувствительной части ДНК-сенсора и установлена возможность определения кобальта (II) и меди (II) при совместном присутствии на основании изотерм биоаффинной сорбции ионов металлов на ДНК-модифицированной мембране;
• получены количественные характеристики комплексообразования молекул цитостатиков - интеркаляторов, с иммобилизованной ренатурированной ДНК, подтверждающие целесообразность использования выбранной формы ДНК при иммобилизации в составе ДНК-сенсора на основе СРПЭ;
• предложен биоаффинный способ селективного определения тяжелых металлов на примере ионов кобальта (II) и меди (II) с помощью д-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ;
• разработан биоаффинный способ определения противоопухолевого антибиотика антрациклиновой группы адрибластина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ;
• разработан биоаффинный способ определения природного алкалоида онковина, обладающего противоопухолевой активностью, с помощью р-ИДНК-содержащего БС;
• установлены оптимальные условия использования разработанных способов определения тяжелых металлов и фармпрепаратов в сыворотке крови при диагностике заболеваний, а также тяжелых металлов в природных объектах при экологическом мониторинге.
Практическая значимость. На основе полученных ДНК-сенсоров разработаны биоаффинные способы определения тяжелых металлов и фармпрепаратов. Использование этих способов позволяет определять токсиканты на уровне ПДК и меньших концентраций и судить об их потенциальной мутагенной и канцерогенной активности. Анализ образцов на содержание фармпрепаратов необходим при контроле их качества в процессе фармпроизводства и в сыворотке крови пациентов в процессе терапевтического мониторинга.
Разработанные методики анализа просты, относительно дешевы, требуют очень малый объем образцов. Правильность разработанных методик установлена сравнением со стандартными независимыми методами. Методики определения апробированы при анализе реальных образцов. Представляет интерес использовать данные ДНК-сенсоры в анализе образцов природной воды и биологических жидкостей в условиях медицинских лабораторий и лабораторий эколого-аналитического контроля. На защиту автор выносит:
• обоснование выбора формы молекул ДНК для иммобилизации в составе биосенсора на основании исследования комплексообразования кобальта (II) и противоопухолевых препаратов с различными формами ДНК;
• результаты изучения специфической адсорбции ионов Со(П) на ДНК-содержащей мембране в составе биосенсора, а также при совместной адсорбции ионов Со(П) и Cu(II;
• способ определения кобальта (II) и меди (II) с помощью амперометрического биосенсора на основе выбранной формы иммобилизованной денатурированной ДНК и СРПЭ;
• биоаффинные способы определения противоопухолевых препаратов - интеркаляторов различной природы (антибиотиков и алкалоидов) с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ренатурированной ДНК и СРПЭ;
• выбор оптимальных параметров работы ДНК-сенсоров: времени концентрирования, времени реактивации, рН, условий реактивации; • аналитические и метрологические характеристики методик анализа различных объектов на содержание тяжелых металлов и фармпрепаратов. Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и изложены в материалах: Международной конференции «Ломоносов-2000» (Москва, 2000), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Итоговой научной студенческой конференции КГУ (Казань, 2000), Всероссийской конференции «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2001), Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), Всероссийской конференции «Экоаналитика-2006» (Самара, 2006), Международного конгресса по аналитической химии ICAS-2006 (Москва, 2006). Публикации. По тематике диссертационной работы опубликовано 11 работ. Из них 4 статьи в научных журналах и 7 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.
Настоящая работа является частью исследований проводимых на кафедре неорганической химии Казанского государственного университета в рамках темы Министерства образования и науки РФ «Координационные соединения Зё-переходных, платиновых и редкоземельных металлов, термодинамика и кинетика образования в различных средах, синтез строение, свойства, направления практического использования» (per. № 01.960002010). Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах, содержит 18 таблиц, 27 рисунков и библиографию, включающую 166 ссылок. Диссертационная работа состоит из введения и шести глав: обзора литературы, экспериментальной части, четырех глав результатов и их обсуждения, а также выводов и списка используемой литературы.
В первой главе представлен обзор литературных данных по функционированию ДНК и ее эффекторов в организме и электрохимическим методам их определения. Основное внимание уделено использованию электрохимических ДНК-сенсоров.
Во второй главе описаны объекты и методы исследования, аппаратура. Приведены методики иммобилизации различных форм ДНК, а также методики построения изотерм биоаффинной сорбции тяжелых металлов и получения констант устойчивости и аффинного связывания тяжелых металлов и фармпрепаратов с различными формами иммобилизованной ДНК.
В третьей главе изложены результаты изучения взаимодействия тяжелых металлов с ДНК и их определения с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе д-ИДНК.
В четвертой главе отражено изучение взаимодействия с ДНК противоопухолевого антибиотика антрациклиновой группы на примере адрибластина, оказывающего цитостатическое действие за счет интеркаляции; приведены результаты его определения с помощью р-ИДНК-сенсора.
Глава 5 посвящена разработке биоаффинного метода определения с помощью р-ИДНК-сенсора природного алкалоида индолового ряда на примере онковина, также являющегося интеркалятором; представлены результаты изучения процесса его комплексообразования с р-ИДНК.
Глава 6 посвящена аналитическому применению разработанных амперометрических ДНК-сенсоров на основе стационарных электродов в анализе объектов окружающей среды и сыворотки крови человека.
Автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой неорганической химии Казанского университета Н.А. Улаховичу за постоянную поддержку, полезные советы и замечания, высказанные в процессе обсуждения работы, профессору кафедры неорганической химии Казанского университета Ю.И. Сальникову за проведение расчетов методом математического моделирования и помощь в обсуждении полученных результатов.
Методы для изучения взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и для их определения
В приведенном выше ряду ион Си обладает наибольшим сродством к основаниям ДНК, и механизм его взаимодействия в некоторой мере может послужить моделью в остальных случаях [8, 11, 12, 18]. Наиболее предпочтительными вариантами связывания для этого иона являются следующие: комплексообразование с отрицательно заряженными атомами кислорода фосфатных групп, внешний хелат между N(7) атомом азота пуринового основания и кислородом фосфатной группы, а также внутренний хелат между N(1) и N(7) атомами азота или N(7) атомом азота и 0(6) атомом кислорода пуриновых оснований [3, 13, 16-24]. Перечисленные выше типы комплексов наиболее активно образуются при низкой ионной силе и малых степенях заполнения молекулы ДНК ионами меди, приводя к стабилизации двойной спирали [18, 24, 25]. Для ионов марганца также характерны эти типы комплексов [5, 6, 7, 26, 27]. При более высоких степенях заполнения (более 0,3) ионы меди образуют хелатный комплекс с атомами N(7) и 0(6) гуанина [18, 25]. Это связывание специфично к ГЦ-парам и приводит к дестабилизации вторичной структуры ДНК из-за ослабления водородных связей внутри комплементарной пары. N(1) атом азота пуриновых оснований также может быть центром координации ионов меди [28]. В денатурированной ДНК катионы меди способны к координации с каждым из оснований, исключая тимин [29, 30]. Дестабилизирующее действие ионов меди обусловлено главным образом более сильным взаимодействием с азотистыми основаниями, нежели с фосфатными группами денатурированной ДНК [3, 17, 23, 25]. При низких концентрациях ионов меди преобладает взаимодействие с фосфатами, приводящее к повышению термостабилыюсти ДНК [3].
По действию на ДНК ионы Ag+, Hg2+, Fe2+, Pb2+, Zn2+ близки к ионам меди [5, 6, 14, 15, 19, 23, 27, 30]. И для этого ряда ионов также характерны особенности взаимодействия и модели комплексов, предложенные для связывания Си2+ с ДНК. Ионы РЬ2+ имеют сильное сродство как к фосфатным группам ДНК так и к азотистым основаниям, особенно к цитозину [31].
Согласно многочисленным экспериментальным данным, полученным как для кристаллов, так и для водных и неполярных растворителей (ДМСО) при нейтральном рН одними из основных центров связывания ионов Cd2+, Zn2+, Со2+ , Ni2\ являются N(7) атом азота гуанина, N(3) атом цитозина, дополняемый в некоторых случаях атомом кислорода фосфатной группы, а также эти ионы способны образовывать хелат между N(3) и 0(2) атомами цитозина [27-29, 32-37], в то время как взаимодействие этих ионов с N(7) атомами аденина очень слабо [29, 37].
Для интерпретации экспериментальных данных о взаимодействии ионов металлов с нативной и денатурированной ДНК с использованием современных теоретических представлений необходима информация о константах, характеризующих связывание ионов с различными функциональными группами нуклеиновой кислоты. Многие ионы переходных металлов обладают довольно высокими значениями констант связывания (Ксвяз) с ДНК (10-10 л/моль) по сравнению с ионами щелочноземельных металлов [7, 38, 39]. При концентрации свободных ионов металлов 10"5 моль/л вследствие высоких значений KCWIJ ионов металлов с ДНК достигается почти полное заполнение мест связывания на полимере [5, 40].
Ксвяз ионов металлов с ДНК в значительной степени зависят от концентрации ионов натрия в растворе, а следовательно от ионной силы раствора [13, 39, 40], а также от степени заполнения мест связывания [7, 38,41]. Исследования, выполненные различными методами, свидетельствуют об активном связывании ионов переходных металлов с фосфатами и азотистыми основаниями ДНК.
Ионы переходных металлов в значительной степени влияют на макромолекулярные и термодинамические параметры ДНК. Взаимодействие с ионами металлов изменяет конформацию нуклеиновых кислот на различных уровнях организации макромолекул [1, 5]. При описании взаимодействия ДНК с ионами металлов можно выделить различные проявления этого взаимодействия, соответствующие определенным уровням структурной организации макромолекул ДНК:
Локальные эффекты взаимодействия ионов металлов с молекулой ДНК, заключающиеся в образовании области избыточной концентрации положительно заряженных ионов вблизи ДНК, а также в образовании комплексов ДНК-ион. На этом уровне описания особенно заметны отличия между механизмами взаимодействия ионов одно- и двухвалентных металлов с ДНК [42]. 2. Конформационные эффекты, возникающие за счет ослабления электростатических взаимодействий между различными частями молекулы ДНК в присутствии противоионов. Эти эффекты проявляются прежде всего в виде изменения размеров цепей ДНК, объемных взаимодействий между различными их участками или частичной денатурации, изменения изгибной жесткости [24, 43-44]. 3. Эффекты образования и изменения сверхструктур ДНК (третичной и др.), например явления суперспирализации, образование межмолекулярных комплексов [2, 42-44]. Известно, что роль некоторых тяжелых металлов неоднозначна: с одной стороны они являются жизненно необходимыми (эссеициальными), а с другой токсичными при их поступлении из окружающей среды в избыточных количествах [4].
Кобальт является биологически активным незаменимым микроэлементом, всегда содержится в организме человека, входя в состав водорастворимого витамина В]2 (цианкобаламина) и кофермеита В12. Кроме того, этот металл участвует в белковом и углеводном обмене, участвует в ферментативных процессах, активируя ферменты пептидазы (расщепляют белки на аминокислоты) и фосфатазы (гидролизуют фосфорные эфиры углеводов и белков). В частности ионы Со(П) активируют фермент костную фосфатазу, способствуя отложению нерастворимых фосфатов в костной ткани. Известно, что данный металл угнетает обмен йода и способствует выделению воды почками. Кобальт повышает усвоение железа и синтез гемоглобина, является мощным стимулятором эритропоэза [45, 46]. Процесс кроветворения у человека может осуществляться только при нормальном взаимодействии трех биоэлементов - кобальта, меди и железа. Известно, что ионы кобальта активируют фермент гемокиназу, разлагающий гем (сходным действием обладают также ионы кадмия и свинца). Потеря организмом животного гема приводит к дефициту гемоглобина и развитию анемии [4].
Методика построения изотерм адсорбции ионов тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора
В последнее время наиболее часто используемые методы для изучения взаимодействия ДНК с противоопухолевыми препаратами и для их определения включают в себя [58]: 1. Технология молекулярного отпечатка ДНК; 2. Ядерный магнитный резонанс; 3. Масс-спектрометрия; 4. Спектрофотометрия; 5. ИК и Раман-спектроскопия; 6. Метод молекулярного моделирования; 7. Равновесный диализ; 8. Электрический линейный дихроизм; 9. Капиллярный гель-электрофорез; 10. Поверхностный плазменный резонанс и др. Однако ни один из перечисленных выше методов в отдельности не способен объяснить сложный механизм взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК. Эта задача нуждается в быстром, высокоселективном и недорогом способе анализа в соответствии с растущими потребностями фармакологической промышленности, биохимии и т.д. В данном случае, электрохимический подход (в частности, вольтамперометрия) позволяет решить многие из поставленных задач в изучении взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и их определении [80]. В работе [81] разрабатывали полимерные лекарственные пленки с доксорубицином для местного лечения злокачественных новообразований слизистых оболочек. Применение таких пленок приводит к целенаправленной доставке активного вещества в очаг поражения, а также к снижению побочных эффектов цитостатиков, и как следствие, к повышению эффективности противоопухолевой терапии. Разработана технология получения лекарственных пленок с доксорубицином и установлена стабильность основных показателей их качества в процессе хранения при 4±2С, в защищенном от света месте в течение 12 месяцев (срок наблюдения). Определение доксорубицина в пленках проводили методом спектрофотометрии, время проведения анализа составило 20 минут, нижний предел определяемых концентраций - 5 мкг/мл, относительная ошибка ±3%. Результаты разработанного спектрофотометрического метода сравнивались с результатами микробиологического метода -метода диффузии в агар с тест-культурой Bacillus cereus var. mycoides 537 (споры) доксорубицина гидрохлорида для инъекций. Метод диффузии, предусмотренный нормативной документацией, является более продолжительным (18 часов), трудоемким и неспецифичным.
Представлен быстрый метод циклической вольтамперометрии для изучения взаимодействия ДНК с электроактивными лигандами (молекулы, не интеркалирующие в ДНК, Hoechst 33258 и два типа молекул-интеркаляторов - митоксантрон и актиномицин Д) [80]. Найдены константы связывания, места связывания указанных молекул с ДНК, коэффиценты диффузии, равновесные параметры для комплексов ДНК-лиганд. К примеру, Ксвяз для Hoechst 33258 составила 2,1x10 см /моль, а для митоксантрона и актиномицина Д эта величина на порядок больше - 8,9х 109 и 9,1 х 109 соответственно.
Ионы некоторых металлов значительно влияют на взаимодействие онкопрепаратов с ДНК [70,82]. Ионы Cu(II) и Mg(II) имеют различную способность к комплексообразованию с адриамицином и ДНК. В работе [70] изучали влияние этих двух металлов на константу связывания комплекса адриамицин-ДНК, а также изучали механизмы этих процессов методами абсорбционной и флюоресцентной спектроскопии. Было показано, что ион Mg(II) имеет меньшую способность к взаимодействию с противоопухолевым препаратом по сравнению с ионом Cu(II), но оба эти металла значительно увеличивают константу связывания адриамицина с ДНК. Эта способность металлов может быть использована для повышения эффективности лечения адриамицином злокачественных новообразований, для уменьшения дозировки препарата с целью уменьшения его токсичности. В [82] синтезированы и изучены кристаллические структуры комплексов 10-мерного дуплекса d(CGTACG)2 с молекулами-интеркаляторами - производными антрахинона и акридина. Установлена важная роль катионов металлов (Со(П), Ва(П) и Na(I)) в процессе кристаллизации данных комплексов. Определены места связывания молекул-интеркаляторов с фрагментом ДНК и роль ионов металлов в данном процессе. Например, установлено, что ионы Со(П) специфично связываются с N(7) атомами гуанина, а также взаимодействуют с 4 симметрично расположенными фосфатными группами d(CGTACG)2, возможно связывание с N(7) атомами гуанина двух дуплексов (мостиковая структура).
Установлено [83], что доксорубицин имеет большое сродство к ионам Fe(III), возможно и в организме образуется комплекс доксорубицин - Fe(III), который участвует в окислительном мутагенезе. Исследования проводили на клетках Salmonella, мутагенная способность указанного комплекса установлена уже при концентрации 2,5 нмоль/л.
Таким образом, становится целесообразнным изучение взаимодействия с ДНК и определения различных противоопухолевых препаратов современными методами. В частности электрохимический подход (вольтамперометрия) позволяет решить многие из поставленных перед химиком-аналитиком задач [58, 84, 85].
Разработка способа определения ионов Со(Н) и ионов Со(И) и Cu(II) при совместном присутствии с помощью амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК
Электрохимические методы анализа, в частности вольтамперометрия, все шире используются для изучения функционирования и для определения биологических молекул и различных соединений, вступающих в реакции с данными молекулами [104-110]. Современные варианты вольтамперометрии позволяют изучить электрохимическое поведение ДНК и получить дополнительную информацию об особенностях ее комплексобразования с различными эффекторами, в том числе и с ионами металлов и их комплексами. С помощью этих методов стали возможным идентификация и определение различных форм ДНК, так как они отличаются адсорбционными свойствами и способностью к электрохимическому восстановлению и окислению азотистых оснований [109-111]. Особенно перспективно использование для этих целей БС на основе ДНК [112, 113].
В работе [114] сравнивалось два метода определения хрома и кобальта в моче человека: высокочувствительная каталитическая адсорбционная инверсионная вольтамперометрия и электротермальная атомная адсорбционная спектрофотометрия. Было показано, что электрохимический метод более надежен и чувствителен для определения низких концентраций хрома и кобальта в моче человека, определение микроколичеств которых невозможно указанным методом сравнения. Предел обнаружения для Со(П) составил 0,13 мг/л, для Сг (Ill) - 0,18 мг/л для метода спектрофотометрии; в методе вольтамперометрии предел обнаружения составил для Со(П) - 0,002 мг/л, для Сг(Ш) - 0,007 мг/л.
Циклическая вольтамперометрия на золотом электроде показала, что на вольтамперограммах комплекса Со(ЬЫ)2С12 {бис(Ы-бензил-бензотриазол)дихлор Со(П)} наблюдается два пика восстановления и один пик окисления. Эти пики значительно уменьшаются в присутствии ДНК, в отличие от холостого опыта, что свидетельствует о взаимодействии Co(bbt)2Cl2 с ДНК. Комплексообразование с ДНК происходит не только электростатически, но и путем интеркаляции в двойную спираль ДНК [115].
Синтезированы и исследованы комплексы ионов Си(Н) и Со(П) с антибактериальными препаратами - ципрофлоксацином и эноксацином в [116]. Установлена методом кристаллографии кристаллическая структура данных комплексов, их координационные числа. Определена способность комплекса Cu(II) с ципрофлоксацином к разрыву цепей ДНК. Указанный комплекс действует так же как соответствующие химические нуклеазы с активацией пероксидом водорода. Образующиеся под действием данного комплекса гидроксильные радикалы способны к расщеплению ДНК.
Целью работы [117] являлось определение содержания кобальта в фармацевтической продукции: витамине В)2 (порошок), витамине В!2 (ампулы), витаминах - Центрум, Спектрум ABC и Оптима Форте. Определение проводилось методами спектрофотометрии и адсорбционной вольтамперометрии, полученные данные сравнивались с данными стандартных методов, при этом расхождения между результатами сравниваемых методов не значимы. Нижний предел определения кобальта в фармпрепаратах составил 0,1 мг/л. Предложенные методы могут быть использованы в массовом анализе данных объектов, поскольку они экспрессные, чувствительные и селективные, требуют небольшое количество пробы, а также имеется возможность для их автоматизации. В работе [118] выяснили, что ион гексааминокобальт (111) способствует конформационным переходам В- в Z-ДНК и В- в А-ДНК формы, зависящих от нуклеотидной последовательности макромолекулы. Найдено по данным ЯМР и КД специфическое взаимодействие между аминами кобальта (III) и ДНК в А- и Z-конформациях.
Проведено определение тяжелых металлов в моче 63-х рабочих металлургического комбината для установления уровня токсичности этих элементов и предотвращения профзаболеваний [119]. Авторы использовали дифференциальную импульсную инверсионную вольтамперометрию для одновременного определения кадмия, кобальта, свинца и никеля в моче рабочих. Результаты исследования указывали на необходимость немедленного улучшения вентиляции рабочей зоны и гигиены предприятия.
В работе [120] рассматривалось взаимодействие двух новых синтезированных комплексов переходных металлов ML2 (М = Со(П), Cu(II), L = 1,8-дигидроксиэтил-1,3,8,10,13-гекса-азациклотетрадекан) с ДНК тимуса теленка. Это взаимодействие изучалось методами циклической вольтамперометрии и дифференциальной импульсной вольтамперометрии. Добавление ДНК в растворы CoL и CuL приводило к уменьшению величины пиков соответствующих комплексов пропорционально добавленной концентрации ДНК.
Проведен анализ на содержание никеля и кобальта на уровне мг/кг в рафинированном сахаре методом адсорбционной катодной инверсионной вольтамперометрии [121]. Измерения проводили в растворах необработанного сахара без предварительной пробоподготовки. Нижний предел определяемых концентраций составил для никеля - 50 мг/кг, для кобальта - 10 мг/кг, что значительно ниже уровня ПДК этих элементов.
Целью работы [122] являлась разработка точного и доступного метода определения кобальта в сыворотке крови человека. С тех пор как кобальт и его соединения признаны потенциальными канцерогенами МАИРЗ (часть ВОЗ), требуется расширить арсенал методов для определения данного металла в биообъектах. Исследование посвящено определению кобальта в сыворотке крови здоровых людей и пациентов, использующих имплантанты на основе сплавов кобальта, для систематизации данных по распределению металла в человеческом организме. Был использован метод адсорбционной инверсионной вольтамперометрии, который позволяет снизить предел обнаружения и повысить чувствительность, необходимые для проведения измерений в биосредах организма. Оптимизация проводимой в работе пробоподготовки и методики измерений позволила снизить предел определяемых концентраций кобальта в сыворотке до 0,03 г/л. При этом содержание кобальта в сыворотке здоровых людей составило 0,11±0,06 г/л, а для пациентов - 0,34±0,07 г/л.
Электрохимическое и спектрофотометрическое изучение комплексообразования адрибластина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК)
Исследованы с помощью электрохимического ДНК-БС пентамидиновые аналоги, как потенциальные химиотерапевтические препараты для лечения инфекционных и раковых заболеваний [144]. В данной работе ДНК-БС использован для скрининга и быстрого определения ряда веществ, селективно связывающихся с ДИК, иммобилизованной на поверхности печатного электрода, с помощью метода квадратно-волновой вольтамперометрии. Аналитическим сигналом при этом служил пик окисления аденина, либо гуанина ДНК; при действии на нее пентамидина - !,5-бис(амидинофенокси)пентана данные сигналы изменялись.
Таким образом, из литературы следует, что в настоящее время БС на основе ДНК широко применяются в аналитической химии для изучения взаимодействия и определения широкого круга веществ в различных объектах.
Биохимические процессы с участием ДНК играют важную роль в организме человека, в связи с этим последние исследования направлены на изучение комплементарной последовательности цепей ДНК, с целью изучения ее структуры и повреждений (точечные мутации, разрывы в цепи), вызванных различными факторами. Является актуальным изучение процесса гибридизации с помощью электрохимических ДНК-сенсоров (геносенсоров), так как такие устройства наиболее подходят для поставленных целей - они миниатюрны, экспрессны, дешевы. Поскольку данное направление развивается очень интенсивно, то результатам исследований посвящен ряд статей и обзоров [86-88, 145-146].
В работе [86] проводили определение вирусов гепатита Б и гепатита С, а также вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) с помощью разработанного геносенсора. При определении вируса гепатита Б фрагмент однонитевой ДНК (181 пара оснований - получены методом полимеразной цепной реакции) ковалентно иммобилизовали на поверхности золотого электрода. О прохождении гибридизации судили по сигналу метки - осмия бипиридила. При этом образование гибрида на поверхности электрода сопровождалось увеличением тока пика метки по сравнению с чистым электродом или с электродом, модифицированным пробой. В данной работе также определяли некоторые типы «ошибок» в одном азотистом основании в 20-мерном гибриде на золотом электроде с использованием в качестве метки интеркалятора -ферроценилнафталендиимида.
В работе [87] разработан ДНК-сенсор для определения гибридизации и повреждений в структуре ДНК. Данный геносенсор состоит из модифицированного золотого электрода с пробой ковалентно иммобилизованной на его поверхности с использованием бифункционального реагента - глутарового альдегида. Определение гибридизации, либо повреждений в структуре ДНК проводили с помощью авидин-щелочной фосфатазы в качестве метки (методы циклической вольтамперометрии, дифференциально-импульсной вольтамперометрии). Сообщается об увеличении чувствительности определения (10 нг/мл), о сокращении времени проведения анализа (около 4 часов), а также о возможности проведения анализа в многокомпонентных образцах.
Разработан также электрохимический геносенсор [88] для определения последовательности ДНК вируса гепатита Б и ТТ вируса в реальных образцах. БС состоит из иммобилизованных 21- или 24-мерных однонитевых олигонуклеотидов (пробы), сходных с последовательностями оснований ДНК вируса гепатита Б и ТТ вируса, и гибридизации этих олигонуклеотидов с комплементарными им последовательностями оснований (мишенью) на угольно-пастовом электроде. Степень гибридизации между пробой и мишенью определяли методом квадратно-волновой вольтамперометрии, выбрав в качестве индикатора этого процесса сигнал метиленового синего. Методом сравнения служил метод гель-электрофореза. Предложенный электрохимический геносенсор позволяет определять точечные мутации, в дальнейшем предполагается его использование для быстрой и недорогой диагностики генетических и инфекционных заболеваний. Таким образом, анализ литературных данных указывает на актуальность изучения взаимодействия и определения эффекторов ДНК различной природы с помощью электрохимических ДНК-сенсоров для разработки недорогих, экспрессных методик анализа объектов эколого-аналитического мониторинга и многокомпонентных биологических систем на содержание тяжелых металлов, противоопухолевых препаратов и фрагментов ДНК.
