Содержание к диссертации
Введение
1. Ферментные сенсоры на основе холинэстеразы и пероксидазы (Литературный обзор) 11
1.1. Методы иммобилизации холинэстеразы и пероксидазы для создания электрохимических ферментных сенсоров „.,,,13
1.1.1. Способы иммобилизации холинэстеразы 16
1.1.2. Иммобилизация пероксидазы 23
1.2. Лероксидазные электрохимические сенсоры 36
1.2.1. Прямой перенос электрона с участием пероксидазы 37
1.2.2.Использование медиаторов электронного переноса 40
Аналитическое применение пероксидазных сенсоров 48
1.3.1. Определение субстратов пероксидаз 48
1.3.2. Определение эффекторов пероксидаз 53
2. Экспериментальная часть 59
Материалы и реагенты 59
2.2. Приборы и оборудование 62
2.3. Изготовление ферментных сенсоров 65
2.3.1. Ферментные сенсоры на базе печатных электродов, изготовленных в университете г. Перпиньян (Франция) 65
2.3.2. Ферментные сенсоры на основе планарных графитовых электродов производства НПВП "ИВА" 66
2.3.3. Модификация печатных электродов, изготовленных в университете "Тог Vcrgata", г. Рим 68
2.3.4. Изготовление пероксидазных сенсоров на основе печатных электродов, изготовленных в университете г. Нант 69
2.4. Определение пестицидов 70
3. Операционные параметры холинэстеразных сенсоров на основе модифицированных планарных электродов 73
3.1. Холинэстеразные сенсоры на основе печатных электродов, модифицированных нафионом 73
3.2. Холинэстеразиый сенсор на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью , 82
3.2.1 Влияние условий иммобилизации на характеристики сенсора 85
3.2.2. Определение пестицидов с помощью ахэ/бл сенсора 91
4. Пероксидазныб сенсоры на основе модифицированных планарных электродов 97
4.1. Определение органических субстратов ПХ. 98
4.1.1. Иммобилизация ПХ на немодифицированных электродах и выбор рабочих условий измерения сигнала биосенсора.., 98
4.1.2. Определение фенолов и ароматических аминов 103
4.2. Биферментные сенсоры на основе толстопленочных угольных электродов, модифицированных политирсшином 111
4.2.1. Определение субстратов ПХи БуХЭ 115
4.3. Определение промазина и хлоропромазина при помощи модифицированного полианилином электрода и пероксидазного сенсора 120
4.4. Иммуносенсоры с индикаторной пероксидазнойреакцией 131
4.4.1. Определение цефтазиднма 131
4.4.2 Определение нонилфенола 135
Выводы 141
Список использованных библиографических источников143
- Иммобилизация пероксидазы
- Изготовление ферментных сенсоров
- Холинэстеразиый сенсор на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью
- Биферментные сенсоры на основе толстопленочных угольных электродов, модифицированных политирсшином
Введение к работе
Актуальность работы. ' Методы ферментативного анализа - одна из динамично развивающихся областей аналитической химии. Интерес к применению ферментов с целью идентификации и количественного определения биологически активных соединений обусловлен возможностью достижения уникальной селективности и чувствительности их определения, а так же простотой аппаратурного оформления, позволяющего проводить измерения по месту пробоотбора. В ряде областей (определение глюкозы, мочевины, лак-тата, других метаболитов) ферментативные методы успешно конкурируют с традиционными инструментальными (хроматография, спектральные методы) [1,2]. Недостатки использования ферментов в рутинном анализе - низкая устойчивость при хранении и высокая себестоимость - могут быть компенсированы благодаря их иммобилизации на различных носителях. Помимо многократности использования иммобилизованных ферментов и стабилизации их активности при хранении, иммобилизация упрощает включение препарата фермента в специализированное измерительное устройство - биосенсор, что важно в свете возможной коммерциализации результатов исследований [3],
Новый импульс развитию биосенсоров и ферментативных методов анализа дали технологии получения тонко- и толстопленочных электродов, изготавливаемых методом струйной печати и фотолитографии. Появились дешевые и удобные в работе планарные электроды с устойчивыми воспроизводимыми электрохимическими характеристиками. Технология их получения позволяет варьировать состав и свойства графитовых материалов, вводить в них медиаторы электронного переноса, а в ряде случаев - и сами биологические компоненты. Возможность получения электродов произвольной геометрии и толщины электропроводящего слоя облегчает создание интегрированных аналитических устройств и включения биосенсоров в существующие системы автоматического и полуавтоматического контроля. Этим объясняется внимание к разработке новых амперометриче- *J Научным консультантом работы является д.х.н., проф.Будников Г.К. б ских сенсоров, в том числе в крупнейших кампаниях, производящих аналитическое оборудование (BtoAnalytical Systems, Metrohm, EcoChemie и др.).
Сочетание планарных электродов с направленной модификацией их поверхности и стабилизацией биологических компонентов в процессе иммобилизации позволяют решить одну из основных проблем биосенсорики - нестабильность сигнала сенсоров при их хранении и эксплуатации. Контакт биокомпонента и преобразователя определяет способ получения аналитического сигнала и его селективность, что особенно важно при проведении измерений в матрицах сложного состава, в присутствии поверхностно-активных веществ, электрохимически активных примесей и т.д. Поэтому требуются исследования, направленные на поиск оптимальных сочетаний модификаторов и биологических компонентов, на установление механизма влияния модификаторов на характеристики иммобилизованного фермента.
Особый интерес представляет исследование ферментных сенсоров, отличающихся широкой субстратной и ингибиторной специфичностью, поскольку для них вклад модификатора поверхности преобразователя сигнала связан еще и с варьированием специфичности сигнала за счет направленного изменения электростатических и стерических факторов, определяющих доступ субстратов и эффекторов, гидрофильно-гидрофобного баланса поверхности. Появляется возможность расширения спектра задач биосенсоров за счет введения в состав поверхностного слоя компонентов, обеспечивающих селективное накопление определенных соединений и таким образом возможность их селективного определения в присутствии других субстратов/ингибиторов.
В этой связи актуальным является изучение возможностей модификации при создании ферментных сенсоров на основе пероксидаз и холинэстераз. Пероксидазы отличаются широкой субстратной специфичностью, что, в частности, используется при контроле фенольного загрязнения промышленных сточных вод [4]. В сочетании с достаточно высокой устойчивостью и наличием чувствительных способов измерения активности это дела-
7 ет данный фермент весьма привлекательным для включения в состав биосенсоров для измерения содержания легко окисляющихся органических соединений. Холинэстераза обладает широкой ингибиторной специфичностью [5], что в сочетании с глубокой изученностью данного фермента, в том числе в составе биосенсоров, позволяет выделить вклад модификации в характеристике биосенсора.
Целью настоящей работы явилось создание амперометрических пероксцдазных и холиюстеразных сенсоров на основе модифицированных графитовых электродов и установление влияния модификаторов на операционные и аналитические характеристики определения субстратов и ингибиторов ферментов в составе биосенсоров,
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: - разработать методы модификации графитовых тонко- и толстопленочных электродов нафионом, полианилином, политирамином, в том числе путем электрополимеризации, производными каликс[4]резорциноларенов и антителами против нонилфенола и цефта- зидима; установить характер влияния модификаторов в соответствии с механизмом их действия; — выбрать условия иммобилизации пероксидазы и холинэетеразы, обеспечивающие наи более устойчивый воспроизводимый сигнал и высокую чувствительность определения их субстратов (пероксидаза) и ингибиторов (холинэстераза); - изучить влияние гетерогенных медиаторов электронного переноса (полианилин, бер линская лазурь) на условия регистрации сигнала и аналитические характеристики пе- роксидазных и холинэстеразных сенсоров; — установить возможность повышения чувствительности определения и расширения круга определяемых соединений (цефтазидим, нонилфенол) с помощью пероксидазных сенсо ров и модификаторов, обеспечивающих накопление субстратов на поверхности элек трода; - разработать чувствительные методы определения субстратов пероксндазы и ингибито ров холинэстеразы с применением модификаторов различного механизма действия.
Научная новизна работы заключаются в том, что: предложены подходы к модификации планарных графитовых электродов, позволяющие решать задачи стабилизации ферментов (нафион, политирамин), снижения рабочего потенциала измерения сигнала (нафион, берлинская лазурь, полианилин) и улучшения аналитических характеристик определения субстратов за счет их селективного накопления на электроде; показана возможность использования берлинской лазури для снижения потенциала окисления тиохолина и регистрации сигнала холинэстеразного сенсора, установлено влияние медиатора и состава иммобилизационной смеси на характеристики определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов; изучено влияние комплексов "гость-хозяин" с участием промазина и хлоропромазина и каликс[4]резорциноларенов на характеристики их прямого и пероксиддзного окисления на электродах, модифицированных полианилином; предложено использовать совместную иммобилизацию пероксиддзы и антител против низкомолекулярных соединении - гаптенов - для регистрации иммунологических взаимодействий на поверхности сенсора по изменению скорости пероксидазного окисления гидрохинона и метиленового синего.
Практическая значимость работы состоит в том, что: предложены простые и удобные в использовании способы модификации электродов путем электрополимеризации анилина и тирамина с последующей иммобилизацией ферментов и включением дополнительных модификаторов за счет электростатических взаимодействий, физической сорбции и кросс-сшивки глутаровым альдегидом; разработаны методы определения остаточных количеств пестицидов антихолинэстераз-ного действия в зерне; предложено использовать холиюстеразныи сенсор для контроля
9 разложения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов при брожении виноградного сока; - разработан биферментный сенсор с пероксидазой и холинэстеразой, иммобилизованны ми на одном графитовом электроде, модифицированном политирамином, для определе ния субстратов пероксидазы и ингибиторов холинэстеразы.
На їащиту выносятся: результаты изучения влияния нафиота и политирамина на стабильность и чувствительность сигнала пероксидазного и холинэстеразного сенсоров при определении субстратов и ингибиторов ферментов и вывод о стабилизирующем влиянии модификаторов при хранении и использовании биосенсоров; характеристика влияния компонентов поверхностного слоя (низкомолекулярные модификаторы, глутаровый альдегид, альбумин, нафион) и выбор состава иммобилизацион-ной смеси и условий иммобилизации, обеспечивающих оптимальное сочетание стабильности сигнала и чувствительности определения ароматических субстратов пероксидазы и фосфорорганических и карбаминатных пестицидов - ингибиторов холинэстеразы; новый способ регистрации сигнала холинэстеразного сенсора при модификации печатного графитового электрода берлинской лазурью и результаты определения с его помощью ингибиторов холинэстеразы; влияние условий пробоподготовки и проведения измерения на чувствительность определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в зерне и виноградном соке в процессе брожения и вывод о возможности применения холинэстеразных сенсоров для контроля качества сельскохозяйственной продукции; влияние модификаторов на аналитические характеристики определения ароматических субстратов пероксидаз с помощью моно- и биферментного сенсора на основе модифицированных преобразователей сигнала, в том числе в присутствии специфических анти-
10 тел и комплексообразователей, и вывод о характере влияния структуры субстрата и механизме действия модификаторов на чувствительность и селективность их определения/ Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийской конференции "Актуальные проблемы аналитической химии" (Москва, 2002 г.), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12 (Дортмунд, Германия, 2002), Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань 2003), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), 8 Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России-2004"(Москва). Основные результаты изложены в 4 статьях и 9 тезисах докладов. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 50 рисунков и 9 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованных библиографических источников; включающего 248 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета при поддержке РФФИ (грант № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров" и № 00-03-32605 "Разработка электрохимических биосенсоров на основе планарных модифицированных электродов для диагностики загрязнения окружающей среды"), научно-образовательной программы CRDF и Минобразнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007), ИНТАС (грант 00-273 "Создание химических и биохимических сенсоров для контроля продукции виноделия"), программы поддержки научных обменов НАТО (грант PST.CLG.979178).
Иммобилизация пероксидазы
При сочетании кросс-сшивки глутаровым альдегидом с включением в полимер фермент смешивают с инертным белком - желатином или альбумином. Присутствие белка повышает стабильность фермента и его удельную активность. Это связано, в частности, с тем, что глобула ХЭ содержит на поверхности относительно мало аминогрупп, поэтому кросс-сшивка самой ХЭ недостаточно эффективна. С этой особенностью фермента связана также аномальная зависимость характеристик ферментных сенсоров от чистоты препарата холинэстеразы. Малоактивные препараты, содержащие балластные белки, зачастую дают более стабильные белковые пленки, нежели высокоочищенные дорогостоящие коммерческие продукты. Существуют два варианта проведения иммобилизации ХЭ кросс-сшивкой глутаровым альдегидом. В первом сначала производится сорбция белков на поверхности из буферного раствора. После этого белковую пленку или сенсор, покрытый такой пленкой, кратковременно обрабатывают достаточно концентрированным (1-5%) раствором глутарового альдегида. Во втором случае сразу готовится смесь белков и разбавленного раствора глутарового альдегида (0.01-0.5%), которая далее наносится на поверхность и выдерживается в течение длительного времени (1-24 часа) до прекращения реакции. Оставшиеся свободные альдегидные группы связывают глицином. Это стабилизирует характеристики иммобилизованного фермента при его хранении и использовании. Оба способа дают сходные результаты, различия связаны в основном с проявлением неоднородности белковой пленки, что наблюдается для достаточно толстых (0.1-1 мм) мембран. В случае применения в качестве матрицы желатина обработка глутаровым альдегидом готовых мембран уменьшает их набухание в процессе эксплуатации [36-39]. Альбумин, напротив, дает лучшие результаты при использовании второго способа иммобилизации, когда фермент и белок смешивают со сшивающим реагентом и уже после этого наносят на подложку [40, 41]. Возможны вариации методик, когда сначала получают тонкую белковую мембрану из смеси белков и глутарового альдегида, а затем поверх наносят защитную пленку желатина или альбумина, которую также закрепляют глутаровым альде 23 гидом. К недостаткам глутарового альдегида относятся его низкая устойчивость к действию окислителей, обратимость реакции сшивки и склонность к олигомсризации в водном растворе, Известны приемы, позволяющие повысить устойчивость образующихся покрытий - например, восстановление имидных связей образующегося основания Шиффа бор-гидридом натрия, но применительно к ХЭ они не нашли распространения.
Вторым по значимости бифункциональным сшивающим реагентом являются кар-бодиимиды [42,43]. Они образуют более устойчивые связи, чем амидные, и реагируют быстрее. Кроме того, в отличие от глутарового альдегида, карбодиимиды не склонны к образованию олигомерных продуктов конденсации в растворе, и в этой связи результаты иммобилизации более воспроизводимы.
В ограниченных масштабах применяются и другие методы ковалентной кросс-сшивки. Так, в [44] совместную иммобилизацию ХЭ и холиноксидазы проводили на поверхности диализной мембраны путем связывания функциональных групп полимера, содержащих атомы активного хлора, с концевыми аминогруппами фермента. Вариацией ковалентной сшивки с участием хлористого цианура является использование коммерчески мембран, модифицированных красителем Cibacron blue [22,45]. Дополнительная стабилизация обеспечивается за счет электростатических взаимодействий (1.8).
Применительно к ПХ иммобилизация осложняется относительно небольшой молекулярной массой белка и наличием в нем полисахаридных остатков. Они экранируют по 24 верхностные функциональные группы, необходимые для ковалентной пришивки белка к носителю. В частности, это снижает эффективность кросс-сшивки фермента глутаровым альдегидом по сравнению с другими оксидоредуктазами. Описаны следующие способы иммобилизации ПХ для се включения в состав электрохимических биосенсоров. Физическая сорбция. Для изготовления сенсоров на основе углеродных материалов использовали пропитку в течение 9 часов раствором ПХ порошка активированного угля [46]. Иммобилизованный фермент сохранял активность после 3 недель хранения при 4С. 20-часовая сорбция из капли раствора ПХ, нанесенной но торец стержня спектрографического графита, описана в [47]. Способом контроля сорбции может служить изменение массы носителя. Так, при использовании пористого графита масса электрода после контакта с ПХ возрастала на 34% [48]. Сорбция можно проводить в присутствии дополнительного стабилизатора. Например, диэтиламиноэтилдекстран при рН 5.0 образует полиэлектролитный комплекс с ферментом, что увеличивает стабильность ПХ после се физической сорбции, Фермент сохранял 77 % начальной активности после семи недель хранения в буферном растворе [48]:
Золотые и углеродные электроды повышают сорбционную емкость после их предварительного химического или электрохимического окисления, сопровождающегося образованием оксидов (золото), карбонильных и карбоксильных групп (углерод). Так, в [49, 50] золотой электрод окисляли пероксидом водорода в серной кислоте и далее выдерживали в растворе фермента в течение 2 часов. Методом пьезокристаллического микровзвешивания было показано, что при сорбции достигается монослойное заполнение поверхности электрода. Время жизни пероксидазного сенсора составило 3-4 дня [49]. Использование коллоидного золота с развитой поверхностью существенно увеличивает удельную концентрацию иммобилизованного фермента и стабильность сигнала пероксидазного сенсора по сравнению с гладким электродом и стеклоуглеродом [51,52].
Изготовление ферментных сенсоров
Наиболее подробно изучено ингибирующее действие на пероксидазу ионов переходных металлов. Как показано на нативной пероксидазы и на препаратах фермента, иммобилизованных в полиуретане, производных целлюлозы и хитазана, действие ртути (II) определяется не только дозой воздействия (т.е. концентрацией и временем контакта), но и природой субстрата и присутствием третьих веществ. Скорость ферментативной реакции определяли фотометрически или визуально по появлению окраски продуктов окислениях хромогенних субстратов (3,3,5,5-тетраметилбензидин, о-дианизидин), Ингибирующее действие солей Hg(II), Pb, Cd и Bi(III) возрастает после предварительного инкубирования фермента с тиомочевиной, реагентом, проявляющим неспецифическое инактивирующее: действие на ферменты, Ві(Ш) - также в присутствии дитиотреитола. Это связывают с частичным развертыванием глобулы фермента, делающим активный центр более доступным для атаки со стороны ингибитора.
Для нативного фермента при использовании в качестве субстрата о-дианизидина предел обнаружения Hg(II) составил 0.01 мкг/л, 3,3,5,5-тетраметилбензидина - 3.0 нг/л. Иммобилизация пероксидазы в полиуретане несколько снижает предел обнаружения ртути (II), хотя аналитические характеристики определения ингибиторов в целом оказались чувствительными к материалу носителя. Определению мешают лишь ионы кадмия и висмута при 1000- и 10000-кратных избытках по отношению к ртути (II), соответственно. Мешающее влияние железа (III) снимают, добавляя в раствор винную кислоту [191]. Имеет значение природа буферного раствора и присутствие третьих веществ. Так, ингибирующее действие ртути (II) последовательно увеличивается при переходе от боратного к цитратному, ацетатному и фталатному буферным растворам [192,193,194]. Органические производные ртути (II) снижают ингибирующее действие серосодержащих соединений (фенилтиомочевина, дитиотреитол) [195,196]. Таким образом, меняя продолжительность инкубирования, природу субстрата и второго эффектора, можно варьировать селективность и чувствительность метода. Помимо соединений металлов, с помощью пероксидазы можно определять присутствие анионов, способных связывать ионы железа гема - цианиды, фториды, азиды, сульфиды, анионы салициловой, сульфосалициловой, щавелевой кислоты,и др. Соответствующие пределы обнаружения варьируются в широких пределах, что также, по-видимому, определяется различной доступностью активного центра фермента в различных вариантах иммобилизации фермента. Так, при включении ПХ в белковую пленку бычьего сывороточного альбумина предел обнаружения цианид-ионов составил 0.52 мкМ [125], по данным [58] - 10 мкМ, при электростатическом связывании с покровной пленкой полимера - 0,1 мкМ [58], а при внесении того же фермента в коллоидное золото - 2 нМ [197]. Еще ниже предел обнаружения цианида, достигнутый с нативным ферментом - 0.5 нМ [198].. Аналогично меняется предел обнаружения фторидов: 10 мкМ для иммобилизованной ПХ [125] и 0,2 мкМ - для нативной [198]. Азиды и сульфиды по ингибирующему действию аналогичны фторидам. Наиболее высока чувствительность активности ПХ к присутствию органических кислот - салициловой и сульфосалициловой, извлекающих железо из состава гема (пределы обнаружения до пх I О" 2 М), Правда, проведение анализа с нативным ферментом предполагает достаточно продолжительную стадию инкубирования.
Регенерация фермента после ингибирования достигается путем обратного связывания лиганда подходящим ионом металла. Количественная оценка подобного либеративно-го эффекта (восстановления активности ингибированной ПХ) позволяет с высокой чувствительностью определять ионы железа (III). Соответствующий предел обнаружения составил 0.01 мкг/мл [198].
Тнопроизводные урацила (2-тиоурацил и 6-н-пропил-2-тиоурацил — противозобное лекарство) снижали скорость взаимодействия ПХ с гваяколом, оказывая ингибирующее действие на фермент [199]. Авторы предположили, что тиольная группа производных урацила взаимодействует с аллостерической связывающей частью области окружения гема фермента. ПХ позволяет также обнаруживать присутствие ряда производных тиомочевины, используемых в качестве химических средств защиты растений, и меркаптанов [100-102, 200], Измерения проводили в органических растворителях - ацетоне, алифатических спиртах и ацетонитриле. Чувствительность определения пестицидов выражали величиной І50 . Это концентрация ингибитора, отвечающая 50% снижению сигнала пероксидазного сенсора после его контакта с ингибитором. С повышением полярности растворителя чувствительность определения серосодержащего пестицида снижалась независимо от способа иммобилизации фермента и используемого медиатора электронного переноса (фенилен-диамин, диметилферроцен, органические комплексы осмия). При переходе от ацетона к метанолу и ацетонитрилу ингибирующее действие тиомочевины снижалось соответственно в 4-5 и 10-15 раз. Следует отметить, что во всех случаях регистрируемые концентрации ингибиторов оказались достаточно высоки (nxlff4 М), что не позволяет использовать разработанные пероксидазные сенсоры для непосредственного контроля указанных токсикантов в объектах окружающей среды.
Холинэстеразиый сенсор на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью
Как отмечалось ранее (см. глава 1), иммобилизация играет ключевую роль в достижении оптимальной чувствительности и селективности ферментных сенсоров, поскольку стадии массопереноса реагентов к месту локализации фермента. При оптимизации состава поверхностного слоя ферментного сенсора, предназначенного для определения ингибиторов, предпочтение отдается минимально возможной концентрации фермента, поскольку с уменьшением концентрации активных центров увеличивается чувствительность сигнала к присутствию ингибитора. С другой стороны, предел обнаружения ингибитора непосредственно зависит от точности измерения сигнала биосенсора. Он определяется как концентрация ингибитора, при которой наблюдается степень ингибирования фермента, отвечающая тройной погрешности измерения сигнала биосенсора. Поэтому стабилизация малых количеств фермента на поверхности сенсора является основной задачей создания биосенсора.
Для иммобилизации АХЭ нами была использована смесь, ранее апробированная для совместной иммобилизации АХЭ и холиноксидазы на аналогичных печатных элек 86 тродах, модифицированной берлинской лазурью. Она вклгочаїа, помимо фермента, также инертный белок (БСА), сшивающий реагент (глутаровый альдегид) и нафион, в данном случае выполняющий функцию стабилизатора фермента. На рис.3.7 представлены кривые зависимости тока окисления АХЭ/БЛ сенсора от концентрации АТХИ в зависимости от активности фермента в исходной смеси.
Рисунок 3.7. Зависимость тока окисления от концентрации субстрата (АТХИ) при различной активности АХЭ. Для иммобилизации использовали смесь 0.1% БСА, 1 % глутарового альдегида, 0.1% нафиона и 0.02 Е/мкл (а), 0.05 Е/мтсл (Ь), 0.1 Е/мкл (с) и 0.2 Е/мкл (d) АХЭ
Как видно из рисунка, все кривые имеют сигмоидный характер с выходом на предел при концентрации субстрата, превышающей 1.5-3.0 мМ. Время 90% изменения тока после добавления субстрата не превышало 8 с, а стабилизация тока достигалась не более чем за 3 минуты. Это указывает на незначительный вклад диффузионных ограничений переноса субстрата, что благоприятно для последующего определения ингибиторов. В области малых концентраций АХЭ сигнал оказался весьма незначительным, и поэтому были предприняты попытки дополнительной стабилизации АХЭ за счет варьирования содержания двух других присутствующих стабилизаторов - БСА и нафиона. Влияние данных компонентов на сигнал сенсора при содержании АХЭ 0.2 Е/мкл представлено на рис,3.8. 25 20-1 15 10-і О 2 20
Влияние БСА (І) и нафиона (2, АТХХ 1.5 мМ) на сигнал АХЭ/БЛ сенсора с содержанием АХЭ в иммобилизационной смеси 0.02 Е/мкл. Концентрации других компонентов приведены в тексте. Фосфатный буферный раствор, рН 7.4
Как видно, при увеличении содержания БСЛ в 10 раз сигнал биосенсора увеличивается более чем в 5 раз. Влияние инертного белка объясняется его участием в процессе кросс-сшивки глутаровым альдегидом, Он встраивается в белковую пленку, снижая скорость вымывания фермента, а также защищая функциональные группы активного центра от реакции с глутаровым альдегидом. Что касается нафиона, его действие противоположно. С увеличением его концентрации сигнал падает либо в силу снижения эффективности кросс-сшивки, либо в результате электростатических взаимодействий с заряженной молекулой субстрата.
Значение константы Михаэлиса, определенное по электрохимическому варианту уравнения Лайнуивера-Берка (3.3) составило 0,25±0.08 мМ. Оно хорошо согласуется с имеющимися литературными данными. Так, в [217] приводится значение 0.38 мМ, в [218] - 0.5 мМ. Как отмечалось выше, это может рассматриваться как косвенное доказательство отсутствия диффузионных ограничений реакции, О том же говорит и совпадение рН-максимума активности иммобилизованной и нативной АХЭ (рис.3.9).
Операционную стабильность сигнала разработанного сенсора проверяли в десяти последовательного измерениях с промежуточной отмывкой биосенсора в рабочем буфер 88 ном растворе. Постоянный дрейф сигнала (рис.3.10), связанный, по-видимому, с недостаточной эффективностью кросс-сшивки, не позволяет рекомендовать столь малую нагрузку фермента для последующего измерения содержания ингибиторов АХЭ.
В этой связи были предприняты попытки увеличить нагрузку фермента. При концентрации АХЭ в иммобилизационной смеси 0.2 Е/мкл. Содержание БСА в смеси выбирали исходя из его влияния на сигнал биосенсора (рис.3.11), Как и в предыдущем случае, в оптимальном количестве БСА увеличивает сигнал ферментного сенсора в 5-6 раз, при этом дальнейшее увеличение количества белка снижает сигнал, по-видимому, за счет роста толщины белковой пленки.
Биферментные сенсоры на основе толстопленочных угольных электродов, модифицированных политирсшином
Для измерения чувствительности сигнала биферментного сенсора к ингибиторам БуХЭ были выбраны два модельных ингибитора - кумафос и хлорпирифос-метил, требующие электрохимического окисления до инкубирования с биосенсором. Процедуру окисления и инкубирования использовали ту же, что и для моноферментного сенсора. Зависимость относительного снижения сигн&ча (степень ингибирования, 1,%) линейно зависит от логарифма концентрации ингибитора Ig(Ci, М), однако диапазон линейности достаточно узок - 0,2-0,8 мкМ для кумафоса и 0.07-3.0 мкМ для хлорпирифос-метила (4.4). Кумафос: 1,% = 349+17 + (53±3)xlg (Сь М), г = 0.9939, n = б (4.4) Хлорпирифос-метил: 1,% = (242±13) + (31±2)xlg (Сі, М), г = 0.9917, n = 6
Как и в случае определения субстратов, биферментный сенсор уступает моноферментному по чувствительности определения ингибиторов БуХЭ. Тем не менее, несмотря на некоторую потерю чувствительности определения субстратов и ингибиторов фермен 120 тов, использование политирамина в качестве матрицы для иммобилизации ферментов показало ряд преимуществ: - высокую технологичность нанесения и возможность осаждения полимера из нейтральной среды - достижение высокой стабильности иммобилизованных ферментов: при хранении в фосфатном буферном растворе. - использование единого формата измерения активности различных ферментов, со-иммобилизованных на едином носителе при отсутствии взаимного влияния условий измерения и эффектов "памяти" при смене субстрата и буферного раствора.
Все это делает биферментный сенсор на основе электрода, модифицированного по-литирамином, перспективным средством контроля содержания соединений, обладающих свойствами субстратов ПХ (легко окисляющиеся загрязняющие вещества) или ингибиторов БуХЭ (фосфорорганические пестициды).
Определение прамашш и хлоропромазина при помощи модифицированного полианилином электрода и пероксидазного сенсора
Производные фенотиазина широко применяются в качестве лекарственных препаратов широкого спектра действия. В частности, промазин и хлоропромазин (4.5) относятся к классу нейролептиков и используются для купирования агрессивного состояния пациентов и животных, при лечении вялотекущей шизофрении, депрессии и ряда других заболеваний. Их определение в лекарственных формах и биологических жидкостях в настоящее время проводится в основном спектрофотометрически и методом ГЖХ с предварительной : дериватизацией, что усложняет проведение анализа [240]. В то же время, известно, что фенотиазины являются потенциальными субстратами ПХ и способны к каталитическому окислению до сульфоксидов на электроде или в присутствии пероксида водорода [164]. Хлоропромазин гидрохлорид Промазин гидрохлорид
Перед разработкой ферментативных методов определения промазина и хлоропро-мазина сначала было проведено изучение их электрохимического поведения на электродах из различных углеродных материалов. В работе использовали стеклоуглеродные, толстопленочные эпоксиграфитовне (производство "ИВА" г. Екатеринбург) и печатные электроды (производство университета г Нант, Франция).
Линейная вольтамлеромстрия, Промазин и хлоропромазин необратимо окисляются на стеклоуглеродном электроде в области +600 мВ. Катодный ток пика восстановления намного ниже анодного пика окисления, хотя разность потенциалов пика составляет 50-70 мВ, характерные для обратимых электрохимических процессов (рис.4.16). Введение электронодонорного атома хлора в ароматическую систему фенотиазина смешает потенциал окисления к более высоким значениям. Вероятный процесс окисления включает образование катион-радикала, стабилизирующегося путем димеризации или последующего окисления до сульфоксида (4.5).
Циклические вольтамперограмы хлоропромазина (1) и промазина (2) на не модифицированном стеклоуглсродном электроде. Фосфатный буферный раствор, рН 7.0.
В миллимолярном диапазоне концентраций фенотиазинов не наблюдалось признаков электрополимеризации, необратимой сорбции продуктов электродной реакции и т.д., выражающихся в резком снижении или увеличении сигнала при многократном сканировании потенциала. После измерения значение фонового тока восстанавливалось простым промыванием электрода в 0.2 М серной кислоте 5-10 мин.
На пленарных графитовых электродах разрешение пиков окисления / восстановления промазина и хлоропромазина несколько улучшается (рис.4.17). Некоторое смещение потенциалов по сравнению с наблюдаемыми на стеклоуглеродном электроде можно отнести к особенностям измерений: в технике напыления, используемой для формирования планарных электродов, хлорид серебра наносится на серебряный токосъемник, находящийся на единой платформе с рабочим электродом (в случае электродов, производимых в Нанте - на керамической пластине). Потенциал такого электрода не является вполне независимым от электродных процессов, поэтому в зарубежной литературе используется термин "псевдоэлектрод сравнения" (pseudo-reference electrode).
По мере увеличения рН обратимость окислительно-восстановительного процесса уменьшается, по-видимому, вследствие дестабилизации первично образующегося катион-радикала.
