Содержание к диссертации
Введение
1. Электрохимические ДНК-сенсоры 12
1.1. Особенности строения нуклеиновых кислот, аптамеров и аутоиммунных антител к ДНК как элементов биосенсоров 12
1.1.1. Особенности строения нуклеиновых кислот 12
1.1.2. Аптамеры 17
1.1.3. Аутоиммунные антитела к ДНК 19
1.2. Электрохимические ДНК-сенсоры 22
1.2.1. Общая характеристика электрохимических ДНК-сенсоров 22
1.2.2. Способы электрохимической регистрации ДНК и взаимодействий ДНК с низкомолекулярными соединениями 26
1.2.2.1 "Прямая" электрохимия ДНК 27
1.2.2.2. Регистрация сигнала ДНК с помощью электрохимически активных меток и маркеров 30
1.2.3. Определение антител к ДНК 41
1.3. Применение электрополимеризованных материалов в ДНК-сенсорах 43
1.3.1. Получение и свойства полианилина 43
1.3.2. Полипиррол в составе ДНК-сенсоров 52
1.3.3. Полифенотиазины в составе электрохимических сенсоров 54
2. Экспериментальная часть 58
2.1. Материалы и реагенты 58
2.2. Приборы и оборудование 61
2.3. Методы исследования 62
2.3.1. Получение биочувствительного слоя биосенсоров 62
2.3.1.1. Электрополимеризация 62
2.3.1.2. Иммобилизация ДНК, аптамеров и олигомеров 64
2.3.2. Измерение сигнала биосенсоров 67
3. ДНК-сенсоры на основе золотых электродов, модифицированных сополимером ТИР амина и о-аминофенола 71
3.1. Электрохимическое поведение МЗ на золотых электродах 72
3.2. Использование в качестве матрицы сополимеров тирамина и о-аминофенола 77
4. Аптасенсоры для определения тромбина на основе электрополимеризованных материалов 86
4.1. Аптасенсоры на основе полимерных форм фенотиазиновых красителей 87
4.1.1. Определение тромбина методом пьезокварцевого микровзвешивания 87
4.1.2. Потенциометрические аптасенсоры на тромбин 94
4.2. Аптасенсор на основе полианилина 98
4.2.1. Потенциометрический аптасенсор на основе полианилина 100
4.2.2. Импедиметрические измерения 103
5. Определение аутоиммунных антител к ДНК
5.1. ДНК-сенсорна основе полианилина ПО
5.1.1. Потенциометрические измерения 116
5.1.2. Импедиметрические измерения 132
5.2. ДНК-сенсоры на основе электродов, модифицированных полифенотиазинами 136
5.2.1. Потенциометрические ДНК-сенсоры 137
5.2.2. Импедиметрические измерения 144
Выводы 149
Список использованных библиографических источников 151
- Особенности строения нуклеиновых кислот
- Приборы и оборудование
- Использование в качестве матрицы сополимеров тирамина и о-аминофенола
- Определение тромбина методом пьезокварцевого микровзвешивания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из актуальных направлений развития современной биоаналитической химии является создание ДНК-сенсоров, предназначенных для определения комплементарных нуклеотидных последовательностей, а также специфических белков и низкомолекулярных соединений биологического значения. Актуальность таких исследований обусловлена как высокой потребностью в ДНК-сенсорах, связанной с решением задач медицинской диагностики, экотоксикологии, фармакологии и молекулярной биологии, так и с уникальностью характеристик самих нуклеиновых кислот как природных молекулярных рецепторов с широкой пластичностью и специфичностью распознавания. ДНК-сенсоры уже находят практическое применение в решении реальных задач диагностики патогенных микроорганизмов и обнаружении дисфункций организма, связанных с нарушениями иммунитета. ДНК рассматриваются как универсальные шаблоны и составные элементы в синтезе молекулярных электронных устройств - проводящих нано-проволок, молекулярных логических элементов и транзисторов.
Благодаря высокой концентрации заряда и значительному числу активных функциональных групп нуклеиновые кислоты обеспечивают многоточечное нековалентное связывание широкого круга определяемых соединений. Поскольку главными условиями эффективности распознавания являются стерическая доступность функциональных групп ДНК и сохранение ее нативнои структуры в составе биосенсоров, при конструировании ДНК-сенсоров особое внимание уделяется способам включения ДНК в состав биочувствительного слоя.
В связи с этим в последние годы большое внимание привлекают электрополимери-зуемые материалы, получаемые in situ непосредственно на поверхности преобразователя сигнала. К их достоинствам относятся простота получения, контроль состава и характеристик непосредственно на стадии синтеза, высокая адгезия к материалу электрода и воз-
можности модификации характеристик, таких как заряд и электрохимическая активность, в зависимости от назначения и природы биологического компонента в составе биосенсора.
В настоящее время электрополимеризованные материалы начинают играть все возрастающую роль в развитии способов миниатюризации сенсоров, в том числе, при создании батарей сенсоров и при переходе к наноразмерным центрам распознавания молекулярных устройств. Помимо обеспечения связывания биологического компонента, они непосредственно участвуют в генерировании аналитического сигнала благодаря своим элек-трохромным свойствам, редокс-активности и способности к удерживанию низкомолекулярных компонентов - допантов.
Несмотря на быстрое развитие данного направления биосенсорики, применительно к ДНК-сенсорам примеров использования электрополимеризованных материалов относительно немного. Большинство из них связано с использованием полипиррола, который выполняет функцию матрицы для иммобилизации ДНК-зондов и свои особые свойства (электропроводность, удерживание допирующих компонентов) практически не проявляет. Применительно к полианилину ДНК используют как матрицу для получения линейных полимеров регулярного строения, другие электрополимеризованные материалы в составе ДНК-сенсоров практически не описаны.
Вышесказанное указывает на актуальность исследования, направленного на наиболее полную реализацию преимуществ, создаваемых электрополимеризованными материалами в составе ДНК-сенсоров как матрицы для иммобилизации и способа получения аналитического сигнала в отношении высоко- и низкомолекулярных соединений.
В этой связи, целью данной работы явилось создание электрохимических ДНК-сенсоров, предназначенных для решения задач клинической диагностики, в основе которых лежит взаимодействие ДНК с полиэлектролитными электрохимически активными материалами, получаемыми путем электрополимеризации.
7 Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
изучить условия электрополимеризации фенотиазиновых красителей и анилина на поверхности золотых и стеклоуглеродных электродов в зависимости от назначения ДНК-сенсора и способа генерирования аналитического сигнала;
разработать новые способы нанесения биологических компонентов - ДНК-зондов, на-тивной и денатурированной ДНК и аптамеров на а-тромбин - поверх электрополимери-зованных материалов с учетом требований чувствительности регистрации взаимодействий с определяемыми соединениями и формата измерения аналитического сигнала;
изучить возможности регистрации гибридизации комплементарных ДНК-зонду олиго-нуклеотидных последовательностей с помощью диффузионно свободных маркеров на поверхности сенсоров, модифицированных электрополимеризованными материалами;
провести сравнительную характеристику пьезометрического и потенциометрического определения а-тромбина с помощью аптасенсоров на основе комплексов аптамеров с электрополимеризованными анилином, метиленовым синим и метиленовым зеленым;
разработать новый способ обнаружения аутоиммунных антител к ДНК в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями с помощью потенциометрических сенсоров на основе полиэлектролитных комплексов ДНК с электрополимеризованными материалами и изучить механизм формирования сигнала с привлечением данных импедиметри-ческих исследований переноса заряда на границе модифицирующий слой - электрод.
Научная новизна работы заключается в том, что:
- обосновано использование в составе ДНК-сенсоров продуктов электрополимеризации
фенотиазиновых красителей (метиленового синего и метиленового зеленого) и анилина,
обеспечивающих улучшенные характеристики иммобилизации и аналитического сигна
ла для пьезометрического и потенциометрического определения взаимодействия ДНК
(аптамер) - белок;
показана возможность использования ДНК-сенсора на основе планарных золотых электродов, модифицированных сополимером тирамина и о-аминофенола, для регистрации комплементарных олигонуклеотидных последовательностей по сигналу диффузионно свободных маркеров.
предложены и реализованы на примере определения а-тромбина и аутоиммунных антител к ДНК различной этиологии новые способы регистрации взаимодействий ДНК-белок, основанные на измерении потенциала ДНК-сенсора до и после его контакта с определяемыми компонентами;
обоснован механизм формирования сигнала потенциометрического ДНК-сенсора на основе полиэлектролитных комплексов ДНК - полианилин (полифенотиазиновый краситель), связанный с изменением редокс-активности и допирующей способности полимеров в зависимости от рН и присутствия специфически связывающегося белка в составе поверхностного слоя;
разработаны пьезометрические сенсоры для определения а-тромбина с улучшенными характеристиками связьшания и чувствительности определения, достигнутыми за счет использования электрополимеризованных полифенотиазинов в качестве матрицы биологических компонентов.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
предложены простые и удобные в использовании способы модификации золотых и стеклоуглеродных электродов полиэлектролитными комплексами ДНК (аптамер) - полианилин (полифенотиазиновый краситель), обеспечивающие возможность регистрации специфических взаимодействий с участием ДНК и высокочувствительного определения биологических компонентов диагностического значения;
разработаны методики тестирования сывороток крови для установления присутствия в них аутоиммунных антител к ДНК, предложены диагностические критерии сигнала
9 ДНК-сенсоров для больных аутоиммунным тиреоидитом и системной красной волчанкой;
- предложен новый формат изготовления пленочных золотых одноразовых сенсоров на
основе пластин компакт-диска для записи и разборная ячейка для их использования.
На защиту выносятся:
результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых красителей и анилина на различных электродах и выводы о влиянии условий электрополимеризации на генерирование аналитического сигнала и возможность регистрации гибридизации комплементарных олигонуклеотидных последовательностей и специфических взаимодействий ДНК - белок (аптамер - белок);
оценка влияния природы маркеров на сигнал ДНК-сенсора на основе планарных золотых электродов, модифицированных ДНК-зондами и сополимером тирамина и о-аминофенола и вывод о возможности регистрации взаимодействий с участием ДНК и олигонуклеотидов по электрохимическим характеристикам маркеров;
- результаты пьезометрического и импедиметрического изучения аптасенсоров на основе
электродов, модифицированных полифенотиазинами или полианилином и аптамером на
сс-тромбин и выводы о влиянии природы матрицы на чувствительность определения
а-тромбина и селективность сигнала в присутствии сывороточного альбумина человека;
- новый способ регистрации аффинных взаимодействий ДНК (аптамер) - белок по изме
нению потенциала стеклоуглеродного электрода, модифицированного полиэлектролит
ным комплексом ДНК - полимер, до и после его контакта с белком, измеренного при
различных рН и выводы о возможном механизме формирования сигнала для различных
электрополимеризованных материалов.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Флоренция, 2003), Международном симпозиуме "Новые тенденции развития биосенсоров на основе нуклеиновых кислот"
10 (Флоренция, 2003), Всероссийской конференции с международным участием "Электро-
аналитика-2005" (Екатеринбург, 2005), V научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2005), Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2005); Международной конференции "Химия, химическая технология и биотехнология" (Томск, 2006), Международном конгрессе по аналитической химии ICAS-2006 (Москва, 2006), VI Республиканской школе студентов и аспирантов "Жить в XXI веке" (Казань, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции с международным участием "Аналитика России" (Краснодар - Туапсе, 2007), III Международном симпозиуме "Биосенсоры в обеспечении пищевой безопасности и экологическом мониторинге" (Фес, 2007).
Основные результаты изложены в 3 статьях и 10 тезисах докладов. Получено положительное решение по заявке на патент РФ.
Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке и решении основных задач, проведении основных экспериментальных исследований в области создания ДНК-сенсоров и изучении их характеристик, интерпретации, анализе и систематизации полученных результатов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 69 рисунков и 8 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 203 ссылки на отечественные и зарубежные работы.
Диссертация выполнена на кафедре аналитической химии Казанского государственного университета при поддержке РФФИ (грант № 06-03-32217 "Электрохимические ДНК-сенсоры с ферментативным усилением сигнала"), научно-образовательной программы CRDF и Минобрнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007). Исследования в области создания пьезометрических сенсоров на а-тромбин проводили на
кафедре ядерной физики и биофизики университета Комениуса (Братислава, Словакия). В работе использовали оборудование Федерального центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием Казанского государственного университета.
Автор выражает благодарность проф. Т.Хианику (Университет Комениуса, Словакия) за сотрудничество в области создания биосенсоров на а-тромбин, проф. Л.И.Анчиковой, доц. Г.Р.Вагаповой и асп. Е.Ю.Подшивалиной (кафедра эндокринологии Казанской государственной медицинской академии), предоставившим сыворотки крови больных аутоиммунными заболеваниями и участвовавшим в обсуждении результатов их тестирования с помощью потенциометрических ДНК-сенсоров, замдиректора ЗАО "Ли-тех" (г. Москва) к.х.н. И.А.Волкову, предоставившему для исследований ДНК-зонды для создания ДНК-сенсоров для регистрации гибридизационных взаимодействий.
Особенности строения нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты представляют собой биополимеры, состоящие из гетероциклических оснований, связанных рибозофосфатными мостиками [3]. В составе биосенсоров используют как нативную ДНК, так и ее фрагменты, дезоксирибонуклеотиды, далее называемые олигонуклеотидами. Помимо этого, в составе ДНК-сенсоров в последнее время активно применяют синтетические олигонуклеотиды, обладающие высоким сродством к биологическим мишеням. Их называют аптамерами [4]. Аптамеры могут быть как производными ДНК, так и рибонуклеиновых кислот (РНК) и в отличие от олигонуклеотидов не имеют прямых аналогов среди фрагментов природных нуклеиновых кислот.
К числу гетероциклических оснований в составе нуклеиновых кислот относят урацил, тимин (Т), аденин (А), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Взаимодействие этих нуклеиновых оснований приводит к связыванию посредством водородных связей остатков цитозина и гуанина, аденина и тимина с образованием так называемых комплементарных пар оснований [3].
В клетке двунитевые ДНК образуют в основном В-спираль (спираль Уотсона-Крика). В центре ее располагаются комплементарные пары нуклеиновых оснований, а снаружи - остатки фосфорной кислоты и Сахаров. Внутренняя область ДНК, где локализованы нуклеиновые основания, неполярна. Внешняя часть двойной спирали заряжена отрицательно за счет углеводных остатков и фосфатного остова. Цепи ДНК на протяжении всего тяжа образуют два желобка, называемые большой и малой бороздками. Большая бороздка - место связывания белков, ассоциированных с ДНК. Ароматические кольца нуклеиновых оснований в В-спирали почти перпендикулярны ее оси, каждое основание повернуто относительно предыдущего на 35. Спираль состоит из антипараллельных дезок-сирибонуклеиновых цепей, закрученных вправо. На каждый виток спирали приходится примерно 10 пар оснований, ход спирали 3.4 нм. Прочность связывания обусловлена многочисленными водородными связями: каждая пара А-Т образует два, пара Г-Ц - три линейных, и потому особо прочных мостика. Урацил, содержащийся в РНК, ведет себя подобно тимину.
Помимо В-структуры ДНК, известна А-структура. Она представляет собой правую спираль с иным углом наклона нуклеиновых оснований и обнаруживается для некоторых синтетических ДНК и природных ДНК при их дегидратации [5]. А-структура не может связываться с белками из-за недостаточного размера большой бороздки, зато образует прочные комплексы с катионами металлов, удерживаемых электростатическими взаимодействиями с отрицательно заряженными фосфатными группами.
ДНК относительно небольшого размера (например, ДНК простейших, вирусов, внеядерная плазмидная ДНК) обычно находится в кольцевой форме. При выделении кольцевой ДНК из клетки (т.е. при удалении регуляторных белков с ее поверхности) она самопроизвольно сворачивается в сверхспирализованную структуру. Первоначально считалось, что эта форма свойственна только ДНК, выделенной из клеток. Однако, как было установлено позднее, переход из обычной в сверхспирализованную форму ДНК и обратно происходит на этапе репликации с помощью специального фермента ДНК-гиразы и служит для контроля отсутствия повреждений рибозофосфатного остова молекулы [6].
Помимо указанных структур, существуют другие формы ДНК, связанные с определенными специфичными последовательностями нуклеиновых оснований. Так, D-форма образуется в участках ДНК, насыщенных А-Т парами. Спираль D-формы более плотная и включает 8 пар оснований на каждый виток. Сходная структура может образовываться из В-формы при высокой ионной силе раствора. Z-структура (рис. 1.1) образуется в областях В-спирали, богатых гуаниновыми остатками и со строгим чередованием пиримидиновых и гуаниновых оснований, это левая спираль с характерной зигзагообразной формой и 12 парами оснований на виток [7]. Кроме того, ДНК может существовать в растворе в разу-порядоченной клубкообразной форме с частично разделенными нитями [8].
Нарушение структуры нуклеиновых кислот выражается в изменении последовательности нуклеиновых оснований (первичной структуры ДНК), нарушениях связи комплементарных пар оснований и в изменении пространственной структуры ДНК. Ряд биологически активных веществ (нитрозамины, гуанизидины, ионы тяжелых металлов, поверхностно-активные вещества, белки-супрессоры), находясь в микроколичествах в клетке, способны нарушать структуру ДНК или препятствовать в процессе связывания рецепторних участков передаче генетической информации (репликации, транскрипции и трансляции). Некоторые такие процессы обусловливают естественные механизмы адаптации и онтогенеза, другие являются неблагоприятными. Они предшествуют более глубоким по 17 вреждениям ДНК, таким как одно- и двунитевые разрывы, деградация нуклеиновых оснований или их метилирование. Нарушения структуры внеклеточной ДНК связаны с действием сильных минеральных кислот и щелочей, тиомочевины, концентрированных электролитов, ионизирующего излучения, ультразвука и теплового шока. Химические и физические воздействия, вызывающие необратимые нарушения структуры ДНК или отдельных нуклеотидов, называют ДНК-повреждающими факторами.
Приборы и оборудование
Сигнал сенсора для оценки гибридизации олигонуклеотидов измеряли с помощью вольтамперометрического анализатора BAS CV-51W (Bioanalytical Systems, США) в режиме линейной и квадратно-волновой вольтамперометрии, полимеризацию анилина и фе-нотиазинов - с помощью вольтамперографов "Экотест-ВА" (ЗАО "Эконикс-Эксперт", Москва, Россия), AUTOLAB PGSTAT 302 и uAUTOLAB (EcoChemie, Голландия) в режиме постояннотоковой вольтамперометрии с циклической линейной разверткой потенциала.
Полимеризация тирамина. Навеску тирамина 0.0173 г растворяли в смеси, состоящей из 2.5 мл этилового спирта и 7.5 мл 0.05 М фосфатного буферного раствора, содержащего 0.05 М NaCl, рН 6.0. В ячейку заливали 2.5 мл раствора тирамина, опускали электроды и проводили пятикратное циклирование потенциала между 800 и 2000 мВ при скорости развертки 50 мВ/с. Электрод промывали дистиллированной водой и помещали на 5 минут в 3% раствор глутарового альдегида. Далее электрод опять промывали дистиллированной водой и сушили в токе воздуха при комнатной температуре.
Сополимеризация тирамина и о-аминофенола на CDnpodax. Навеску тирамина 0.965 г растворяли в 10 мл этанола, разбавляли в четыре раза 0.05 М фосфатным буферным раствором, содержащим 0.05 М NaCl, устанавливали рН 6.0. Готовили раствор 5 мг о-аминофенола в 0.5 мл НгО, добавляли 2 мкл концентрированной серной кислоты. В рабочую ячейку заливали равные объемы растворов тирамина и о-аминофенола, опускали электроды и проводили пятикратное циклирование потенциала между -600 и 1000 мВ при скорости развертки 100 мВ/с. Электрод промывали дистиллированной водой и помещали на 30 минут в 2.5% раствор глутарового альдегида. Далее электрод опять промывали дистиллированной водой и сушили в токе воздуха при комнатной температуре.
Полимеризация анилина. В ячейке, содержащей 5 мл 0.2 М H2SO4, сначала регистрировали фоновую циклическую вольтамперограмму в диапазоне потенциалов от -100 до 1100 мВ при скорости развертки 40 мВ/с. Проводили электрохимическую очистку электрода наложением потенциала 1000 мВ на 3 минуты и последующим десятикратным цик-лированием потенциала в диапазоне от -100 до 1100 мВ при скорости развертки 40 мВ/с. После этого в ячейку добавляли 33.3 мкл анилина, перемешивали в течение 10 мин. и проводили электрополимеризацию анилина десятикратным циклированием потенциала в интервале от -100 до 1100 мВ при скорости развертки 50 мВ/с. Электрод промывали дистиллированной водой и сушили в токе воздуха при комнатной температуре. Полимеризацию анилина из других кислот проводили сходным образом. Диапазон концентраций кислот и интервал сканирования потенциала указаны в обсуждении результатов.
Полимеризация МЗ. В ячейке с 5 мл 0.001 М фосфатного буферного раствора, содержащего 0.03 М сульфат натрия, рН 7.5 измеряли сигнал фона в интервале сканирования потенциала от -600 мВ до 600 мВ при скорости развертки 100 мВ/с. Затем на рабочий электрод накладывали потенциал 1600 мВ на 5 минут, после чего регистрировали вольтамперограмму в условиях, указанных выше. В ячейку добавляли 50 мкл 1 мМ МЗ, перемешивали в течение 2 минут и проводили десятикратное циклирование потенциала в диапазоне от -600 мВ до 600 мВ при скорости развертки 100 мВ/с. Электрод промывали дистиллированной водой и сушили в токе воздуха при комнатной температуре.
Полимеризация МС. В ячейке с 4.5 мл 0.1 М фосфатного буферного раствора, содержащего 0.1 М сульфат натрия, рН 8.2. измеряли сигнал фона в интервале сканирования потенциала от -700 мВ до 1100 мВ при скорости развертки 100 мВ/с. В ячейку добавляли 500 мкл 0.02 М МС, перемешивали в течение 2 минут и проводили десятикратное цикли 64 рование потенциала в диапазоне от -700 мВ до 1100 мВ при скорости развертки 100 мВ/с.
Иммобилизация ДНК па стеклоуглеродных электродах, модифицированных полимерными слоями. Рабочий электрод предварительно покрывали одним из полимерных слоев, как описано в разд. 2.3.1.1. На модифицированную рабочую поверхность наносили 2 мкл смеси, состоящей из 10 мкл раствора ДНК, 0.025 мг/мл, и 2 мкл 3% раствора глутарового альдегида. Сушили в токе воздуха при комнатной температуре. Аналогичным образом иммобилизовали денатурированную ДНК. Термическую денатурацию проводили, нагревая раствор ДНК в течение 30 минут при 95С в твердотельном термостате "ТЕРМО - 48" ("Биоком", Москва) с последующим охлаждением в ледяной бане в течение 5 минут. Полученный раствор немедленно использовали для иммобилизации на поверхности электрода.
Иммобилизация ДНК в желатиновом слое. На стеклоуглеродный электрод наносили 2 мкл 0.01% раствора желатина и сушили в токе воздуха при комнатной температуре. После формирования белковой пленки на электрод наносили 2 мкл смеси, полученной при смешении 10 мкл раствора ДНК, 0.025 мг/мл, и 2 мкл 3% раствора глутарового альдегида, после чего электрод высушивали в токе воздуха при комнатной температуре.
Иммобилизация аптамеров на пьезокварцевых резонаторах. Рабочую поверхность золотого возбуждающего электрода пьезокварцевого резонатора (СН Instruments) предварительно очищали электрохимически путем сканирования потенциала в 0.2 М H2SO4 в интервале от -600 мВ до 600 мВ для последующего нанесения поли(МЗ) или от -700 мВ до 600 мВ для последующего осаждения поли(МС) при скорости развертки 100 мВ/с. Полимеризацию проводили в 0.02 М трис-буферном растворе, содержащем 0.14 М NaCl, 0.005 М КС1, 0.001 М СаС12 и 0.001 М MgCl2. В случае поли(МЗ) проводили десяти 65 кратное циклирование потенциала в диапазоне от -600 мВ до 600 мВ при скорости развертки 100 мВ/с в присутствии 20 мкМ МЗ. При нанесении поли(МС) проводили десятикратное циклирование потенциала в диапазоне от -700 мВ до 600 мВ при скорости развертки 100 мВ/с в присутствии 2 мМ метиленового синего. Последующее нанесение биохимических компонентов проводили в следующих условиях: а) авидин - путем 15-кратного циклирования потенциала при скорости развертки 100 мВ/с в присутствии 5 мкМ авидина; б) смесь авидина, сывороточного альбумина человека и глутарового альдегида — путем 15-кратного циклирования потенциала в присутствии 1.65 мкМ авидина, 1.65 мкМ сывороточного альбумина человека и 0.8% глутарового альдегида; в) аптамер - путем 15-кратного циклирования в присутствии 0.33 мкМ аптамера ВЮ-АРТАТ 0306. Во всех указанных случаях диапазон циклирования потенциала совпадал с использованным для нанесения полифенотиазинового покрытия, т.е от -600 мВ до 600 мВ на электродах, модифицированных поли(МЗ), и от -700 мВ до 600 мВ на электродах, модифицированных поли(МС) при скорости развертки потенциала 100 мВ/с. Между послойным нанесением биологических компонентов пьезосенсор промывали рабочим буферным раствором, для контроля полноты удаления излишков реагентов проводили регистрацию фонового сигнала сенсора.
Нанесение авидина или ньютравидина на чистый модифицированный золотой электрод проводили путем 15-кратного циклирования потенциала в диапазоне от -600 мВ до 600 мВ при скорости развертки 100 мВ/с в присутствии 5 мкМ авидина или 0.1 мг/мл ньютравидина. Аптамер наносили, как указано выше.
Иммобилизация аптамеров для потенцію метрических измерений (оценка неспецифического связывания). Рабочий стеклоуглеродный электрод предварительно покрывали слоем поли(МЗ), как описано выше. Затем на рабочую поверхность наносили 2 мкл смеси, состоящей из 10 мкл аптамера 0506, неспецифичного к тромбину, с концентрацией 0.25 - 2 мкМ и 2 мкл 3% глутарового альдегида и сушили в токе воздуха при комнатной температуре.
Использование в качестве матрицы сополимеров тирамина и о-аминофенола
Одна из возможных причин низкой чувствительности предлагаемого способа регистрации сигнала гибридизации комплементарных олигонуклеотидов состоит в недостаточной плотности заполнения поверхности электрода молекулами ДНК-зонда и нерегулярности строения такого слоя. Чтобы компенсировать эти недостатки, нами впервые предложен способ иммобилизации ДНК-зонда, сочетающий методы электрополимеризации и ковалентной сшивки биологических компонентов.
Поскольку иммобилизация ДНК-зонда должна сохранить его доступность для последующей реакции с достаточно объемной мишенью, в качестве матрицы не подходят слои полипиррола и полианилина, обладающие высокой плотностью заряда и обеспечивающие слишком прочное многоточечное связывание одноцепочечного олигонуклеотида [151, 152, 162]. Анализ литературных данных показал, что среди других потенциальных полимерных матриц для иммобилизации ДНК наиболее перспективны продукты электрополимеризации фенолов. Они образуют достаточно плотные пленки, устойчивые в требуемом интервале рН. Однако они не содержат активных функциональных групп, способных к ковалентному связыванию с олигонуклеотидами и поэтому в составе биосенсоров находят ограниченное применение, обычно в качестве барьера переноса нежелательных низкомолекулярных компонентов раствора [181, 182].
Ранее в качестве перспективной матрицы для полимеризации биологических материалов посредством кросс-сшивки глутаровым альдегидом изучался продукт полимеризации тирамина, образующийся на электроде. Поэтому нами предложено использовать в качестве матрицы продукты сополимеризации.
С этой целью нами были предложены новые трансдьюсеры на основе планарных золотых электродов, покрытых сополимером тирамина и о-аминофенола [183-185]. В качестве исходных преобразователей сигнала использовали электроды на основе золотых компакт-дисков для перезаписи (CD-RW). Электроды закрепляли в разборной ячейке из политетрафторэтилена, в качестве уплотнительной мембраны использовали пленку Parafilm и политетрафторэтилен. После удаления защитного полимерного слоя 50% азотной кислотой такие планарные тонкопленочные электроды показали надежные и устойчивые характеристики определения электрохимически активных маркеров, используемых для регистрации гибридизации комплементарных олигонуклеотидных последовательно 79 стей. В качестве примера на рис.3.3 представлены градуировочные зависимости определения гидрохинона, МЗ, а также антрациклинового препарата рубомицина, относящегося к электрохимически активным интеркаляторам, используемым для регистрации гибридизации.
Ток в пике линейно зависит от концентрации деполяризатора и в режиме линейной вольтамперометрии (гидрохинон) и в квадратно-волновой вольтамперометрии (МЗ). Несовпадение диапазона измеряемых концентраций обусловлено, прежде всего, тем, что в случае МЗ наблюдается сильная сорбция маркера на поверхности золота. Как и на микродисковом золотом электроде, для отмывки МЗ с поверхности CD-трода предложено использовать поляризацию электрода. Однако в силу более развитой поверхности электрода такая отмывка оказалась менее эффективной, чем для стационарных макроэлектродов, поэтому максимальная концентрация МЗ была ограничена величиной 1x10"5 М. Гидрохинон удаляется с поверхности CD-трода простой промывкой рабочей ячейки буферным раствором. Рубомицин в силу необратимого характера окисления давал пик окисления при высоких анодных потенциалах, причем продукты окисления прочно удерживались на поверхности электрода, что приводило к частичной пассивации электрода уже после первого измерения. Поэтому в последующих экспериментах рубомицин для регистрации гибридизации не применяли.
Для иммобилизации олигонуклеотидов предложен новый способ, состоящий в последовательном нанесении на электрод полимера с алифатическими аминогруппами и иммобилизации олигонуклеотидов, модифицированных по концевым нуклеотидным фрагментам аминогруппами, путем кросс-сшивки глутаровым альдегидом. Для нанесения полимера использовали многократное сканирование потенциала в смеси мономеров.
Политирамин с успехом применяли для ковалентной пришивки ряда ферментов на поверхности платинового и стеклоуглеродного электрода. Однако предварительные эксперименты показали, что при использовании CD-тродов пленка политирамина недостаточно прочно удерживается на электроде и сходит с него при замене раствора в ячейке. Попытки получения более толстой пленки завершились полной блокировкой поверхности электрода: регистрируемые токи после десяти циклов сканирования потенциала снижались практически до нуля. Поэтому нами впервые было предложено проводить сополиме-ризацию из эквимолярной смеси о-аминофенола и тирамина. о-Аминофенол был выбран из других изомеров замещенных фенолов по критерию устойчивости образующегося покрытия. На рис.3.4 представлены вольтамперограммы, полученные в процессе полимеризации для пяти первых циклов развертки потенциала. Наблюдается закономерное увеличение тока сопряженных пиков относительно первого цикла на 20-25 % для второго и 35-40% для третьего цикла, после чего изменение характера вольтамперных кривых стано 81 вится незначительным. Тем не менее, пленка сополимера при хранении электрода в рабочем буферном растворе сравнительно легко отслаивалась.
При закреплении на полимерном покрытии двунитевой ДНК и последующем измерении тока окисления МЗ из одного раствора и при смене раствора происходит последовательное увеличение сигнала (кривые ДНК-1 и ДНК-2, рис.3.5). Сами токи при этом остаются ниже наблюдаемых при использовании альбумина (ср. кривая альбумин-1). Это говорит о том, что ДНК электростатически связывается с МЗ, ограничивая его доступ к электроду и участие в электродной реакции. Поскольку в силу малого объема измерительной ячейки раствор между измерениями не перемешивали, увеличение сигнала может быть связано только с последовательным накоплением деполяризатора в поверхностном слое. В присутствии альбумина при последовательном измерении сигнала из одного раствора величина тока практически не меняется (кривая альбумин-1). При смене раствора в ячейке после первой серии измерений регистрируемые токи в обоих случаях достаточно резко снижаются, возможно, в силу частичного механического повреждения поверхностного слоя сенсора или пассивации электрода.
Определение тромбина методом пьезокварцевого микровзвешивания
Иммобилизацию МЗ и МС проводили путем циклирования потенциала из их слабощелочных растворов. Эффективность полимеризации МЗ значительно уступала эффективности полимеризации МС. Изменение анодно-катодного пика при потенциалах около -0.34 В происходило только в том случае, когда область сканирования потенциала захватывала анодную область около 0.55 В, в которой, по-видимому, образуются активные катион-радикальные частицы, инициирующие рост полимерной цепи. При меньших значениях анодного потенциала токи окисления/восстановления МЗ на отдельных циклах практически совпадали. Тем не менее, при переносе электрода в трис-буферный раствор, не содержащий красителя, на регистрируемых вольтамперограммах сохранялись пики, отнесенные к МЗ. Это говорит о том, что, несмотря на отсутствие закономерных изменений токов вольтамперо-грамм, в результате циклирования потенциала на электродах происходило закрепление МЗ. Скорее всего, частично осаждалась лейко-форма МЗ, не растворимая в воде. По результатам пьезокварцевого микровзвешивания в результате циклирования образуется 114±70 пикомоль см"2 продукта в расчете на мономерный фрагмент.
МС в тех же условиях на золотом электроде дает на вольтамперограммах пару острых пиков, отвечающих окислительно-восстановительным превращениям поверхностного продукта, сорбционно удерживаемого на электроде. Анодный пик в области потенциалов -0.12 ... -0.18 В быстро увеличивается с числом циклов сканирования потенциала, тогда как катодный пик при -0.24 В остается стабильным. Пьезометрическая оценка поверхностной концентрации продукта - поли(МС) - дала значительно меньший разброс результатов по сравнению с МЗ и почти в 70 раз большее удельное количество полимера -(7.2±1.4) наномоль см"2. Все полученные полимерные поверхностные продукты отличаются высокой стабильностью при последующем циклировании потенциала. Для иммобилизации аптамера на а-тромбин, содержащего биотин на 3 -терминальном фрагменте олигонуклеотида, предложено использовать его связывание с авидином, закрепляемым на электроде при сканировании потенциала в тех же пределах, что и при полимеризации фенотиазиновых красителей. Поскольку процессы окисления/восстановления полимера сопровождаются переносом эквивалентных количеств противоиона, объем пленок значительно меняется. Это способствует вовлечению авидина в пленку полимера и его более прочному удерживанию по сравнению с чистым золотым электродом. Косвенно в пользу утверждения об электростатическом механизме удерживании авидина в поверхностном слое говорит смещение анодно-катодного тока полифенотиазинов после контакта электрода с авидином. В течение первого цикла сканирования потенциала происходило снижение анодного пика на 10-15% от его величины, наблюдавшейся на последнем цикле полимеризации, вероятно, в силу стабилизации положительно заряженной окисленной формы полимера. После этого положение пиков на вольтамперограммах менялось незначительно. После циклирования потенциала в растворе авидина электрод переносили в свежий буферный раствор и регистрировали вольтамперограмму для контроля устойчивости поверхностного слоя. Способ иммобилизации аптамера в процессе многократного циклирования потенциала позволил сократить продолжительность электростатической иммобилизации с 2 часов, необходимых при поляризации электрода при постоянном потенциале, до 10-15 мин.
Если иммобилизацию авидина проводить в присутствии инертного белка (сывороточный альбумин человека) и глутарового альдегида, помимо включения в состав полимера происходит кросс-сшивка авидина в пленке белка. Это приводит к увеличению диффузионного сопротивления переноса деполяризатора по мере накопления белковой пленки.
Для выявления факторов, обеспечивающих иммобилизацию авидина, также были проведены эксперименты по иммобилизации на чистых золотых электродах. Помимо авидина, использовали ньютравидии, его близкий аналог, содержащий дополнительные сульфгидрильные группы. В этих условиях авидин удерживался на поверхности золота только за счет электростатических взаимодействий, а ньютравидии - за счет хемосорбции посредством связей Au-S, что увеличивало устойчивость образующегося слоя и его емкость в отношении модификаторов. Изменения массы поверхностного слоя в расчете на площадь всего электрода составили при иммобилизации авидина и ньютравидина соответственно 5-25 и 25-70 нг.
Как видно, оба предложенных полимерных покрытия позволяют достаточно эффективно разделять тромбин и альбумин при концентрациях, превышающих 0.03 мкМ. Наклон линейной части графиков закономерно возрастает с концентрацией полимерного продукта. Это отвечает изменению поверхностной концентрации аптамера, удерживаемого в полимерной матрице в силу электростатических взаимодействий.
Модификация золотого электрода поли(МС) увеличивает чувствительность сигнала аптасенсора к тромбину (наклон линейной части градуировочного графика) в два раза по сравнению с характеристиками сенсора на основе поли(МЗ), а также золотого электрода с нанесенными слоями авидина и ньютравидина в отсутствие полимерной матрицы. Обращает внимание, что свободный член а корреляционного уравнения во всех случаях значимо отличается от нуля, что, вероятно, свидетельствует о вкладе неспецифической сорбции белков в изменение массы поверхностного слоя, регистрируемое с помощью пьезо-сенсора. Наименьшее значение а получено для электрода, модифицированного поли(МЗ), а наибольшее - для авидина и ныотравидина, иммобилизованных на чистом золотом электроде. Вероятно, наличие на поверхности положительно заряженного слоя полифенотиа-зиновых красителей подавляет неспецифическую сорбцию белка. Ньютравидин показал эффективность распознавания а-тромбина, сходную с поли(МС), однако сопоставление концентрационных зависимостей сигнала а-тромбина и альбумина говорит о значительно большем вкладе неспецифической сорбции в области малых концентраций белка, в результате чего значение предела обнаружения, соответствующего соотношению сигнал / шум = 3/1, в случае ныотравидина выше и составляет 50 нМ.
Таким образом, использование электрополимеризованных покрытий поли(МЗ) и поли(МС) позволило повысить эффективность электростатической иммобилизации апта-мера, что привело к значительному повышению эффективности распознавания тромбина. Параллельно увеличению удельной концентрации аптамера полимерные пленки эффективно подавляют неспецифическую сорбцию сывороточных белков (на примере альбумина), что позволило снизить предел обнаружения почти в 2 раза по сравнению с аналогичными измерениями с помощью золотых электродов, модифицированных авидином и его тиолированным производным в отсутствие полимерных носителей.
Похожие диссертации на Электрохимические ДНК-сенсоры на основе электрополимеризованных материалов
