Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1 .Методы получения наночастиц золота 11
1. 2. Повышение агрегативпой устойчивости наночастиц золота 25
I.3 1 Іримепепие наночастиц золота при определении биополимеров и биологически активных соедипении 34
Глава II. Экспериментальная часть 40
II. 1 .Характеристика химических и иммунореагентов 40
II.2. Способы формирования иммуноаффинных покрытий сенсоров 43
II.3. Измерение аналитического сигнала ньезокварцевого иммупосепсора 46
II.4. Атомно-силовая микроскопия 48
II.5. Пробонодготовка продуктов и биологических жидкостей 49
II.6. Оценка результатов измерений с помощью ньезокварцевого иммупосепсора 50
II.7. Определение констант скорости прямой и обратной гетерогенной иммунохимической реакции и константы аффинности 51
Глава III. Изучение условий синтеза и поверхностной модификации наночас гиц золота 53
III. 1. Влияние природы, концентрации восстановителя и стабилизатора, рН среды на размер и дисперсность наночастиц золота 54
III.2. Изучение функционализации наночастиц золота 60
Глава IV. Изучение влияния наночастиц золота на аналитический сигнал сенсора при определении высоко- и низкомолекулярпых 63
IV.1. Усиление аналитического сигнала сенсора при определении высокомолекулярных соединений 64
IV. 1.1. Изучение иммунохимической реакции ДНК и анти-ДПК с помощью пьезокварцевого иммупосенсора и методом атомной силовой микроскопии 65
IV. 1.2. Изучение иммунохимической реакции образования комплекса С - реактивный белок - антитела к CRP с помощью пьезокварцевого иммупосенсора 80
IV. 1.2.1. Формирование иммуноаффинного покрытия для определения С - реактивного белка 81
IV. 1.2.2. Применение иаиочастиц золота для определения С - реактивного белка 85
IV.2. Усиление аналитического сигнала сенсора при определении при определении низ комо лекулярных соединений 87
IV.2.1. Наночастицы золота для определения сульфаметазина в конкурентном формате анализа 88
IV.2.1.1.Формирование иммуноаффинного нокрьпия для определения сульфаметазина 90
IV.2.1.2. Оптимизация условий определения сульфаметазина в конкуреп шом формате анализа с помощью наиочастнц золота 92
V.2.2. Наночастицы золо га для определения алдрииа в сэндвич формате анализа 97
IV.2.2.1. Формирование иммуноаффинных покрытий на основе поликлоиальных антител к алдрину 99
IV.2.2.2. Изучение условий образования поверхностного сэндвич иммунокомплекса 102
Глава V. Практическое применение пьсзокварцевых иммупосепсоров, усиленных напочас гицами золота 109
VI. Выводы 117
Список литературы 119
Приложение 144
- Повышение агрегативпой устойчивости наночастиц золота
- Измерение аналитического сигнала ньезокварцевого иммупосепсора
- Изучение функционализации наночастиц золота
- Изучение иммунохимической реакции образования комплекса С - реактивный белок - антитела к CRP с помощью пьезокварцевого иммупосенсора
Введение к работе
Актуальность. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя в качестве удобного инструмента для проведения биохимических и клинических исследований, сертификации пищевых продуктов и фармацевтических препаратов, мониторинга объектов окружающей среды. Уникальной особенностью пьезокварцевьтх гравиметрических иммуносенсоров является сочетание высокой чувствительности, связанной с использованием в качесіве физического преобразователя высокочасто і ного пьезокварцевого резонатора АТ-среза, и селективности, вследствие применения иммунореагептов. Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносепсора служит уменьшение частоты колебаний при образовании иммунокомплекса на поверхности его электрода. Дальнейшее снижение предела обнаружения аналитов возможно за счет присоединения к поверхностному иммунокомплексу наночастиц полимеров или металлов. Наибольший интерес при определении высоко- и низкомолекуляриых соединений представляет использование наночастиц золота, характеризующихся высокой биосовместимостыо, инертностью и способностью образовывать достаточно прочные связи с биомолекулами.
Паночасгицы золота положительно зарекомендовали себя в оптических и электрохимических сенсорах. Имеются немногочисленные работы, посвященные применению наночастиц золота для усиления аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносепсора при определении высокомолекулярных соединений, например инсулина, трипсина и др. Еще в меньшей сіепени изучено усиление аналитического сигнала при определении низкомолекуляриых соединений, например, пестицидов и лекарственных препаратов. Однако систематические исследования по изучению возможности применения наночастиц золота для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносепсора ранее не проводились. Поэтому актуальным является расширение перечня определяемых с помощью пьезокварцевьтх иммуносепсора, усиленного ианочастицами золота, соединений, в час гное ги за счет биомаркеров аутоиммунных заболеваний и воспалительных процессов, что позволит повысить надежность ранней клинической диагностики, токсичных пестицидов и лекарственных препаратов, являющихся широко распространенными загрязнителями пищевых продуктов и объектов окружающей среды. Также необходимо дополнительное изучение условий синтеза устойчивых наночастиц золота фиксированного размера для усиления сигнала иьсзокварцевого иммуносенсора.
Цель исследования заключалась в изучении возможности применения наночастиц золота для повышения чувствительности определения и снижения предела обнаружения высоко- и низкомолекулярных соединений с помощью иьсзокварцевого иммуносенсора. Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:
разработка методик получения наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты для последующего применения в пьезокварі іевьіх иммупосенсорах;
изучение закономерности тиолирования наночастиц золота и образование конъюгатов с молекулами антител к Д1ПС и С -реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрииу;
изучение способов иммобилизации ДІЖ, антител к CRP, поликлональиых ані шел к алдрину и сульфаметазин-белкового конъюгата на поверхности электродов пьезокварцевого резонатора для формирования устойчивых и конформационно доступных покрытий сенсора;
разработка методик определения следовых концентраций высокомолекулярных (антитела к ДНК, С - реактивный белок) и пизкомолекулярных (сульфаметазин, алдрин) соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, усиленного ианочастицами золота. Научная новизна работы:
установлено влияние концентрации восстановителя, стабилизатора и рН среды на средний диаметр синтезированных папочастиц золота из золотохлористоводородной кислоты с помощью хлорида олова (II);
предложены новые способы формирования иммупоаффинных покрытий сенсоров для определения антител к ДНК на основе тиолированньтх папочастиц золо га и С - реактивного белка на основе калхікс[б арена;
г [оказано влияние размера папочастиц золота, природы и концентрации тиолиругощего агента и соотношения концентраций тиосоедииение/напочастицы золота па эффективность связывания с молекулами анти-ДНК и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину;
установлены закономерности применения золотых папочастиц для усиления аналитического сигнала ньезокварцевого иммуносепсора и снижения предела обнаружения высокомолекулярных соединений (антитела к ДІЖ, С -реактивный белок) в прямом формате и низкомолекулярных соединений (сульфаметазип и алдрин) в конкурентном и сэндвич форматах анализа.
Практическая значимость:
разработаны методики получения папочастиц золота со средним диаметром 5, 30, 50 нм и их функционализации с помощью L-цистамииа, 11 меркаитоундеканола, меркаптопропионовой кислоты и s ацети л меркаптоя тарной кислоты;
показана возможность применения папочастиц золота для усиления аналитического сигнала сенсора и снижения предела обнаружения при определении высоко- и низкомолекулярных соединений;
разработаны методики определения следовых концеїгфаций антител к ДНК, С - реактивного белка, сульфаметазина и алдрниа с помощью ньезокварцевого иммуносепсора, усиленного наночастицами золота. На защиту выносятся;
методики получения наночастиц золота из золотохлористоводородной кислоты с помощью хлорида олова (II) со средним диаметром 5, 30, 50 им для последующего применения в пьезокварцевых иммуносенсорах;
закономерности функционализации поверхности наночастиц золота меркаптопроизводными (ангидрид s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты, 2-мсркаптоэтиламин (L-цистамип), меркантопропионовая кислота и 11-меркаптоундскатгол) и взаимодействия с белковыми молекулами антител к ДІ IK и С - реактивным белком, антителами к сульфаметазину и алдрину;
способы формирования устойчивых и чувствительных биорецепторных покрытий для определения антител к ДИК на основе тиолироваиных наночастиц золота и С - реактивного белка па основе каликс[6]арепа;
зависимость аналитического сигнала пьезокварцевого сенсора, предназначенного для определения высоко- и низкомолекулярных соединений от размера наночастиц золота, природы и концентрации применяемого для их функционализации тиолирующего агента;
методики определения следовых концентраций антител к ДИК, С --реактивного белка, сульфаметазина и алдрипа с помощью пьезокварцевого сенсора, усиленного паночастицами золота.
Апробация работы. Отдельные разделы диссертации доложены на II и Щ Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», (Краснодар, 2007, 2009 гг.), VH Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием (Уфа - Абзаково, 2008), VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика -2009» (Йошкар-Ола, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология - 2009» (Пущино, 2009).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 6 статьях, 5 из которых входят в список, рекомендованный ВАК, и 6 тезисах докладов. Структура работы. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 41 рисунок и 21 таблицу. Состоит из введения, 6 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 232 источника и приложения.
Работа выполнялась при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 06-03-32226 «Создание новых высокочувствительных гравиметрических иммупосеисоров для ранней клинической диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний» и № 06-03-96339 «Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммупохимических реакциях на поверхности пьсзокварцевых сенсоров»).
Повышение агрегативпой устойчивости наночастиц золота
При восстановлении золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия по методике Туркевича [17] на поверхности паночастицы золота образуется двойной электрический слой за счет адсорбированных цитрат и хлорид ионов и катионов водорода и натрия. Наличие у коллоидных частиц золота одноименных зарядов является причиной их агрегаїивнои усгойчивости. При довольно высоком элсктрокинстичсском потенциале процессы коагуляции частиц предотвращаются за счет электростатического отталкивания ионных оболочек мицелл. Однако при увеличении ионной силы дисперсионной среды происходит коагуляция электростатически стабилизированного золя. Разрушение энергетического барьера, препятствующего слипанию частиц, также может происходить при повышении или понижении температуры, под действием электромагнитных полей, жестких и ультразвуковых излучений, механического воздействия и при введении химических агентов. Для предотвращения коагуляции и осаждения наночаешц золота как в водных, так и в органических фазах применяют специальные стабилизаторы [104]. При этом увеличение устойчивости ианочастиц золота может происходить при замене одних лигандов на другие, способствующей повышению заряда, а также за счет адсорбции ПАВ и полимерных молекул, приводящей к уменьшению энтропии и увеличению свободной энергии частиц. В качестве таких лигандов применяют тиолы, фосфины, дендримеры, полиэтиленгликоль 105J, поливиниловый спирт [106], поливинилхлорид пирролидон [107, 108], поливинилацетат [109], додецилсульфат натрия [ 110 - 112], Твин 80, Тритон Х-100 [113], хитозан [114J, а также соединения, содержащие фосфии, амино- и карбоксильные іруппьі [115].
Так, замена цитрат - ионов, находящихся на поверхности ианочастиц золота, на другие лиганды позволяет не только регулировать стабильность частиц, но и сообщает новые свойства и функциональные возможности при взаимодействии с биомолекулами. Функцнонализацию ианочастиц можно проводить с помощью молекул хитозана, адсорбирующихся на поверхности коллоидных частиц за счет NH2 -групп. Хитозан добавляют к раствору коллоидного золота, охлаждают и через сутки отделяют наночастицы ультрацентрифугированием. Нсспецифически связанные молекулы модификатора удаляют, промывая осадок дистиллированной водой, а очищенные частицы переводят в раствор под действием ультразвука. Коллоидный раствор наночастиц золота, модифицированных хитозаном, отличается устойчивостью в щелочной среде и к окислению кислородом воздуха [116, 117]. Однако неполное удаление избыточного количества хитозана вызывает пассивацию поверхности AuNP и со временем приводит к коагуляции. Наиболее часто в качестве лигандов, заменяющих цитрат-ионы, применяют различные тиосоеди нения, включающие в себя помимо тиогруппы карбокси-, амино-, и гидрокси-группы. Модификация тиольными соединениями за счет многочисленных донорно-акцепторных связей между атомами серы и золота [118) способствует образованию длинных лиофобных цепей на наночастицах золота, организованных в монослой \Аи 1 Aii+S (CI-I1)nR, что способствует предотвращению взаимодействия между соседними наночастицами [119 - 123. Ионизированные карбоксильные и амино - группы, входящие в состав тиосоединений, могу г приводить к дополнительной электростатической стабилизации частиц в растворе 124, 125J, хотя размер наночастиц при этом может значительно увеличиваться.
Изучены процессы модификации поверхности наночастиц с применением кросс-линкеров, например азобензидиптиола и октантиола, увеличивающие длину углеводородного радикала [126]. Под действием УФ -излучения инициируются диполь-дипольные взаимодействия между наночастицами золота и кросс-линкерами через дитиольные группы, что приводит к коагуляции частиц. Поэтому полученные таким образом коллоидные частицы неустойчивы и не находят широкого применения. Однако под действием видимого света происходит пептизация и частицы вновь переходят в раствор и могут быть использованы па практике. Одной из актуальных задач является стабилизация коллоидных частиц с одновременным контролем их роста. Для этого на стадии синтеза наночастиц используют тиосоединения, содержащие помимо тиогрупп,
Измерение аналитического сигнала ньезокварцевого иммупосепсора
Физическим преобразователем служили резонаторы АТ-среза с собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц с золотыми электродами диаметром 4 мм ( ЗАО «ЭТНА», Россия), а так же сенсоры производства Stanford Research Systems, США (собственная частота колебаний 5 МГц, площадь поверхности электрода 5,06 см"). Исследования проводили на установках, собранных из стандартных блоков, изготовленных на кафедре химии ЛГТУ. Обработка полученных данных осуществлялась с помощью оригинальной программы, разработанной инженером ЛГТУ Д.А. Шрам. Установка для проточно-ипжекциошюго анализа включает дозатор ввода анализируемой пробы, фосфатного буферного и регенерирующего раствора; проточную микроячейку детектирования, объемом 20 мкл, в которой иммуносепсор закрепляется с помощью мягких силиконовых прокладок таким образом, чтобы с жидкой фазой контактировала только одна из его сторон; генератор возбуждения колебаний пьсзокварцевого резонатора на основе транзисторно-транзисторной логики; частотомер 43-54; двух-нлунжерный изократический насос К-120 (Knauer, Германия).
Скорость потока жидкости составляла 60 мкл/мип. В качестве раствора-носителя использовали буферный раствор PBS (рН 7,2). Изменение частоты колебаний сенсора с интервалом в 30 с регистрировали с помощью частотомера 43-54. Пьезокварцевые микровесы QCM-200 (SRS, США) включали проточную ячейку детектирования с максимальным объемом вводимой пробы 200 мкл. Система подключалась с помощью интерфейса RS-232 к компьютеру. Изменение частоты колебаний сенсора регистрировалось в виде функции от времени с интервалом в 1 - 5 секунд с помощью программы LabVIEW StandAlone (National Instruments, USA). Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносенсора служило уменьшение частоты колебаний пьезокварцевого резонатора (АС) при увеличения массы биорецепторного покрытия за счет образования поверхностного иммунного комплекса. Перед началом измерений через систему пропускали буферный раствор до стабилизации базисной линии (20-45 мин). Один полный измерительный цикл проточно-ипжекционного анализа (10 мин) не отличался от предложенного в [221). Измерение в режиме "dip and dry". Измерение в режиме "dip and dry"пpoвoдили при определении С - реактивного белка. Схема включала два генератора, первый из которых - измерительный, второй - эталонный. Сигнал регистрировался при изменении массы биослоя на поверхности электрода резонатора, подключенного к измерительному генератору относительного эталонного, соединенного с немодифицированным кварцевым резонатором, не меняющим свои характеристики под влиянием внешней среды. Измерение сигнала в термостатируемой ячейке относительно сенсора сравнения позволило учитывать только приращение массы за счет образования поверхностного иммунокомплекса. Цикл измерений, включающий нанесение на поверхность электрода ньезокварцевого резонатора анализируемого раствора, высушивание, промывание фосфатным буферным раствором и последующую регистрацию изменения частоты колебаний, не отличался от описанного ранее [222]. После каждого цикла измерений проводили регенерацию покрытия, при этом частота колебаний ньезокварцевого резонатора возвращалась до исходного значения.
При отклонении аналитического сигнала более чем на 5%, биорецепторный слой полностью удалялся, и осуществлялась повторная иммобилизация биореагентов. ЛСМ изображение поверхности золотых электродов QCM, тонких пленок на поверхности электродов получали при комнатной температуре на воздухе с помощью а томно-силового микроскопа SOLVER Р47 Pro (ЗЛО «Паногсхнология-МДТ», Зеленоград, Россия) в режиме прерывистого контакта на воздухе с использованием кантилеверов NSGO 1/20 (Зеленоград, Россия) из кремния с номинальной жесткостью 5 Н/м, резонансной частотой сканирования в диапазоне 120-180 кГц и радиусом закругления 10 им. Получены 2D, 3D - изображения поверхности и рассчитаны средние коэффициенты шероховатости (Ra) с применением программного обеспечения NOVA. Подготовку поверхности для сканирования ианочастиц золота осуществляли, опуская подложку из графитовой слюды в раствор коллоидного золота, выдерживали 2 мин, промывали и высушивали па воздухе. Для установления размеров ианочастиц проводили обработку полученных изображений с помощью программного обеспечения NOVA, убирая крупномасштабные неровности, шумы и применяя функцию Grain Analysis. По результатам обработки снимков строились гистограммы распределения ианочастиц по размерам.
Изучение функционализации наночастиц золота
Одним из способов повышения устойчивости заключается в покрытии паночастиц функциональными группами различной природы. Наиболее часто для этих целей используют тиолы, карбоновые кислоты, полиакриловая кислота, полидиметилсилоксан, различные ПАВ и т.д. Поверхностную модификацию осуществляли адсорбцией лигапдов на поверхности паночастиц золота с учетом прочности образуемых связей, возможной депагурации белковых молекул или возникновения стерических помех при дальнейшем взаимодействии с антителами. Кроме того поверхностная модификация AuNP позволила коллоидным растворам сохранить сгабилыюсть в течение длительного периода времени и обеспечила эффективное взаимодействие с биологически активными соединениями и биополимерами. Для последующего взаимодействия с биомолекулами и придания дополнительной устойчивости коллоидным частицам, поверхность AuNP тиолировали меркаптопроизводными. Выбор тиосоединений, предназначенных для модификации AuNP, осуществляли с учетом разной длины и разветвленности углеводородной цепочки, наличия функциональных группировок и количества тпогрупп. При взаимодействии ианочастиц золота с L-цистамином, меркаптопропионовой кислотой, 11-меркаптоундеканолом и ангидридом s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты происходит образование сульфидных связей с поверхностью металла и формирование мостиков различной длины и пространственного строения, отличающихся природой концевых функциональных групп.
Хемосорбции L-цистамина па поверхности AuNP предшествует разрыв дисульфидной связи и присоединение двух частей молекулы с образованием коротких линкериых структур с активными №-12-группами на конце (рис. 11а). МРА сорбируется на золотой поверхности за счет сульфидной связи, образуя углеводородную цепочку с концевой СООН - группой (рис. 116), обуславливающей возникновение водородных связей с молекулами воды и с соединениями с карбоксильными группами, что приводит к частичной дезактивации активных центров. Присутствие гетерогенного пятичленпого цикла с двумя карбонильными группами в молекуле ангидрида s-ацетилмеркаптояптарной кислоты (рис. 11в) оказывает стерические затруднения при взаимодействии с коллоидными частицами, приводящими к снижению плотности хемосорбированных поверхностных групп и образованию водородных связей друг с другом. При сорбции 11 - меркаптоундеканола образуется достаточно гибкий протяженный линейный мостик из (СНо-) - группировок с концевой гидроксилыюй группой, доступной для взаимодействия с молекулами антител (рис. Иг). На спектрах поглощения AuNPSH наблюдается смещение максимума на 5-10 им в длинноволновую область по сравнению с модифицированными частицами (рис. 12), положение которого зависят от природы применяемого тиосоединення - наличие функциональных групп и электростатических взаимодействий, а также передачи электронов от молекул лиганда к золоту [228 - 230]. Минимальное смещение
Хтах отмечается для частиц, модифицированных меркаптопропионовой кислотой, что свидетельствует об изменении внешней сольватной оболочки при взаимодействии не только с водой, но и с соседними наночастицами, и существенной дезактивации концевых групп. Рис 12. Спектры свстопоглощсния петиолированпых наночастиц золота (1) и тиолировапых с помощью меркаптопропионовой кислоты (2), ангидрида s-ацетилмеркаптоянтарной кислоты (3), 11- меркаптоуидекапола (4) и L-цистамина (5). Соотношение концентрации тиосоединения и наночастиц золота 2/1 В остальных случаях \1ГШХ смещается примерно на одну величину, однако для AuNPSH, модифицированных L-цистамшюм, отмечено максимальное значение оптической плотности, свидетельствующее о высокой плотности присоединенных функциональных групп. С помощью пьезокварцевого иммуносенсора возможно селективное определение низких концентраций высоко- и низкомолскуляриых соединений в жидких средах без введения каких-либо меток. Поскольку аналитическим сигналом сенсора служит уменьшение резонансной частоты, связанное с увеличением массы на поверхности его электрода, повышение чувствительности определения и снижение предела обнаружения высоко- и низкомолекулярпых соединений может быгь досі и гнуто за счет: - иммупоаффинного слоя с максимальным числом активных сайтов связывания - увеличения массы присоединенных молекул с помощью ианочастиц золота. При формировании иммупоаффинного покрытия сенсора необходимо обеспечить: равномерное распределение рецепторных молекул, способных к комплементарному взаимодействию, по всей площади электрода; е сохранение высокой активности и конформацтюнной доступности иммобилизованных биомолекул; о минимальную массу рецепторного слоя, позволяющую определять в максимально широком диапазоне как крупные аналиты, так и низкомолекулярные соединения без перегрузки сенсора.
Опре/іеление высокомолекулярных соединений обычно осуществляют в прямом формате за счет взаимодействия молекул рецепторного слоя сенсора с аналитом, что вызывает значительное приращение массы. При этом на поверхности электрода сенсора закрепляют крупные молекулы антигенов, либо антител, а уменьшение частоты колебаний сенсора прямо пропорционально концентрации определяемого компонента в анализируемой пробе. Повышение поверхностной концентрации рецепторных молекул и увеличение аналитического сигнала сенсора могут быть достигнуты, вследствие закрепления на поверхности электрода сенсора ианочастиц золота, к которым впоследствии присоединяют рецепторные молекулы или
Изучение иммунохимической реакции образования комплекса С - реактивный белок - антитела к CRP с помощью пьезокварцевого иммупосенсора
Как правило, ковалентная иммобилизация с применением кросс-реагентов приводит к уменьшению доступных активных сайтов рецепторных молекул для взаимодействия с аналигом из-за участия функциональных групп в образовании связей с подложкой или кросс-реагентом. Такого недостатка лишены способы иммобилизации при применении дендримеров, каликсаренов и краун-соедпнений, которые, благодаря наличию полостей определенного размера, способствуют закреплению биомолекул за счет образования комплексов «гость - хозяин» и создают удобное коиформационное их расположение для взаимодействия с аналитом. В работе был использован каликс[6]арсн (рис. 23), который закреплялся как непосредственно на поверхность золотого электрода (способ 1), так и на предварительно сформированную подложку на основе силоксана (способ 2). Сравнение способов иммобилизации антител к CRP с помощью каликсарена с ковалеытпым закреплением на подложку y-APTS через глутаровый альдегид (способ 3), показало, что сочетание жесткой каликсареновой платформы, предоставляющей липофильыую полость, и гибких фрагментов функциональных групп, создаст благоприятные условия для внедрения и удержания "гостя" - молекул антител к CRP в полости супермолекулы без блокировки активных сайтов связывания, что подтверждается более высокими значениями концентрационной чувствительности при невысокой массе покрытия (табл. 6). Главным преимуществом иммобилизации антител к С - реактивному белку в полость каликс[6]арепа (рис. 23) является наличие прочных супрамолекулярпых структур, соответствующих размерам белковых молекул антител, удобное пространственное расположение функциональных групп, па что указывают более высокие значения аналитического сигнала.
Несмотря на взаимодействие гидроксильных групп нижнего обода макроїщкла, относительно слабая связь между мономерными фрагментами в целом, осуществляемая за счет образования внутримолекулярных водородных связей, обеспечивает изменение и конформациопиую подстройку каликсарена под «гостевые» молекулы. Сравнение способов иммобилизации с каликс[6 аретшом, непосредственно нанесенным на золотую поверхность электрода и через подложку на основе у-аминопропилтриэтоксисилапа, показало, что большее количество иммобилизованных молекул каликсарена, и следовательно антител, наблюдается в способе 1, о чем свидетельствуют более высокие значения массы АтПЛ каликсарена с антителами и Sc. При этом относительно небольшая общая масса и толщина покрытия (способ 1) позволяют проводить определение С - реактивного белка в более широком диапазоне концентраций (табл. 7) без перегрузки сенсора. Такое покрытие характеризуется удовлетворительной устойчивостью и обеспечивает проведение до 15 циклов измерения по сравнению с иммобилизацией по способу 2. В гоже время при ковалеитпом закреплении антител па y-APTS с применением глутарового альдегида формируется менее устойчивое и более тяжелое покрытие, выдерживающее до 10 измерительных циклов (табл. 6). Преимущество иммобилизации с помощью каликс[6]арена, непосредственно закрепленного на золотой поверхности электрода, подтверждается более высоким значением чувствительности (тангенс угла наклона градуировочной зависимости) и низким значением предела обнаружения (табл. 7). Проведенные кинетические исследования выявили, что рассчиїанньїе константы скорости образования и разрушения комплекса анти - CRP — CRP, различны, что указывает на пеодипаковуто копформациониую досіуиіюсть активных сайтов связывания антител для взаимодействия с молекулами С - реактивного белка. Так при закреплении антител способом 1 константы скорости образования и разрушения комплекса примерно в 2 раза выше, чем при применении ковалентной иммобилизации на у-амииопроиилтриэтоксисилан (табл. 8), что позволяет регистрировать иммунохимичсское взаимодействие между CRP и анти - CRP практически в режиме реального времени. Повысить экспрессгюсть анализа можно, увеличивая скорость подачи раствора — носителя. 85 Поэтому для дальнейших исследований рекомендован способ формирования биорецепторного слоя с помощью калике) 6]арепа, непосредственно присоединенного к золотой поверхности электрода, позволяющий определять более низкие копцептрацтти CRP с более высокой воспроизводимостью, повышающий продолжительность службы сенсора. Эффективность взаимодействия С-реактивного белка с тиолированпыми напочастицами золота оценивали методом иьезокварцевого микровзвешивания.
Для этого AuNPSH закрепляли на поверхности электрода сенсора и регистрировали изменение частоты его колебаний при взаимодействии с CRP. Были использованы частицы золота со средним диаметром 5, 30 и 50 им, в качестве тиолирующих агентов - L-циетамип и 11-меркаіпоуидекаиол. Проведенные исследования показали, что применение тиолированиых L-цистамином наночастиц способствует максимальному значению аналитического сигнала сенсора, вследствие активного иммунохимического взаимодействия концевых NH2 - групп, расположенных на поверхности AuNP, с карбоксильными группами белковых глобул. Кинетические исследования (табл. 9) также показали, что иммунохимическая реакция образования и разрушения комплекса анти-CRP — CRP - AuNPSH протекает более эффективно при модифицировании AuNP L-цистамииом по
