Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время наблюдается тенден-;ия бурного развития биохимических сенсоров (биосенсоров) на снове различных биоматериалов. Это связано, прежде всего с ем, что биосенсоры, в отличие от других видов датчиков, способны давать непосредственную информацию и контролировать состояние как объектов окружающей среды, так и живых организ-юз. Все большее значение приобретает необходимость анализа ю типу on tine, и in Cine . Все это нашло отражение в поя-швшихся в последние годы на мировом рынке коммерческих био-:енсорных устройств для использования в медицине, сельском :озяйстве, промышленности и т.д.
На кафедре аналитической химии Казанского государствен-гого университета в течение ряда лет проводятся разработка и исследование амперометрических биохимических сенсоров, в іастности, на основе иммобилизованной холинэстеразы (ХЭ). В соде предварительных исследований была показана перспектив--гость использования такого рода устройств для определения потенциальных загрязнителей окружающей среды.
Совершенствование и модификация подобных биосенсоров с целью получения оптимального аналитического сигнала, упрощения методик анализа и расширения областей применения этих цатчиков, несомненно, является актуальной задачей в настоящее время.
Разработка новых более эффективных способов иммобилизации Ферментов, изучение механизмов действия их эффекторов и эбеспечение условий повышения избирательности их действия -все это способствует появлению новых более современных биохимических устройств, отвечающих все возрастающим требованиям ж современного аналитического контроля.
Сделать определение, по-существу, уникальным по селективности позволяет новый тип модификации биосенсоров, основанный на использовании реакции биоспецифического взаимодействия антиген - антитело. Такие иммуносенсоры весьма перспективны как для разработки новых методов диагностики заболеваний, так и избирательного определения биологически актизных соединений в
сложных по составу многокомпонентных смесях. В частности, это один из реальных путей решения задач, стоящих перед современной аналитической химией по разработке чувствительных, экспрессных и избирательных способов определения экотоксикантов. И холинэстераза относится как раз к тем ферментам, которые еще недостаточно изучены в этом плане.
Цель .исследования заключалась в усовершенствовании амперо метрического холинэстеразного биосенсора и выявлении возможностей и оптимальных условий определения ингибиторов ХЭ, а так же сочетании разработанного ферментного датчика с иммунологическими реакциями для более эффективного проведения иммунофер-ментного анализа (ИФА).
Работа выполнялась в соответствии с координационным планом АН СССР по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2.20.4.7 по теме № 01.86.0106158, согласно приказу Государственного Комитета СССР по народному образованию № 59 от 31.01.89г. и на основании приказа Миннауки РФ № 133 ф от 04.02.92г.
Научная новизна. Предложен новый вариант иммобилизации ХЭ путем последующей обработки готовых Ферментсодержащих образцов глутаровым альдегидом (ГА). Изготовленные предложенным способом пленки с иммобилизованной ХЭ (ИХЭ) использованы в ам-перометрических биосенсорных устройствах с более высокими эксплуатационными характеристиками. Исследовано ингибируЬщее действие ряда фосфор-, серо- и хлорсодержащих пестицидов на иммобилизованную ХЭ и показано, что эти эффекты могут быть использованы для их количественного определения с нижней границей определяемых содержаний на несколько порядков ниже ПДК. Количественно описаны некоторые характеристики ферментативных реакций с участием ИХЭ в присутствии ряда органических ингибиторов данного фермента. Установлен тип ингибирования некоторых ингибиторов ХЭ с помощью разработанного датчика. Разработана" методика определения ряда ионов тяжелых металлов (цинк, медь, хром, железо, цирконий, титан, гафний, ниобий и тантал) с использованием биосенсора на основе ХЭ. Данные методики применены для оценки степени коррозии соответствующих материалов, предназначенных для имплантации. Показана возможность использования модифицированного холинэстеразного биосенсора для качествен-
- 5 -ной и количественной оценки содержания вируса крапчатости гвоздики в растительных экстрактах. Подобраны условия количественного определения микроколичеств белка. Определены константы связывания иммунного комплекса антиген - антитело по данным вольтамперометрических измерений.
Практическая значимость. Предложенный способ получения ИХЭ может быть использован в лабораториях и на предприятиях аналитического, биохимического и медицинского профилей для применения в различных типах аналитических систем для изготовления на их основе высокочувствительных анализаторов. Способ ^мобилизации защищен авторским свидетельством. Разработанные методики определения ряда пестицидов и тяжелых металлов позволяют устанавливать содержание этих соединений в реальных объектах на концентрационных уровнях ниже ПДК. Полученные результаты о возможности использования холинэстеразного биосенсора в определении вируса растений могут служить основой для разработки методов диагностики заболеваний как растений, так и животных.
На защиту выносятся:
способ получения иммобилизованной ХЭ для использования ее при изготовлении холинэстеразного биосенсора;
данные по кинетическим параметрам реакции гидролиза субстрата ХЭ;
способы определения некоторых Фосфор-, серо- и хлорсодержа-щих пестицидов;
результаты оценки содержаний тяжелых металлов в их водных вытяжках из тканей организмов;
новый вариант определения одного из компонентов"биоспецифического взаимодействия (антигена) с использованием модифицированного биосенсора на основе ИХЭ на примере вируса крапчатости гвоздики;
возможность определения констант связывания иммунокомплек-сов антиген - антитело по вольтамперометрическим данным на примере [иммуноглобулины G-- вирус крапчатости гвоздики].
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждены на УІ Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (г.Москва, 1991г.), Всесоюзной конфе-
ренции "Современные методы контроля качества окружающей среды и пищевых продуктов" (г.Краснодар, 1991т.), конференции "Аналитическая химия объектов окружающей среды" (г.Санкт-Петербург - Сочи, 1391г.), научно-техническом семинаре" Химический анализ пищевых продуктов и загрязнений окружающей среды" (г. Москва, 1992г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ. Из них I авторское свидетельство на изобретение, 2 стать и тезисы 3 докладов на Всесоюзных конференциях.
Структура диссертации. Диссертация изложена на J26 страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков (из них 4 в приложениях), 21 таблицу и список литературы из 129 наименований. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, а также 3 приложений. В первой главе рассмотрен механизм действия холинэстеразы как жизненно важного фермента, проанализированы литературные сведения по иммобилизации ферментов и созданию электрохимических биосенсоров на основе иммобилизованных Ферментов, а также обобщены некоторые закономерности кинетики ферментативного катализа и кинетики взаимодействия антигенов (Аг) с антителами (Ат). -Во второй главе формулируются поставленные задачи, описываются изученные объекты, экспериментальные условия и техника эксперимента. Третья глава посвящена получению ИХЭ и изучению активности и устойчивости во времени изготовленных предложенным способом препаратов. В четвертой главе представлены экспериментальные данные по определению пестицидов и тяжелых металлов и описанию количественных характеристик кинет* ки холинэстеразного катализа. Пятая глава посвящена новому варианту ИМ с использованием биохимически модифицированного ферментного электрода, в сенсорную часть которого входит ХЭ.
Похожие диссертации на Амперометрический холинэстеразный биосенсор в анализе биологически активных соединений
