Содержание к диссертации
Введение
1. Современное состояние проблемы и определение пути её решения 17
1.1. Эпигенетическая стратегия повышения продуктивности растениеводства 17
1.2. Анализ представлений о механизме биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения 26
1.3. Полевая коммуникация биологических организмов 39
1.4. Лазерная стимуляция в растениеводстве; способы, технологические приёмы и технические средства облучения 54
1.5. Формализация проблемы, цель и задачи исследований 81
1.6. Выводы 85
2. Разработка методологии и технических средств исследований 86
2.1. Программа исследований и её структура 86
2.2. Анализ причин низкой воспроизводимости эффекта лазерной стимуляции растений 90
2.3. Алгоритм эксперимента по лазерному облучению растительных А организмов 94
2.4. Разработка семейства многофункциональных лазерных установок для научных исследований 109
2.5. Материалы, методы и технические средства исследований 142
2.6. Выводы 149
3. Закономерности ответной реакции раститель ных организмов на действие низкоинтенсивного лазерного излучения 150
3.1. Нелинейный характер ответной реакции растительных организмов на низкоинтенсивное лазерное облучение 151
3.2. Многомодальность ответной реакции различных биосистем, возбуждённых.когерентным светом 161
3.3. Условия проявления эффекта лазерной стимуляции функциональной активности растений 169
3.4. Оценка устойчивости стимуляционного эффекта 185
3.5. Влияние лазерного излучения на адаптационные процессы сельскохозяйственных растений 200
3.6. Анализ результатов экспериментальных исследований 217
3.7. Выводы 226
4. Концепция управления функциональной актив ностью растений когерентным светом 228
4.1. Экспериментальное моделирование коммуникации клеток посредством биохемилюминесценции 230
4.2. Участие когерентных электромагнитных полей в управлении метаболизмом клетки 247
4.3. Биологическая структура как конвертер когерентного излучения 274
4.4. Голографическая модель индукции морфогенеза 285
4.5. Различия в рецепции клеткой высококогерентного и низкокогерентного света 293
4.6. Выводы 299
5. Системный подход к разработке прецизионных агротехнологий с использованием когерентного света 301
5.1. Расчёт критических значений параметров лазерных агротехно-логий 303
5.2. Оптимизация технологических параметров лазерной обработки плодов и растений 314
5.3. Методы и технические средства экспресс-диагностики функционального состояния растительных организмов 360
5.4. Особенности разработки лазерных облучательных установок сельскохозяйственного назначения 390
5.5. Социальные, экологические и экономические вопросы внедрения лазерных агротехнологий 406
5.6. Выводы 421
Заключение и общие выводы 423
Цитируемые источники информации 430
Приложения 498
- Анализ представлений о механизме биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения
- Анализ причин низкой воспроизводимости эффекта лазерной стимуляции растений
- Многомодальность ответной реакции различных биосистем, возбуждённых.когерентным светом
- Участие когерентных электромагнитных полей в управлении метаболизмом клетки
Введение к работе
Проблема продуктивности растениеводства на протяжении веков не теряет своей актуальности. Её решение ищут на двух взаимодополняющих уровнях регулирования биосистем - генетическом и эпигенетическом. Опыт сельскохозяйственного производства показывает, что в современных быст-роизменяющихся экологических условиях предпочтительными являются именно эпигенетические методы, заключающиеся в управлении экспрессией генов без изменения наследственной программы живого организма. Такой подход позволяет оперативно и более полно использовать генетический потенциал уже существующих культурных растений, добиваясь высокой продуктивности и устойчивости. На практике он реализуется посредством технологических приёмов, основанных на действии различных регуляторных факторов.
Перспективность применения в биорегуляторных целях электромагнитных полей (от ионизирующего до СВЧ диапазонов) обоснована И.Ф. Бородиным, Н.Д. Девятковым, В.М. Инюшиным, A.M. Кузиным, Л.Г. Прищепом, А.А. Шаховым и их научными школами. Наибольшей экологической безопасностью и технологичностью обладает излучение видимой области спектра - свет. У фотосинтезирующих растений он выполняет не только энергетические, но и важные регуляторные функции, управляя различными процессами, вплоть до экспрессии генов. В основе световой регуляции лежит резонансное поглощение фотонов специфическими хромопро-теидами, например, фитохромом и криптохромом высших растений. Фундаментальные работы Г. Мора (Н. Mohr), СВ. Конева, И.Д. Волотовского, Н.П. Воскресенской позволили установить пути трансформации светового сигнала в химический и его воздействие на метаболизм клетки. В целом, фо-торегуляторные процессы хорошо изучены, но до сих пор остаётся неясным, каким образом сверхслабые потоки фотонов биохемилюминесценции участвуют в межклеточной коммуникации, и чем обусловлена высокая биологическая эффективность когерентного, в частности лазерного, излучения.
Исследования, проведенные как в нашей стране, так и за рубежом, позволили установить, что низкоинтенсивное когерентное излучение (НКИ), в частности, генерируемое лазерами, обладает хорошо выраженным фоторегулятор-ным действием. Однако механизм явления до сих пор находится в центре острых дискуссий. Корнем противоречий служит различное понимание роли статистических (когерентных) свойств излучения при его взаимодействии с биологическими системами и структурами. На этот счёт существуют прямо противоположенные точки зрения, наиболее ярко представленные в работах В.К. Бьгховского [112], Г. Фрелиха [522], Н. Frohlich [589], F.-A. Рорр [645-650], F.-A. Рорр, К.Н. Li. [651], Н.Д. Девяткова и соавторов [187, 188] с одной стороны и В.В. Лобко и соавторов [346], Т.И. Кару и соавторов [282-284], Т.Й. Кару [279-281] с другой.
Отсутствие общепринятых представлений о механизме лазерной стимуляции не повлияло на широкое применение этого феномена в биологии, медицине и сельском хозяйстве. В растениеводстве использование когерентного света позволило улучшить экологическое состояние агроценозов, повысить количество и качество выпускаемой продукции, снизить затраты на её производство. Успешное внедрение лазерных агротехнологий (ЛАТ) началось в Советском Союзе ещё в семидесятые годы (обзоры и монографии [103, 255, 256, 504, 505, 544]. Положительные результаты были также получены в Австралии [643], Болгарии [470], Венгрии [615], Германии [612], Индии [597], на Кубе [587], Мексике [582, 606, 607], Польше [619, 620], Чехии [659], Японии [681] и в других странах. Накоплен значительный позитивный опыт, и, тем не менее, при практическом использовании биологический эффект лазерной обработки растений оказывается ниже ожидаемого и носит неустойчивый характер. Основная причина заключается в том, что при создании ЛАТ научно-методические, агротехнологиче-ские и инженерно-технические вопросы разрабатываются обособлено и недостаточно глубоко.
Таким образом, актуальная проблема создания экологически безопасных, энергосберегающих электротехнологий, повышающих количество и качество продукции растениеводства посредством лазерной обработки, требует системного подхода. Он заключается в анализе, научном обосновании и экспериментальной проверке комплекса физических, биологических и технологических факторов и процессов управления функциональной активностью растений когерентным светом. На основании такого понимания проблемы определено общее направление исследований, которому мы посвятили 28 лет своей работы. Их целью явилось изучение и теоретическое обоснование механизма биорегуляторного действия когерентного света, создание на этой базе комплекса новых, высокоэффективных способов, технологических приёмов и технических средств, обеспечивающих более полное использование генетического потенциала культурных растений.
В рамках сформулированной цели объектом исследований служили процессы взаимодействия когерентного электромагнитного излучения с биологическими системами и структурами, а предметом исследований - управление функциональной активностью растений когерентным светом в лабораторных условиях и агротехнологическом процессе. Реализация поставленной цели потребовала решения комплекса взаимообусловленных задач:
Разработать методологию, аналитический аппарат и технические средства исследования взаимодействия когерентного света с биологическими системами и структурами.
Исследовать закономерности ответной реакции растительных организмов на действие низкоинтенсивного лазерного излучения и дать им теоретическое обоснование.
Выяснить роль статистической упорядоченности фотонного коллектива в биорегуляторных процессах; разработать концепцию управления функциональной активностью растений когерентным светом.
Осуществить системный подход к разработке прецизионных лазерных аг-ротехнологий; провести оценку их эффективности и экологической безопасности.
Создать научно-техническую базу конструирования высокоэффективных лазерных установок для биологических исследований и сельскохозяйственного производства; провести выпуск и внедрение опытных образцов.
Общая характеристика работы. Представленная работа выполнена во ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им И.В.Мичурина в рамках отраслевых программ OCX. 04 «Разработать и внедрить методы, технологические процессы с использованием радионуклидов, источников ионизирующих излучений и других физических факторов (сельскохозяйственная радиология)»; «Плоды и ягоды» задание № 08.04.И1-М5 «Рабочие органы оборудования экологически чистых технологий обработки плодов, семян и посадочного материала перед посадкой и хранением»; федеральной программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК, задание № 19 «Разработать и освоить экологически безопасные ресурсосберегающие системы производства, переработки, хранения и доведения до потребителя- высококачественной продукции садоводства...», госрегистрация №01.200.204901; а также Соглашения о научной кооперации с институтом садоводства и овощеводства Рейнского университета по проекту «Исследовать влияние когерентного электромагнитного излучения на развитие адаптивных процессов живых организмов» и Международного проекта МНТЦ № 3360, раздел: «Влияние излучения внешних небиологических источников на физиологическую активность биологических объектов».
Для выявления наиболее общих закономерностей использовали разнообразный биологический материал, представленный 52 сортами 24 видов сельскохозяйственных культур. Облучению подвергали отдельные клетки, ткани, органы, целые растения и участки агроценозов. Их обработка проходила как в полевых, так и лабораторных условиях с применением камер ис-
кусственного климата. Источниками когерентного излучения служили газовые и полупроводниковые лазеры и лампы накаливания с монохроматором и коллимирующей оптикой. Параллельно с экспериментальными исследованиями проходила разработка специальных методов и технических средств облучения и функциональной диагностики растительных организмов.
Научная новизна исследований заключается в разработке и практическом использовании концепции управления функциональной активностью растений когерентным светом. Она углубляет современные представления о механизме взаимодействия низкоинтенсивного когерентного излучения (НКИ) с живыми организмами и служит теоретической базой для создания высокоэффективных способов, технологических приёмов и технических средств лазерной обработки растений. В процессе исследований получены следующие приоритетные результаты, послужившие научной базой концепции:
Определены основные противоречия, препятствующие пониманию механизма биорегуляторного действия когерентного света, и найдены пути их преодоления.
Разработаны методология, аналитический аппарат и технические средства исследования взаимодействия когерентного света с биологическими системами и структурами.
Установлены неизвестные ранее закономерности ответной реакции растительных организмов, имеющие принципиальное значение для понимания механизма лазерной стимуляции. Показана многомодальная, недозовая зависимость биологического эффекта от длительности облучения. Определены необходимые условия наибольшей выраженности реакции растений на когерентное излучение. Обнаружена трансгрессия (расщепление) количественных признаков в генетически однородной популяции растений, прошедших лазерную обработку и предложена эпигенетическая модель механизма длительного запоминания стимуляционного эффекта. Показан анти-стрессорный эффект при лазерном облучении плодовых культур. Обосно-
вана возможность стимуляции различных типов защитной реакции растительных организмов, а также повышения надёжности их функционирования в целом.
Сформулировано принципиально новое понятие «биологическая мера когерентности», вытекающее из установленной способности живых организмов различать степень статистической упорядоченности света. Впервые теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены биокоммуникационные функции когерентного излучения; показано его участие в индукции морфогенеза растительных тканей и дистанционном межклеточном взаимодействии. Высказаны представления о механизме лазерной стимуляции растений.
Обнаружено неизвестное ранее свойство фотосинтезирующих тканей, заключающееся в быстрой динамической перестройке микроструктурной организации под действием когерентного света. На базе выявленных закономерностей рассеяния лазерного пучка биоструктурами созданы способы диагностики функционального состояния растений, не имеющие аналогов в отечественной и зарубежной практике.
Разработаны и экспериментально апробированы следующие математические и физические модели, иллюстрирующие биорегуляторные функции низкоинтенсивного когерентного излучения:
аналитического описания многомодальной функции отклика биосистем;
дистанционного межклеточного взаимодействия;
регистрации когерентного компонента биохемилюминесценции клеток;
биологической меры когерентности действующего излучения;
аналитического решения ядерно-плазменного отношения клетки;
голографической индукции морфогенеза в культуре растительных клеток.
7. Осуществлён системный подход к разработке прецизионных лазерных аг-
ротехнологий, основанный на комплексном использовании физических, био
логических и технологических факторов и процессов управления функцио-
нальной активностью растений низкоинтенсивным когерентным светом. Показана экологическая безопасность применения ЛАТ.
8. Предложен и реализован блочно-модульный принцип конструирования лазерных облучательных установок и диагностических приборов для растениеводства. Методами инженерного моделирования и расчётов оптимизированы технические решения, обеспечившие надёжность и эффективность функционирования разработанных устройств.
Данные приоритеты защищены 10 авторскими свидетельствами, патентами и заявками на изобретения, 40 актами внедрения, двумя сертификатами международных выставок, 155 научными публикациями в отечественных и зарубежных изданиях.
Теоретические и экспериментальные исследования позволили дать научное обоснование лазерным агротехнологиям и показать эффективность их внедрения в растениеводство. Разработанная методология повысила воспроизводимость результатов биофизических экспериментов с применением когерентного света и устранила существующие противоречия в их толковании. Созданные способы, технологические приёмы и технические средства сократили применение химических защитных препаратов при производстве зерна, повысили сроки хранения и товарное качество плодов, увеличили ре-генерационную способность трудноукореняемых культур, расширили возможности количественной диагностики функционального состояния растений. В научную и производственную практику внедрены следующие разработки:
Методология облучения растений когерентным светом, основанная на количественном анализе энергетических и статистических характеристик действующего фактора.
Системный подход к разработке лазерных агротехнологий.
Способ вегетативного размножения растений (А.С. № 1157717).
Способ повышения сохранности плодов (Патент РФ № 1750487).
Способы и устройства экспресс-диагностики функционального состояния растительных организмов (Патенты РФ №2016671, №2222177, №2225691, заявки №2007121425/(023322), №2007139421/(043158), №2007104756/(005122), № 20007135704/(039042); № 2008115264/(017066).
Блочно-модульный принцип конструирования лазерных облучательных установок.
Многофункциональные установки серии ЛИК' (лазерный исследовательский; комплекс).
& Производственные установки, серии ЛОС (лазерный облучатель сельскохозяйственный):
. Проектно-конструкторская; документация передана в Инженерный Центр «Садпитомникмаш». Практическое применение выполненных научно-технических разработок: подтверждается актами' внедрениям от научно- ; исследовательских; организаций? и центров: 1ЩЩ. ВНИИС (Мичуринск); ВНИИСИК (Орёл);; ВНИЩиСК (Сочи); МНТК «Микрохирургия* глаза» (Тамбов); НПО «Биотехника», Аэрокосмосэкология; МЩ0С (Москва); Рейнский университет (Бонн,, Германия), а также медицинских учреждений; совхозов- колхозовщ фермерских хозяйств.Тамбовской, Липецкой, Саратовской; Московской; Ленинградской областей и Краснодарского^ края; (приложения 2 и 3). Результаты исследований вошли; в научно-тематические планы ВНИИ генетики № селекции плодовых растений; ВНИИ- садоводства; (Мичуринск); ВНИИ селекции* плодовых культур (Орёл); ВНИИ-1 цветоводства и субтропических культур (Сочи), Института садоводства и овощеводства Рейнского университета (Бонн;, Германия)-
Основные результаты; исследований доложены* лично; соискателем?; ш обсуждены на-заседаниях ученых советов итеоретических семинарах МГУ (факультеты биологии и;физики 1983, 1993; 2001), МГАУ (1985; 2006), НИШ биотехнологии (1990), ВНИИ? молочной промышленности (1994), ВНИИ: цветоводства и субтропических культур (1994, 1999; 2000), ВНИИ; селекции плодовых культур (1993; 1994), ВНИИ садоводства (1982,1993, 2001); Мич-
ГАУ (1992, 2005), Центра подготовки космонавтов (1994), Института химической физики РАН (1995), Управления приоритетных направлений фундаментальных исследований Министерства науки и технической политики РФ (1995), Рейнского университета (Бонн, Германия, 1995, 1997, 1999), Института прикладной физики этого же университета (1995, 1997), Исследовательского центра технологических лазеров (Ахен, Германия, 1997), Международного института биофизики (Ноис, Германия, 1999), а также на Всесоюзной конференции «Проблемы повышения эффективности современного садоводства» (Мичуринск, 1982), Всесоюзной конференции «Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности» (Львов, 1984), Всесоюзной школе «Применение лазеров в биологии» (Кишинев, 1986), Всесоюзной конференции «Проблемы прикладной радиобиологии растений» (Чернигов, 1990), Третьей Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной радиологии (Обнинск, 1990), Всероссийской конференции; «Прикладные аспекты радиобиологии» (Москва, 1994), International A.G. Gurwitsch Conference «Non-equilibrium and coherent systems in biophysics, biology and biotechnology» (Moscow, 1994), Международном симпозиуме «Механизм действия сверхмалых доз» (Москва, 1995), Tenth International Congress of Radiation Research (Wiirzburg, 1995, Germany), International Ecological Congress (Voronezh, 1996), Седьмой международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), 2 International AG Gurwitsch Conference «Biophotonics and Coherent Systems» (Moscow, 1999, Russia), Втором съезде биофизиков России (Москва, 1999), Четвёртом съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), Международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2000), Вторых Кузинских чтениях; (Пущино, 2001), Третьем съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), Четвёртом съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), Международной специализированной выставке «Laser 2005» (Москва, 2005), Международном семинаре «Лазеры в растениеводстве и ветеринарии» (Минск, 2005), Международной выставке «Фотоника» (Москва,
2007), International Conference on Laser Applications in Life Sciences (Moscow, 2007), Всероссийской конференции, посвященной 150-летию С.Ф.Черненко (Мичуринск, 2007), Втором межрегиональном совещании «Актуальные вопросы организации РЛИТЦ» (Москва, 2008) и других.
На защиту выносятся следующие основные положения.
Методология исследования взаимодействия когерентного света с биологическими системами и структурами. Закономерности ответной реакции растительных организмов на лазерное облучение дотепловой интенсивности. Нелинейный характер зависимости стимуляционного эффекта от продолжительности воздействия и условия его наибольшей выраженности. Влияние НКИ на повышение надёжности функционирования растений при воздействии различных дестабилизирующих факторов. Эпигенетический механизм лазерной стимуляции растений.
Концепция управления функциональной активностью растений когерентным светом: Роль когерентности света в фоторегуляторных процессах и закономерности его взаимодействия с биологическими структурами. Способность клеток различать статистическую упорядоченность оптического излучения и обоснование биологической меры когерентности электромагнитного поля.
Системный подход к разработке прецизионных агротехнологий* с использованием когерентного света. Экологическая безопасность применения'низкоинтенсивного лазерного излучения.
По теме диссертационных исследований опубликовано свыше 150 научных работ, включая две монографии общим объёмом более 40 печатных листов и 32 работы в международных изданиях на английском* и немецком языках. Более 20 работ опубликовано в, изданиях, рекомендованных ВАК. Объём* всех публикаций по теме исследований превышает 90f авторских печатных листов.
Декларация конкретного собственного вклада в разработку науч-ных.результатов, представленных.в.диссертации. Формулировка рабочих
гипотез, постановка задачи и планирование экспериментов, разработка физических и математических моделей проведены лично соискателем. Все экспериментальные исследования, технические устройства и установки выполнены самостоятельно или под его руководством и непосредственном участии. Анализ полученных результатов, формулировка положений и выводов диссертации, обоснование представленной концепции также сделаны лично соискателем. Более 60 авторских печатных листов опубликованных научных работ (68 % от общего объёма) написаны соискателем без соавторов, в остальных - доля его творческого участия превышает 30 %. В то же время проведенная работа носит комплексный характер и затрагивает различные научные дисциплины. Успех исследований во многом зависел от профессионализма творческого коллектива, принимавшего участие в проведении экспериментальных работ. Такой коллектив был создан и включал в себя высоко эрудированных специалистов в области биохимии, биотехнологии, физиологии, цитологии и селекции растений, а также программирования, электроники и инженерии. Их участие в проделанной работе отражено в совместных публикациях. Большая помощь оказана научными консультантами, беседы с которыми вселили уверенность в правильном выборе направления исследований, а их ценные замечания позволили избежать ряд ошибок на разных этапах работы. Высказать им персональную благодарность соискатель считает своим несомненным долгом.
Благодарность за оказанную помощь и поддержку. Соискатель выражает искреннюю признательность своему научному руководителю лауреату Правительственной и Государственной премий РФ, действительному члену РАСХН, доктору технических наук, профессору И.Ф. Бородину за ценные рекомендации, многолетнее внимание и поддержку, без которых настоящая работа не была бы оформлена в надлежащем виде. С огромной благодарностью восприняты консультации и замечания академика РАН Н.Д. Девяткова, члена корреспондента РАН A.M. Кузина, академиков РАСХН B.C. Шевелухи, В.А. Гудковского и Н.И. Савельева, профессоров В.А. Веселовского, Ф. Ленца
(F.Lenz), B.E. Перфильева, В.И. Тарушкина. Самые тёплые слова хочется ска
зать своим коллегам, проявившим интерес к исследованиям и принявшим в
них непосредственное участие: О.Н. Будаговской, И.А. Будаговскому,
С.А. Гончарову, Г.А. Гуди, Е.Б. Гульшиной, Р.П. Евсеевой,
Г.И. Мокроусовой, B.C. Мохно, С.А. Муратовой, Н.Г. Огиенко, З.В. Притула, Н.В. Соловых, Н.М. Туровцевой, И.Н. Чесноковой, Г.Я. Щербенёву, F. Lenz, В. Oertel, A. Ulbrich.
Анализ представлений о механизме биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения
С момента появления оптических квантовых генераторов (лазеров) биологическое действие их излучения стало предметом всестороннего анализа. Первая конференция, на которой рассматривали результаты экспериментальных исследований, состоялась уже в 1964 году [588]. В этот период основное внимание было уделено интенсивному излучению, приводящему к нарушению функционирования биологических систем и деструкции клеток [142, 257, 435, 441, 511]. Вскоре стало ясно, что не меньшее значение имеет стимуляция различных метаболических процессов, возникающая при использовании маломощных лазеров [190, 259, 260, 643]. Феномен вызвал большой интерес, но не получил удовлетворительного объяснения. В значительной степени это связано с разнообразием наблюдаемых ответных реакций.
Исследования, проведенные на животных и растительных организмах, показали, что низкоинтенсивное когерентное излучение лазеров или иных достаточно монохроматических источников света стимулирует синтез ДНК и РНК [235, 240, 282, 283, 464, 597]; изменяет структуру хроматина ядер [352, 513]; усиливает митотическую активность и пролиферацию клеток [143, 279, 492, 493, 488]; включает гены митотического оперона [352, 682] и стабилизирует работу генетического аппарата в целом [237, 240].
Серьезные перестройки происходят в мембранах клетки и субклеточных структур. Изменяются форма и размеры митохондрий [438]; увеличивается поверхность ядерной мембраны, а, следовательно, и ядерно-цитоплазматическое отношение [237, 332]; возрастают ионная проницаемость [7] и поверхностная активность [144] клеточных мембран, повышаются их адгезийные свойства [6]. Но самое главное, такое излучение вызывает конформационные изменения биомембран [189, 407], обуславливающие ход и характер многих жизненно важных процессов. Результатом фо-тоиндуцированных перестроек мембран является снижение интенсивности свободно-радикального окисления [237, 240], нормализация редокс-состояния клетки [280].
Особенно заметен антиоксидантный характер лазерного облучения в присутствии дестабилизирующих раздражителей, например ионизирующей радиации [158, 189]. Происходящую при этом активацию репарационных процессов наблюдали у клеток крови [242, 243], мозжечка [241], бактерий [136, 137], в соматических животных и растительных тканях [131, 165, 261]. Фотоиндуцированные адаптивные процессы могут проявляться и на иных структурных уровнях организма, повышая функциональную активность тканей мозга [235, 237], регулируя иммунные реакции в клетках селезенки [286] или мобилизируя антистрессорные механизмы растений, животных и человека [158, 244]. Приведенный перечень отражает лишь малую часть модулированных лазерным облучением биологических процессов. Он может быть дополнен обзорами [447, 461], а также монографиями [336, 380, 516].
Попытка найти единый фотоакцептор, ответственный за все эти стиму-ляционные эффекты, закончилась неудачей. Анализ спектров действия монохроматического света выявил целый ряд хромофоров и хромофорных групп, способных поглощать лазерное излучение соответствующих длин волн. По данным различных исследователей, на такую роль претендуют: оксигемогло-бин [206]; флавины [234, 281, 284, 286, 491]; соединения порфириновой группы [144, 282, 283], в частности, каталаза [236, 237], цитохромоксидаза [158, 281], цитохром d [491]; молекулы кислорода [280]; фитохром растений [114, 115,332,505,544].
Механизмы фоторегуляции животных и растительных клеток имеет много общих черт, несмотря на то, что в роли акцепторов квантов света могут выступать различные хромофоры. Возбуждение этих соединений способствует запуску первичных (световых) процессов, которые затем трансформируются в долгосрочное изменение функциональной активности соответствующих биосистем. В большинстве работ подчёркивают необходимость достаточно высокой монохроматичности действующего излучения. При ди-хромном или широкополосном облучении эффект снижается, а в случае белого света может отсутствовать вовсе. Биорегуляторные свойства монохроматического излучения нашли широкое применение. На этой базе разработано несколько концепций механизма лазерной стимуляции. Каждая из них по-своему ценна и интересна, но говорить о решении данной проблемы пока преждевременно. Высказанные представления имеют серьёзные взаимные противоречия и, как правило, слабое, одностороннее обоснование. Рассмотрим наиболее популярные точки зрения.
Оригинальная гипотеза предложена В.М. Инюшиным [255, 261]. Согласно его представлениям акцептором лазерного излучения является биоплазма клетки: «Мы полагаем, что основным матриксом, резонирующим на воздействие монохроматическим когерентным излучением, является. биоплазма» [261, с. 43]. В результате взаимодействия происходит «энергетическая накачка» организма и стимуляция его функций. Сама же биоплазма представляется «...электронно-дырочной и экситонной плазмой, которая локализована в мембранных структурах, в том числе и митохондриях» (там же, с. 55). Её основные свойства «...упорядоченность, необычайная устойчивость при насыщенности энергией» (там же, с. 57). Несмотря на теоретические построения, объясняющие «неизвестное через непонятное», в экспериментальных исследованиях В.М. Инюшина и его соавторов есть много важных моментов. Одними из первых они показали большую биологическую эффективность когерентного и поляризованного света, чем некогерентного, точнее, низкокогерентного [259]. Ими высказано предположение и приведены косвенные экспериментальные доказательства высокой когерентности излучения, осуществляющего полевые (нехимические) контакты клеток [261]. При участии В.М.Инюшина обнаружен эффект усиления дистанционного взаимодействия в больших массах облучённых лазером семян и предложена оригинальная методика исследования этого феномена [505].
Глубокое и всестороннее изучение фотоиндуцированных процессов в клетке проведено А.А. Шаховым. Им обоснованы представления о новом научном направлении — фотоэнергетике растений, «... которое изучает трансформацию энергии света в клетке и световое управление растением» [543, с. 5]. Конференции по этой тематике на долгие годы стали координационным центром, объединившим сотни специалистов по теоретическим и прикладным вопросам фотобиологии, а также смежных с ней дисциплин.
А.А. Шаховым предложена полифункциональная концепция биологического действия света, определяющая взаимосвязь и взаимовлияние фотосинтетических и фоторегуляторных процессов растительных организмов. Большое внимание в ней уделяется нефотосинтетической ассимиляции световой энергии: «... одним из механизмов бесхлорофильного запасания световой энергии следует считать повышение скорости фосфорилирования в митохондриях под влиянием света. Это приводит на какое-то время к накоплению световой энергии на уровне дыхательной цепи в ходе протекающего при этом фотометаболизма» [544, с. 145]. Экспериментальные исследования позволили установить участие фитохромной регуляции в биогенезе мембран и синтезе митохондрий. У последних под действием света повышается активность окислительного фосфорилирования и увеличивается количество АТФ. Важная роль в концепции А.А.Шахова отводится фитохрому. Благодаря его локализации на плазмалемме, митохондриях, эндоплазматическом ретикулу-ме, клеточных ядрах и хлоропластах, становится возможной фоторегуляция самых разнообразных процессов, вплоть до экспрессии генов. С этих же позиций рассматривается и механизм лазерной стимуляции растений. Несмотря на упоминание об уникальных свойствах излучения ОКГ (лазеров): когерентности и монохроматичности, их роль в фоторегуляторных процессах осталась нераскрытой. В тоже время большое внимание А.А.Шахов уделил воздействию света на генетический аппарат клетки. Им было показано, что низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает устойчивые (наследуемые) изменения фенотипических признаков организма [544].
Анализ причин низкой воспроизводимости эффекта лазерной стимуляции растений
Причины, препятствующие пониманию механизма лазерной стимуляции растений, носят, в основном, методический характер и связаны с недостаточно корректной оценкой параметров действующего фактора, функционального состояния облучаемого организма, условий его жизнедеятельности. Без этого невозможно получить достоверные результаты исследований и использовать их в практических целях. Наибольшие затруднения вызывают три группы вопросов:
Первая - связана с оценкой энергетического баланса растения. Увеличение его функциональной активности требует дополнительного расхода энергии и метаболитов, поступающих из внешней среды. При их дефиците нельзя ожидать от регуляторного фактора существенного усиления обменных процессов. Подтверждением служит большая выраженность стимуляционного эффекта именно у ослабленных организмов с невысоким уровнем обменных процессов [1, 72, 73]. Их ограниченные потребности будут удовлетворены даже в тех условиях культивирования, при которых интенсивно развивающиеся растения столкнутся с недостатком питания.
Среди различных характеристик жизнедеятельности растений одной из самых консервативных является полезная продуктивность. При лазерном облучении она редко возрастает более чем на 30 %. Здесь опять-таки среда обитания выступает лимитирующим фактором. Формирование урожая требует значительных энергетических затрат. Без их восполнения любой процесс, и особенно репродуктивный, будет иметь меньше возможностей для своего развития. В условиях дефицита питания, в котором часто оказываются куль тивируемые растения, действие стимуляторов становится малоэффективным. Таким образом, лазерная обработка целесообразна лишь при достаточно высоком уровне агротехники или низкой функциональной активности растений, обусловленной влиянием неблагоприятных факторов. Оптимизировать энергетический баланс производства продукции растениеводства позволяет разработанная И.И. Свентицким методология оценки эксэргии [450, 453].
Вторая группа вопросов вытекает из упрощённых представлений об объекте облучения. В литературе часто приводят какой-то определённый режим лазерной обработки сельскохозяйственных культур. Однако на практике он не всегда оказываются эффективным. Растения, как сложные самоорганизующиеся системы, находятся в динамическом равновесии со средой обитания. Их реакция на какой-либо раздражитель зависит как от внешних условий, так и внутреннего состояния организма, определяемого программой индивидуального развития. Ответ на одно и то же воздействие может иметь различные проявления. Поэтому нецелесообразно искать универсальные, подходящие к любой ситуации режимы лазерной стимуляции.
Оптимизация режимов облучения требует установления корреляций между показателями жизнедеятельности организма и параметрами действующего на него лазерного излучения. Следует отметить, что в медицине лазерная терапия пошла именно этим путём и достигла хороших результатов [224-227]. Аналогичные разработки применяются теперь и в сельском хозяйстве [33].
Для создания научно-обоснованных лазерных агротехнологий необходима адекватная оценка функционального состояния растений и знание основных закономерностей биорегуляторного действия когерентного света. Достигнуть такого уровня в практических исследованиях пока не удаётся. Выбор режимов облучения происходит на основе обобщения разрозненных эмпирических данных и носит случайный характер. Примером могут служить противоречивые рекомендации по предпосевной обработке зерна, рассмотренные в первой главе.
Третья группа вопросов затрагивает метрологические аспекты. Кажущаяся простота применения лазеров служит источником разнообразных методических и метрологических ошибок. Генерация когерентного излучения является сложным физическим процессом, а возникающее при этом электромагнитное поле имеет нетривиальное аналитическое описание. В биологической литературе, посвященной лазерной стимуляции, редко приводят корректное описание параметров действующего фактора. По представленным данным не удаётся воспроизвести режимы облучения, что обесценивает сообщаемую информацию. Типичны следующие ошибки:
Указание только дозы облучения, видимо, по аналогии с традиционными методами анализа ионизирующих излучений. Однако дозу нельзя считать обоснованным параметром лазерной обработки растений. Многие регулятор-ные процессы не подчиняются дозовому закону Бунзена-Роско. Проведенные на различных организмах исследования показали, что при одной и той же дозе (плотности дозы) величина эффекта может существенно меняться в зависимости от конкретных значений длительности и интенсивности облучения [83, 89, 226, 573]. Поэтому распространённое в биологических исследованиях представление лазерного феномена в координатах «Доза - Эффект» приводит к невоспроизводимым результатам. Необходимо указывать каждый из сомножителей дозы в отдельности.
Часто вместо экспериментально определённой величины мощности генерации лазера сообщают её паспортное значение или ограничиваются указанием количества циклов облучения, проведенных на такой-то установке. Большинство используемых в биологических экспериментах лазеров не стабилизировано по мощности. В этих моделях она подвержена самопроизвольным изменениям вследствие целого ряда процессов, влияющих на режим генерации когерентно-го излучения («жесчение» газа в гелий-неоновых лазерах, неравномерность накачки, «выгорание» зеркал, тепловая или механическая расстройка резонатора и др.). Реальная величина мощности может в несколько раз отличаться от паспортного значения и её необходимо постоянно контролировать.
Многомодальность ответной реакции различных биосистем, возбуждённых.когерентным светом
Для сравнительного анализа ответной реакции различных биосистем выбраны объекты, имеющие широкое морфофизиологическое разнообразие и практический интерес: пыльца, семена, плоды, черенки, вегетирующие растения и культура тканей in vitro сельскохозяйственных растений. Основной задачей эксперимента являлось выявление многомодальной формы зависимости стимуляционного эффекта от длительности лазерного облучения. Критерием многомодальности может служить наличие чередующихся максимальных и минимальных значений результативного признака при статистически значимых различиях между ними.
У пыльцы экстремальные значения ответной реакции хорошо выражены (рис. 3.1 А; 3.3; 3.4). Так, например, в случае вишни пенсильванской (рис. 3.1 А) различия между максимумами и минимумами стимуляционного эффекта существенны (доверительный уровень Р 0,99). Расчётное значение критерия Фишера при однопроцентном уровне значимости также много больше критического (Fp = 31,6 »FKp = 7,9). Минимальные значения, наоборот, практически не отличаются от контроля, и имеет место высокий уровень значимости нулевой гипотезы (а 0.16).
Интерес представляет сравнение экстремальных значений лазерной стимуляции со средним значением прорастания пыльцы. Его рассчитывали усреднением результата действия всех 99 режимов, использованных в эксперименте. Оказалось, что значения результативного признака как в максимумах, так и минимумах стимуляции отличаются от средней величины с надёжностью более 95 %, т.е. Р 0,95. Само же среднее значение стимуляции с ещё большей вероятностью отличается от контроля (Р 0,999). Всё это указывает на многомодальность зависимости биологического эффекта от длительности лазерного облучения пыльцы.
Для исследования влияния когерентного излучения на функциональную активность зерновых культур использовали семена (зерновки) овса сорта Горизонт, пшеницы сортов Мироновская 808 и Тамбовица, ячменя - гибрид сорта Дворан. Лазерное облучение семян проходило в чашках Петри, где они располагались одним слоем без взаимного перекрытия.
В экспериментах с пшеницей сорта Тамбовица был выбран следующий экспозиционный ряд: 0,1; 0,5; 1; 2; 30; 60; 120 и 240 секунд при плотности мощности 1,6Вт/м . Культивирование семян проходило в открытых чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге. Общее количество вариантов опыта-9. Число повторностей - 5. В каждой повторности каждого варианта - 50 семян. На третьи сутки определяли энергию прорастания (долю проросших семян), а на седьмые - длину первого листа.
Энергия прорастания семян пшеницы в контроле превысила 95 %. Как было отмечено во второй главе, при столь высокой всхожести данную характеристику нельзя использовать для оценки стимулирующего воздействия. В качестве результативного признака выбрана длина первого листа. Предпосевное лазерное облучение семян достоверно ускорило рост надземных органов (рис. 3.5).
Установлены две области экстремальных значений в разных временных диапазонах: доли секунды (максимум - 0,5 с) и десятки секунд (максимум - 60 с). Средствами дисперсионного анализа определена существенность различий между чередующимися максимумами и минимумами стимуляци-онного эффекта. По отношению к ним уровень значимости нулевой гипотезы пренебрежимо мал {а « 0,001), а расчётное значение критерия Фишера превосходит критическую величину при доверительном уровне Р = 0,99: Fp = 16,7 »FKp = 6,8. Из этого можно заключить, что лазерная стимуляция ранних этапов онтогенеза зерновых культур имеет многомодальный характер зависимости от длительности облучения.
Участие когерентных электромагнитных полей в управлении метаболизмом клетки
Свойства живых организмов допускают возможность реализации коммуникационного процесса посредством электромагнитных полей оптической области спектра. Основанием для этого вывода служат следующие хорошо известные факты. Многие биохимические реакции инициируются квантами света или сопровождаются излучением-в видимой области спектра. Фотобиологические процессы играют важную роль в различных цепях управления, вплоть до экспрессии генов [307, 578, 621].
Клетки обладают специальными фотоакцепторами - фитохромом (ФХ), криптохромом (КХ), цитохромом (ЦХ), родопсином и др., возбуждение которых приводит к активации регуляторных систем организма. Примером могут служить фототаксис бактерий, фотоморфогенез и фотопериодизм растений, ретинальные процессы высших животных. В том же диапазоне, что и спек тры действия этих реакций, наблюдают биохемилюминесценцию - сверхслабое свечение клеток, вызванное их жизнедеятельностью [29, 126, 218, 483]. Из целого ряда работ следует, что в фоторегуляторных процессах может участвовать не только солнечный свет, но и собственное излучение живых организмов [86, 290, 323, 579, 632, 649, 668]. Однако механизм действия такого канала регуляции биосистем остаётся не ясным. В первую очередь это связано с чрезвычайно низкой интенсивностью биохемилюминесценции клеток. На фоне более мощной стохастической помехи, которой является естественная освещённость, слабые сигналы будут надёжно детектироваться лишь при их достаточной когерентности [19]. Тогда необходимым условием передачи регуляторных сигналов посредством эндогенного излучения является его статистическая упорядоченность.
Теоретические [112, 564, 645, 647, 650, 651] и экспериментальные [566, 634, 651] исследования позволяют с уверенностью говорить, что под действием стохастических факторов биополимеры в конденсированной фазе способны к образованию кооперативных возбужденных состояний, релакси-рующих с излучением когерентных фотонов. Световые потоки с низкой интенсивностью, но высокой статистической упорядоченностью были зарегистрированы физическими детекторами во время установления коммуникационных отношений между химически изолированными организмами [668]. На фоне естественной освещённости у различных растений обнаружен когерентный компонент люминесценции листьев [563, 645, 653].
Выше было показано, что наличие нерегулярного фазового экрана в канале оптической связи химически изолированных биосистем препятствует межклеточному взаимодействию. Это свидетельствует об определенной статистической упорядоченности светового потока, выполняющего коммуникационную функцию. Следует предположить, что для передачи регуляторных сигналов посредством хемилюминесценции клетки должны не только генерировать когерентное излучение, но и различать его по степени статистической упорядоченности.
Влияние когерентности света на фотобиологические процессы отмечают в ряде работ [23, 44, 206, 337, 355]. Эксперименты Н.Д. Девяткова и соавторов показали, что «...по амплитуде электрофизиологической реакции поляризованный когерентный свет оказался эффективнее поляризованного некогерентного в 1,5 раза, неполяризованного некогерентного в 1,7 раза» [190, с. 146]. В работах С.Н. Маслоброда [355], Ю.Д. Березина и соавт. [44], И.М. Байбекова и соавторов [23], СМ. Зубковой и соавт. [239, 240] приводятся данные, свидетельствующие о большей биологической эффективности высококогерентного, в частности лазерного излучения, в сравнении со стохастическим (низкокогерентным). При этом не возникает никаких новых явлений, качественно выходящих за рамки обычных фотобиологических процессов. Весьма показателен вывод, сделанный СМ. Зубковой и Л.В. Михайлик [238, с. 9] при анализе функциональной активности животных клеток: «воздействие некогерентным излучением как ИК-, так и красной области спектра одинаково по характеру с лазерным излучением тех же диапазонов, но менее эффективно». Аналогичный результат получен и Е.Б. Петровым [404].
Существует и противоположная точка зрения, отрицающая способность клеток реагировать на когерентность действующего излучения [143, 144, 283, 284, 346, 551]. В основу приведенной аргументации положено сравнение биологического действия лазерных и тепловых или газоразрядных источников света. У последних с помощью различных монохроматоров (интерференционных светофильтров, дифракционных решеток и т.п.) вырезали узкую спектральную линию шириной ЛЛ = 8... 14 нм с максимумом на длине волны генерации лазера. Такое излучение называли «монохроматическим некогерентным» [6, 285] или «некогерентным красным светом» (АЛ = 8,5 нм; 633 нм) [144], (ZU=14HM; 633 НМ) [284, 346], «некогерентным синим светом» (ZU = 28HM; 454 нм) [492], «узкополосным красным светом» {ЛЯ = 14 нм; 633 нм) [282], а лазерное- «когерентным». Естественно, что во всех экспериментах энергетические характеристики лазерного и нелазерного источников света тщательно выравнивали. Подобные определения и вытекающие из них методические подходы стали весьма популярны в фотобиологических исследованиях.
Близкие по смыслу результаты были получены как на животных, так и растительных организмах. Например, на усиление антиокислительной активности в раневых тканях крыс «... когерентное излучение лазера и некогерентное излучение светодиода оказали приблизительно одинаковое действие» [295, с. 339].
Электрическая реакция листьев огурца при воздействии излучения гелий-неонового лазера (632,8 нм) и светового пучка, полученного от галогенной лампы с помощью узкополосного светофильтра (Ятах= 632 нм; /1/1 = 8,5 нм) «...не различалась в пределах ошибки» [551]. На основании сходства эффектов фотостимуляции при использовании излучения двух типов источников сделан-вывод: «Результаты экспериментальных работ, в которых проводилось корректное сравнение воздействия» когерентного и некогерентного света на биообъекты, свидетельствуют о том, что когерентность света действительно несущественна» [346, с. 370]. Данный вывод нельзя считать обоснованным, т.к. он следует из допущения, что квазимонохроматическое излучение нелазерных источников света не обладает когерентностью. Для правильной интерпретации- экспериментальных данных необходимо перейти от качественных оценок к количественным.
