Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Микробиоценоз пищеварительного тракта. Общие представления 11
1.2 Микробиоценоз пищеварительного тракта кроликов 14
1.3 Копрофагия у кроликов 16
1.4 Стратегии размножения и материнское поведение у млекопитающих 19
1.5 Материнское поведение, механизмы влияния матери на рост и развитие крольчат. Взаимодействия детенышей с матерью в ранний период онтогенеза 20
1.5.1 Особенности размножения, материнского поведения и молочного вскармливания кроликов 21
1.5.2 Использование особенностей полового и материнского поведения кроликов при их разведении в кролиководческих хозяйствах и на фермах 28
1.5.3 Влияние кормящей самки на развитие микробиоценоза пищеварительного тракта крольчат 30
1.6 Симбионтное пищеварение в слепой кишке кроликов и его развитие в онтогенезе 34
1.6.1 Морфологическое развитие слепой кишки в онтогенезе 34
1.6.2 Изменения симбионтного пищеварения в слепой кишке в препубертатный период 37
1.7 Пробиотики для кроликов 40
1.7.1 Современное состояние и перспективы развития концепции «Пробиотики» 40
1.7.2 Влияние пробиотиков на кроликов 47
Глава 2 Материал и методика 49
2.1 Рабочие гипотезы и общая схема проведения экспериментов 49
2.2 Оценка роста и развития крольчат при разных экспериментальных воздействиях 52
2.2.1 Влияние длительного содержания с матерью на рост крольчат 53
2.2.2 Влияние присутствия матери на рост крольчат (без непосредственного контакта с ними) 53
2.2.3 Влияние на рост крольчат подкладывания в клетку мягких фекалий взрослых самок 54
2.2.4 Выделение из мягких фекалий крольчих симбионтных микроорганизмов, разработка опытных пробиотических кормовых добавок и изучение их влияния на рост крольчат 54
2.2.4.1 Влияние выделенного штамма Е. faecalis Rb на рост крольчат при добавлении бактерий в рацион молодняка 57
2.2.4.2 Влияние ассоциации пробиотического штамма В. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Е. faecalis Rb и ассоциации В. subtilis В-8130 с коллекционным штаммом E.faecium В-8251 нарост крольчат 59
2.3 Симбионтные инфузории мягких фекалий кроликов 62
2.4 Контакты крольчат с мягким калом лактирующих самок 62
2.5 Распознавание крольчатами запаха мягкого кала матери и другой самки 63
2.6 Индивидуальное распознавание крольчат взрослыми кроликами по запаху мочи 64
2.7 Стресс-реактивность крольчат в условиях мягкого стресса 67
2.8. Анализ наблюдений за поведением крольчат в группах 68
2.8.1 Общая схема проведения экспериментов. Этограмма крольчат и матери 68
2.8.2 Анализ возрастной динамики типов активности крольчат и матери 72
2.8.3 Анализ синхронизации поведения кроликов в группах 73
2.8.4 Анализ взаимодействий крольчат и матери 76
Глава 3 Результаты исследований 78
3.1 Влияние матери на рост крольчат в препубертатный период 78
3.1.1 Влияние длительного содержания с матерью на рост крольчат 78
3.1.2 Влияние комплекса сигналов матери (визуальных, акустических обонятельных) на рост и сохранность крольчат 79
3.1.3 Влияние подкладывания в клетку мягких фекалий взрослых самок на рост крольчат 81
3.2 Поведение крольчат в группах (без матери): взаимодействие с мягким калом кормящих самок 82
3.3 Распознавание крольчатами запаха мягкого кала матери и другой самки 84
3.4 Симбионтные инфузории мягких фекалий кроликов 84
3.5 Выделение пробиотических бактерий-микросимбионтов мягкого кала кроликов и изучение их влияния в составе кормовых добавок на рост крольчат 87
3.5.1 Характеристика выделенного штамма Е. faecalis Rb 88
3.5.2 Влияние культуры Е. faecalis Rb в составе пробиотической кормовой добавки на рост крольчат 89
3.5.3 Влияние ассоциации пробиотического штамма В. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Е. faecalis Rb нарост крольчат 91
3.5.4 Влияние ассоциации штамма В. subtilis В-8130 с коллекционным штаммом Е. faecium В-8251 на рост крольчат 95
3.6 Сохранность молодняка в опытах по изучению роста крольчат при различных экспериментальных условиях 97
3.7 Формирование индивидуального запаха в онтогенезе у кроликов 98
3.8 Стресс-реактивность крольчат при содержании с матерью и без нее 101
3.9 Поведение крольчат в группах при содержании с матерью и без нее 102
3.9.1 Описание поведения матери и крольчат в препубертатный период 102
3.9.2 Соотношение типов активности в поведении крольчат и матери. Возрастная динамика 106
3.9.3 Синхронизация поведения в группах. Роль крольчат как инициаторов синхронного поведения и ее связь с иерархическим статусом крольчонка в группе 111
3.9.4 Взаимодействия крольчат друг с другом и с матерью 116
Обсуждение результатов 121
Выводы 133
Список литературы 135
Приложение 1 Возрастная динамика поведения крольчат в группе Г1 (без матери) 156
Приложение 2 Возрастная динамика поведения крольчат в группе Г2 (без матери) 159
Приложение 3 Возрастная динамика поведения крольчат в группе ГЗ (с матерью) 162
Приложение 4 Возрастная динамика поведения крольчат в группе Г4 (с матерью) 166
Приложение 5 Возрастная динамика поведения крольчат в группе Г5 (с матерью) 170
- Особенности размножения, материнского поведения и молочного вскармливания кроликов
- Влияние ассоциации пробиотического штамма В. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Е. faecalis Rb и ассоциации В. subtilis В-8130 с коллекционным штаммом E.faecium В-8251 нарост крольчат
- Влияние ассоциации пробиотического штамма В. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Е. faecalis Rb нарост крольчат
- Взаимодействия крольчат друг с другом и с матерью
Введение к работе
Актуальность темы. Особенности взаимодействия матери и детенышей на разных стадиях онтогенеза имеют существенное значение для понимания механизмов формирования видоспецифических и индивидуальных характеристик физиологии и поведения взрослых особей (Крученкова, 2002). У грызунов и зайцеобразных эти процессы хорошо изучены в период молочного вскармливания.
Выделяют две основные (г- и К-) стратегии размножения животных (MacArthur, Wilson, 1963, 1967). В естественной среде обитания и в условиях промышленного разведения кроликов можно отнести к г-стратегам - для них характерны быстрые темпы размножения и незначительный родительский вклад в выращивание потомства. Крольчата, как правило, остаются с матерью до 30-45 дневного возраста. Однако согласно одной из систем выращивания («акселерационный метод») крольчат содержат с матерью до трехмесячного возраста. При содержании с матерью до трех месяцев крольчата набирают массу тела быстрее, чем отсаженные в возрасте 30—45 суток, выживаемость молодняка существенно увеличивается (Михайлов, 1991, 2003). При этом родительский вклад матери в воспитание потомства заметно возрастает, а число рожденных детенышей в год на одну самку снижается, т. е., по сути, кроликов превращают из г- в К-стратегов. Механизмы влияния матери на рост детенышей в препубертатный период (от одного до трех месяцев) не изучены и представляют теоретический и практический интерес, поскольку время адаптации детенышей после отъема от матерей характеризуется повышенным риском заболеваний желудочно-кишечными инфекциями и высокой смертностью.
Становление кишечного микробиоценоза в онтогенезе в период перехода с молочной на смешанную диету представляет собой важный этап в развитии крольчат, при этом определяющее значение для их дальнейшего нормального роста и развития принадлежит передаче симбионтных бактерий детенышам от матери (Abecia et al., 2007). Нами выдвинуто предположение, что микрофлора кишечника крольчат в возрасте одного месяца еще полностью не сформирована и не стабильна, и попадание симбионтных бактерий в кишечный тракт крольчат с мягким пометом матери стимулирует их ускоренное развитие в препубертатный период при длительном совместном содержании.
Поведенческие взаимодействия матери и детенышей в препубертатный период также могут быть механизмом, оказывающим влияние на рост и развитие молодняка кроликов. Определенную роль при этом могут играть визуальные, звуковые и обонятельные сигналы. Известно, например, что искусственный аналог материнского феромона свиней снижает агрессивность поросят после их отъема от матерей (Pageat,
Teisier, 1998), а также стимулирует пищевое поведение молодняка, что увеличивает массу
тела животных (McGlone, Anderson, 2002). В связи с этим актуальна экспериментальная проверка различных способов влияния матери на рост и развитие крольчат в препубертатный период, что в определенной степени и осуществлено в данной работе.
Цель работы. Изучение механизмов влияния матери на рост и развитие крольчат в препубертатный период и разработка научных основ стимуляции роста и повышения выживаемости молодняка.
Задачи исследования:
-
Оценка влияния присутствия матери и комплекса ее сигналов (визуальных, акустических, обонятельных) на рост и сохранность молодняка.
-
Исследование способности кроликов индивидуально опознавать особей своего вида по запаху мочи и мягких фекалий.
-
Анализ способов передачи симбионтных бактерий матери крольчатам в препубертатный период.
-
Выделение из мягкого помета лактирующей крольчихи симбионтных микроорганизмов и изучение их влияния на рост и развитие детенышей.
5. Разработка биологически активных добавок, способов их применения и оценка
влияния на рост и развитие молодняка.
6. Оценка роли матери в регуляции поведенческих взаимодействий молодняка.
Научная новизна. В работе впервые изучены механизмы влияния матери на
сохранность, рост и развитие крольчат в возрасте от одного до трех месяцев (препубертатный период) с использованием комплексного подхода, предполагающего анализ различных поведенческих составляющих такого воздействия, а также связанных с влиянием матери на кишечную микрофлору крольчат.
Установлено, что присутствие матери, как непосредственное, так и без прямого контакта с детенышами, обеспечивает высокую сохранность молодняка в возрасте от двух до трех месяцев, в значительной степени за счет выживания мелких крольчат.
Показано, что детеныши в возрасте одного и двух месяцев активно контактируют с подложенным в клетку мягким калом лактирующих самок, что способствует поступлению в их организм кишечных микросимбионтов матери. Установлено, что крольчата способны по запаху мягкого кала отличать мать от других кормящих самок.
Из мягких экскретов лактирующей крольчихи выделен штамм бактерий Enterococcus faecalis Rb, обладающий пробиотическими свойствами, введение его в рацион крольчат привело к ускоренному росту молодняка. Предложено перспективное направление в разработке новых пробиотических препаратов, введение которых в рацион
молодняка позволит частично компенсировать отсутствие матери.
Составлена этограмма крольчат и матери в препубертатный период, включающая 78 образцов поведения (в т. ч. 23 образца поведения, связанных с взаимодействием крольчат и матери). Показано, что мать оказывает влияние на соотношение типов активности в поведении крольчат, играет роль в синхронизации поведения молодняка, а также может совершать активные действия, направленные на подавление проявлений агрессии у детенышей. Установлено, что питание молоком матери (сосание) сохраняется, по крайней мере, до трехмесячного возраста крольчат.
Теоретическая и практическая значимость. Благодаря использованию комплексного подхода изучены фундаментальные вопросы влияния матери на рост и развитие крольчат в препубертатный период. Несмотря на то, что в природе и при современных системах промышленного кролиководства крольчата остаются с матерью до одно- или полуторамесячного возраста, полученные данные представляют теоретический интерес, т. к. раскрывают потенциальные возможности и механизмы влияния крольчихи-матери на рост, развитие и сохранность молодняка. В настоящей работе показана возможность частичной компенсации отсутствия матери с помощью включения в рацион крольчат пробиотических препаратов на основе бактерий (Е. faecalis Rb), выделенных из мягкого кала лактирующей самки. Были приготовлены опытные пробиотические кормовые добавки «Биогеркулес-1» (содержит Е. faecalis Rb), «Биогеркулес-2» (Е. faecalis Rb и пробиотический штамм Bacillus subtilis В-8130) и «Биогеркулес-3» (коллекционный штамм Е. faecium В-8251 и В. subtilis В-8130), введение которых в рацион крольчат приводило к ускоренному росту молодняка.
Материалы работы используются при проведении занятий со студентами ВУЗов: ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет», ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К. А. Тимирязева».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 5 в журналах из списка ВАК.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных съездах, конгрессах и конференциях: Международных совещаниях - VIII и IX съездах Териологического общества «Териофауна России и сопредельных территорий», г. Москва в 2007 и 2011 гг.; 11, 14 и 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых, г. Пущино в 2007, 2010 и 2011 гг.; Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», г. Саратов в 2007 г.; X Международной научно-практической конференции «Живые объекты в условиях антропогенного пресса», г. Белгород в 2008 г.; Международной конференции «Современные проблемы охраны и рационального
использования биоразнообразия животного мира», г. Кишинэу, Республика Молдова в 2011 г.; Конференции молодых сотрудников и аспирантов ИПЭЭ им. А. Н. Северцова «Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых», г. Москва в 2006, 2008 и 2010 гг.; IV Всероссийской конференции по поведению животных, г. Москва в 2007 г.; 2-й научной конференции «Поведение и поведенческая экология млекопитающих», г. Черноголовка в 2009 г.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав и выводов. Текст диссертации изложен на 173 страницах, включая 24 рисунка, 24 таблицы и 5 приложений. Список литературы включает 72 работы на русском и 127 работ на иностранных языках.
Особенности размножения, материнского поведения и молочного вскармливания кроликов
Материнское поведение кроликов исследуется с конца 50-х годов прошлого века (Ross et al., 1956; 1963; Denenberg et al., 1958, 1959, 1963a, b) и в настоящее время детально изучено (Котенкова и др., 2010). Исследованы образцы гнездостроительного и материнского поведения, роль гормонов в проявлении того или иного образца поведения, анализ особенностей этого типа поведения нашел применение в практике промышленного и любительского разведения кроликов. Стереотип материнского поведения кроликов рассматривается исследователями как нетипичный для незрелорождающих млекопитающих, но крайне эффективный и рациональный. В отличие от большинства видов млекопитающих, крольчихи проводят с детенышами в период выкармливания очень мало времени, редко кормят их молоком, не согревают в гнезде и не перетаскивают в зубах (Ross et al., 1959; Hudson et al., 2000; Gonzalez-Mariscal, McNitt, Lukefahr, 2007). В то же время и поведение крольчат крайне специализировано и прекрасно соответствует достаточно специфическому поведению матери. Подчеркивается три характерные черты материнского поведения этих животных: 1) стереотипность и независимость проявления от условий окружающей среды или содержания в искусственных условиях; 2) мало подверженный влиянию внешних факторов циркадный ритм поведенческих и физиологических реакций и изменений, происходящих в течение 24-часового дня, регулируемый эндогенно; 3) тесная координация приуроченности к определенному времени физиологических процессов и поведения матери с таковыми детенышей (Hudson et al., 2000). На основании сравнения результатов исследований материнского поведения диких и разных пород домашних кроликов сделан вывод о том, что в результате относительно недавней доместикации (400 лет назад) стереотип этого типа поведения у них мало различается (Gonzalez-Mariscal et al., 2007). Эндокринная регуляция материнского поведения кроликов детально исследована (Gonzalez-Mariscal et al, 1994; Gonzalez-Mariscal et al, 2007), однако в данном обзоре мы не будем рассматривать этот аспект, так как он лежит за рамками наших интересов.
Кролики относятся к животным с индуцированной овуляцией (Ramirez, Beyer, 1988) и нерегулярными эструсовыми циклами. В условиях лаборатории и при содержании на фермах при сбалансированном рационе они размножаются круглый год. В природе при уменьшении светлого времени суток размножение прекращается. Продолжительность беременности 31-33 суток. За 3-6 дней до рождения детенышей в природе самка выкапывает относительно неглубокую нору, в которой сооружает гнездо сначала из травы или сена, а потом из собственного пуха. В условиях лаборатории или фермы за несколько дней до родов самки обычно усиленно копают подстилку, пик проявления этого поведения приходится на 6-8-й дни перед родами и его уровень понижается к пятому дню (Gonzalez-Mariscal et al., 1994). За два, чаще за один день до родов самки начинают собирать строительный материал (сено, солому) и строить гнездо (Gonzalez-Mariscal et al., 1994). После сооружения гнезда из сена или травы самки выщипывают пух из груди и живота и дополняют им гнездо. Такое поведение является уникальным среди млекопитающих (Gonzalez-Mariscal, Rosenblat, 1996). Постройка гнезда из пуха наблюдается не ранее, чем за день до родов. Некоторые самки не строят гнездо из пуха, а некоторые продолжают выщипывать пух из живота до третьего дня после родов (Gonzalez-Mariscal et al., 1994). Так как детеныши кроликов появляются на свет совершенно беспомощными, лишенными волосяного покрова, с закрытыми глазами, такое гнездо необходимо для сохранения тепла и их нормальной терморегуляции. Выживаемость крольчат в значительной степени обусловлена поведением матери. Одним из факторов является качество построенного гнезда (Hafez et al., 1966; Canali et al., 1991), которое в определенной степени зависит от материнского опыта самки. В экспериментах качество построенного гнезда оценивалось по шкале в зависимости от его формы и наличия сена и пуха. Чем раньше по времени перед родами было построено гнездо и чем выше было его качество, тем выше был процент выживших и накормленных молоком крольчат в первый день после родов и тем ниже был процент травмированных детенышей и каннибализм (Ross et al., 1956). Нередко в условиях клеточного содержания впервые родившие самки часто посещают гнездо, что может приводить к затаптыванию и ранениям детенышей, а также разрушению гнезда (Coureaud et al., 2000). В отдельных случаях может наблюдаться каннибализм (Hafez et al., 1966), причины которого до конца не выяснены. Наблюдения показывают, что он чаще наблюдается у впервые родивших самок, а также у крольчих, обладающих пониженной чувствительностью по отношению к стимулам, исходящим от крольчат. Причиной каннибализма могут быть неудачные роды. Максимальная смертность крольчат наблюдается в течение первой недели жизни. Роды часто происходят утром, но иногда и в другое время суток и продолжаются всего 10-15 минут, при этом самка рождает 6-12 детенышей. Быстрое рождение крольчат стимулируется резким выбросом окситоцина в кровь и возможно благодаря очень интенсивным сокращениям комплекса хорошо развитой мускулатуры, связанной с вагиной самок (Hudson, 1995; Hudson et al, 1995; Martinez-Gomez et al., 1997; Hudson et al., 1999). Родившиеся крольчата очень активны и сразу начинают искать материнские соски. Мать обычно вылизывает детенышей и поедает плаценту. Крольчата могут сами избавляться от фрагментов оставшихся на них оболочек, найти сосок и начать сосать даже в том случае, если мать им не помогает (Hudson et al., 1999). После родов у самки наступает послеродовый эструс, во время которого она может спариться с самцом и вновь забеременеть. В природных условиях крольчихи приносят за сезон несколько пометов (Brambell, 1944; Lincoln, 1974; Hudson et al., 1996). Если самка забеременела во время послеродового эструса, она перестает кормить потомство в возрасте 20-25 суток, причем при попытках крольчат начать сосание, может проявлять по отношению к ним агрессивное поведение. После родов мать уделяет крольчатам немного внимания. Лишь в первый день после родов крольчихи остаются с детенышами на промежутки времени, в несколько раз превышающие периоды контактов в последующие дни, и проводят в гнезде 300-750 секунд (Gonzalez-Mariscal et al., 1994). Для включения комплекса материнского поведения у крольчих, рожавших несколько раз, контакт с детенышами после родов не обязателен. Напротив, такой контакт необходим для впервые родивших самок (Gonzalez-Mariscal et al., 2007). Для проявления материнского поведения определенное значение может иметь длительность контакта с детенышами не только сразу после родов, но в последующее время. Так, в экспериментах родившие крольчихи оставались с детенышами на 4-8 часов. Затем самок первой группы отделяли от крольчат на семь дней, затем проверяли их материнское поведение на 8-10-й день после родов. Самки второй группы оставались с крольчатами на десять дней, после чего их отделяли от крольчат на семь суток и наблюдали за их материнским поведением. Оказалось, что самки из второй группы чаще входили в гнездо и кормили крольчат, чем самки из первой группы (Gonzalez-Mariscal et al., 1998). Долгое время считалось, что крольчихи кормят детенышей один раз в сутки (Cross, 1951; Venge, 1963; Zarrow et al., 1965; Findlay, Tallal, 1971; Hudson, Distel, 1982; Bigler, 1986; Jilge, 1994). Некоторые авторы наблюдали два кормления в сутки, но только в течение первых двух-трех дней после рождения крольчат (Davis, 1957; Bernard, 1962). Позже было показано, что при клеточном содержании крольчихи могут кормить детенышей чаще, чем один раз в сутки (Seitz et al., 1998; Ноу, 2000). Однако более частое кормление могло быть результатом клеточного содержания. Для решения этого вопроса были проведены наблюдения за дикими и доместицированными кроликами в вольерах площадью 150 м . Показано, что за период выкармливания детенышей самки кормили их один раз в сутки в 68,3% (дикие) и 86,8% (доместицированные) случаев. Два кормления отмечено в 26,95% у диких и в 11,2% у доместицированных кроликов. Изредка крольчихи кормили даже три раза в сутки: дикие в 1,9% и доместицированные - 0,8% случаев. Частота кормлений была максимальной во время второй недели лактации и наиболее низкой во время четвертой недели. Самки диких кроликов кормили детенышей в 84%, а доместицированных - в 85,8 % случаев в сумерки или ночью. Различия между дикими и доместицированными крольчихами заключалось в том, что пик кормлений наблюдался у первых в период времени от одного до двух часов ночи, а у вторых - от 19-ти до 21-го часа. Войдя в гнездо, самка принимает характерную для кормления позу, неподвижно стоя чуть приподнявшись над крольчатами и разрешая им сосать, но никак им не помогая.
Влияние ассоциации пробиотического штамма В. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Е. faecalis Rb и ассоциации В. subtilis В-8130 с коллекционным штаммом E.faecium В-8251 нарост крольчат
В целях изучения возможности сосуществования выделенного штамма с другими пробиотическими бактериями с сохранением положительного биологического воздействия ассоциации бактерий на организм хозяина, а также разработки технологичной концентрированной добавки к кормам, была предложена методика получения опытного препарата «Биогеркулес-2» в концентрированном виде с частично инактивированным энтерококком, так как технология приготовления препарата по типу получения препарата «Биогеркулес-1» требует больших объемов обработанных овсяных хлопьев с последующей сушкой этой массы, что связано с дополнительными энергозатратами и использованием соответствующего объемного сушильного оборудования.
В качестве модели было проведено совместное культивирование Е. faecalis Rb с В. subtilis 8130, который используется для получения пробиотических кормовых добавок (Ушакова и др., 2003). Был получен опытный препарат «Биогеркулес-2», содержащий овсяные хлопья, ферментированные коллекционным пробиотическим штаммом В.subtilis В-8130 и Efaecalis Rb. Для этого получали жидкие культуры бациллы на глюкозо-пептонной среде (Методы общей бактериологии, 1984), а энтерококков - в 0,5%-ном молоке. Далее смешивали стерильный субстрат (овсяные хлопья) с жидкими культурами указанных штаммов, влажную массу инкубировали в условиях ограниченного доступа воздуха при 37С и затем высушивали при 60С, с одновременной частичной инактивацией клеток. Готовый продукт, обозначенный как «Биогеркулес-2» (рис. 3), тестировали микроскопией на отсутствие посторонних бактерий и грибов.
Количество клеток в препаратах оценивали по методу Виноградского-Брида (Методы общей бактериологии, 1984), подсчитывая клетки в окрашенных карболовым генцианвиолетом мазках площадью 1 см2, с нанесенными 20 мкл разведенной в 100-200 раз суспензии, полученной при встряхивании 10 г массы в 100 мл стерильного физиологического раствора с добавлением 10% речной гальки. При этом общее число клеток энтерококка составило 3 ± 0,7 х 108 клеток/г, бациллы - 2 ± 0,4 х 108 клеток/г. Значение рН определяли в суспензии, полученной после разведения 5 г продукта твердофазной ферментации в 15 мл воды.
Полученный препарат «Биогеркулес-2» дробным способом вводили в необработанный геркулес из расчета 1 г препарата на 1 кг геркулеса, который вводили в стандартный рацион крольчат опытной группы, частично заменяя им зерно и комбикорм, начиная с возраста одного месяца; продолжительность кормления - два месяца. Ежедневно каждый крольчонок получал 0,03 г препарата, или суммарно 1,5 х 107 клеток бактерий.
Коллекционный штамм E.faecium В-8251 также способен развиваться на овсяных хлопьях «Геркулес» в твердофазных условиях совместно с В. subtilis В-8130 (препарат «Биогеркулес-3»), способ приготовления данного препарата был аналогичен описанному для препарата «Биогеркулес-2». При этом число клеток энтерококка в препарате составило 1,5 ± 0,4 х 108 клеток/г, бациллы - 4,0 ± 0,8 х 108 клеток/г; рН - 5,4. Препарат «Биогеркулес-3» был введен в аналогичный по составу рацион крольчат в такой же дозе, как и в опытах с препаратом «Биогеркулес-2» (1 г на 1 кг овсяных хлопьев). Ежедневно каждый крольчонок получал 0,03 г препарата, или суммарно 1,7 х 107 клеток бактерий. Ниже приводится общая схема экспериментов.
При изучении влияния препарата «Биогеркулес-2» на рост крольчат в опытах использовано две группы животных:
1) контрольная (п = 5) - крольчат содержали до одномесячного возраста с матерью, потом до трех месяцев без матери с введением в рацион овсяных хлопьев, смешанных с 0,5%-ным молоком без бактерий, в таком же количестве, как и в экспериментальной группе;
2) экспериментальная (п = 6) - крольчат содержали с матерью до одномесячного возраста, затем без матери, с введением в рацион «Биогеркулеса-2» с ассоциацией E.faecalis и В. subtilis.
При изучении влияния препарата «Биогеркулес-3» на рост крольчат в опытах использовано две группы:
1) экспериментальная (п = 7) — крольчат содержали с матерью до одномесячного возраста, затем без матери, с введением в рацион «Биогеркулеса-3» с ассоциацией E.faecium В-8251 и В. subtilis В-8130;
2) контрольная (п = 11) - крольчат содержали до одномесячного возраста с матерью, потом до трех месяцев без матери с введением в рацион геркулеса, смешанного с 0,5%-ным молоком без бактерий в таком же количестве, как и в экспериментальной.
Влияние ассоциации пробиотического штамма В. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Е. faecalis Rb нарост крольчат
Основные результаты опыта (Kotenkova et al., 2010; Федосов, Караман, 2011) представлены в табл. 12.
В опытной группе масса тела крольчат по окончании опыта составила 601 ± 175 г, что превысило на 15,1 % данный показатель в контрольной группе - 522 ± 126 г. Средний привес массы тела за весь период опыта: в контрольной группе - 239 ± 82 г; в опытной - 295 ± 75 г, что на 23,3 % больше по сравнению с контролем; средний недельный привес в контрольной группе - 24 ± 15 г, в опытной группе - 30 ± 15 г, что на 23,3 % больше по сравнению с контролем.
Применение в кормах молодняка кроликов «Биогеркулес-2» положительно сказалось на возрастной динамике их живой массы тела. Как видно из таблицы 13 и рисунка 13, прекращение подачи препарата вызвало снижение темпа прироста массы тела опытных крольчат почти до показателей контрольных. Введение вновь препарата в рацион вызвало повторное повышение показателей массы тела опытных животных. Эти данные свидетельствуют о пробиотическом характере «Биогеркулес-2», активным началом которого являются клетки энтерококка и бациллы. Таблица 13. Динамика массы тела (г) крольчат при кормлении геркулесом с ассоциацией E.faecalis Rb и В. subtilis 8130 и в контроле
Дата взвешивания Рисунок 13. Динамика массы тела крольчат на рационе с ассоциацией Е. faecalis Rb и В. subtilis 8130 («опыт») и в контрольной группе («контроль»)
Эксперименты показали, что микросимбионт мягких фекалий крольчихи - Е. faecalis Rb обладает пробиотическими свойствами для крольчат.
Однако, известно, что большинство штаммов вида Е. faecalis обладают набором генов, определяющих факторы вирулентности: agg - ответственным за адгезию к поверхности клеток эукариот, клеточную аггрегацию и конъюгацию, gelE - за синтез токсина, внеклеточной металлоэндопептидазы, гидролиз желатины, коллагена, гемоглобина и других биоактивных соединений, cylA - активацию цитолизина, efaAfs - экспрессию адгезинов клеточной стенки (Eaton, Gasson, 2001).
Не противоречили этому и результаты анализа генов вирулентности штамма Е. faecalis Rb. На рисунке 14 представлена картина электрофореза фрагментов генов вирулентности исследуемого штамма и коллекционных штаммов Е. faecalis В-4610 (положительный контроль) и Е. faecium В-8251 (отрицательный контроль).
Сравнительные показатели приведены в таблице 14.
Коллекционный штамм Е. faecalis В-4610 (положительный контроль) обладал всеми отмеченными генами, у коллекционного штамма Е. faecium В-8251 (отрицательный контроль) - гены вирулентности не обнаруживались, что соответствовало литературным данным (Ботина, Суходолец, 2005). Штамм Rb содержал характерные для Е. faecalis гены agg, gelE, efaAfs, хотя и отсутствовал ген cylA.
Можно отметить важную роль выделенного природного штамма Е. faecalis Rb в жизнедеятельности кроликов в составе нормальной микрофлоры кишечника, на что указывало регулярное поступление клеток в кишечный тракт хозяина при копрофагии, передача его от матери детенышам, положительное влияние на их рост и развитие. Штамм безвреден для лабораторных животных, характеризовался высокой устойчивостью к различным физико-химическим факторам, характерным для кишечного тракта, совмещаемостью с пробиотическими бактериями. Однако применение штамма в практических целях требует осторожного подхода в связи с присутствием у него набора генов вирулентности. Штамм передан в ГосНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко.
Взаимодействия крольчат друг с другом и с матерью
Был проведен анализ контактов и прочих взаимодействий (в т. ч. скучивания, совместного кормления и др.), животных друг с другом (Федосов, Котенкова, 2011) (рис. 23,24).
Основную часть взаимодействий как между крольчатами и матерью, так и между крольчатами (в группах с матерью и без нее) составляют нейтральные взаимодействия (более 70 %), доля пищевых взаимодействий (прежде всего совместное кормление животных) заметно ниже (от 8,5 до 36,8 %). В группах, где детеныши содержались с матерью, присутствуют контакты крольчат с матерью, связанные с сосанием: во всех трех группах с матерью отмечены попытки сосания, а в двух из них - продолжительное (до двух минут) сосание. Доля таких контактов от общего числа актов поведения крольчат при взаимодействиях с матерью была близка к доле пищевых взаимодействий крольчат с матерью (совместное кормление). Со стороны матери во время попыток сосания не наблюдалось каких-либо специфических поведенческих актов, кроме противодействия сосанию, прежде всего путем убегания от крольчат. Однако данный образц поведения не был выделен отдельно при составлении этограммы и, следовательно, не был учтен при количественном анализе взаимодействий матери с крольчатами.
Во взаимодействиях крольчат и матери акты игрового поведения у матери не отмечались. У крольчат доля их была невелика (от 0 до 3,8% от суммарного числа всех взаимодействий и от 0 до 0,2% от суммарной продолжительности всех взаимодействий), агрессивные взаимодействия между самкой и детенышами отсутствовали, но в одной группе отмечалось активное подавление матерью агрессии между крольчатами.
Для групп крольчат с матерью проведено сопоставление иерархического статуса крольчонка в группе (определение статуса было описано выше), с количеством и продолжительностью взаимодействий данного крольчонка с матерью. Расчет коэффициента корреляции Кендалла показал наличие достоверной (Р 0,05) положительной корреляции между долей числа взаимодействий конкретного крольчонка с матерью от суммарного количества взаимодействий всех крольчат в данной группе с матерью и долей актов агрессивного поведения того же крольчонка от суммарного количества актов агрессивного поведения в группе (за весь период наблюдений). Кроме того для групп ГЗ и Г4 прослеживается следующая тенденция: общее количество взаимодействий (прежде всего за счет поведенческих актов, относящихся к нейтральному поведению) доминанта с матерью было больше, а их общая продолжительность меньше, чем у других крольчат в группе (расчет коэффициента корреляции Кендалла показал наличие недостоверной (Р = 0,07) отрицательной корреляции между долей числа взаимодействий конкретного крольчонка с матерью от суммарного количества взаимодействий всех крольчат в данной группе с матерью и долей продолжительности взаимодействий того же крольчонка с матерью от суммарной продолжительности взаимодействий всех крольчат с матерью в данной группе за весь период наблюдений) (табл. 23,24).
Таким образом доминанты чаще других крольчат контактируют с матерью, что согласуется с данными об их более высокой общей активности.
При этом взаимодействия с взрослой самкой подчиненных крольчат в среднем более продолжительные, что может быть результатом их стремления защититься от агрессии со стороны доминанта. Нахождение вблизи матери повышает вероятность того, что проявление агрессии будет остановлено в результате ее активных действий или контакта с ней крольчонка-агрессора. Как отмечалось выше, тот факт, что нападающий крольчонок может прекратить свои агрессивные действия по отношению к другому крольчонку при контакте с матерью, был отмечен в ходе наблюдений.
При сравнении взаимодействий крольчат между собой отмечена тенденция (Р 0,05) к уменьшению доли пищевых взаимодействий у детенышей в группах с матерью по сравнению с крольчатами, содержавшимися без нее, что может быть связано, прежде всего, с уменьшением у них доли пищевого поведения в целом. Во взаимодействиях крольчат между собой образцы игрового и агрессивного поведения отмечались не у всех крольчат, их доли от суммарного числа всех взаимодействий сильно отличались у разных крольчат и были невелики. Они составили для игрового поведения: в группах с матерью от 0 до 10,7 % от суммарного числа всех взаимодействий и от 0 до 1,5 % от суммарной продолжительности всех взаимодействий, а в группах без матери - от 0 до 5,5 % и от 0 до 1,6 % соответственно; для агрессивного: в группах с матерью - от 0 до 27,4 % и от 0 до 2,7 % соответственно, а в группах без матери - от 0 до 7,4 % и от 0 до 4,0 % соответственно.
