Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы перитонита (обзор литературы) 13
1.1. Современные тенденции в изучении проблемы перитонита 13
1.2. Стандартные и альтернативные способы санации брюшной полости при перитонитах 15
1.3. Факторы неспецифической антимикробной защиты организма при перитоните и их коррекция 18
1.4. Послеоперационные осложнения перитонита, методы их профилактики и лечения 25
1.5. Использование перфторана в комплексном лечении перитонитов и их осложнений 35
1.6. Озон и его растворы в лечении перитонитов 44
Глава 2. Материал и методы исследований 49
2.1. Материалы экспериментальных исследований 49
2.2. Материалы клинических исследований 51
2.3. Методы экспериментальных и клинических исследований 57
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований в контрольной группе животных и их обсуждение 67
3.1. Цитологическая характеристика перитонеальной жидкости и факторы неспецифической резистентности у интактных животных 67
3.2. Микротопография и цитоархитектоника стенки тонкой кишки у интактных животных 69
3.3. Некоторые аспекты фармакокинетики перфторана при внутрибрюшном его введении 72
3.4. Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных контрольной группы 73
3.5. Исследование факторов неспецифической резистентности у животных контрольной группы 81
Глава 4. Результаты экспериментальных исследований в опытной группе животных и их обсуждение 92
4.1. Макроскопическая картина развития экспериментального калового перитонита 92
4.2. Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных опытной группы 107
4.3. Динамика структурной организации стенки тонкой кишки и его лимфоидного аппарата у животных опытной группы 120
4.4. Электронно-микроскопические исследования селезёнки и брыжеечных лимфатических узлов 133
4.5 Микробиологические исследования перитонеальной жидкости у животных опытной группы 141
4.6. Факторы неспецифической резистентности у животных опытной группы 153
Глава 5. Результаты клинических исследований и их обсуждение 163
5.1. Результаты стандартного и комплексного лечения больных острым перитонитом 163
5.2. Иммунологические исследования 182
5.2.1. Динамика показателей неспецифического иммунитета у больных основной группы 182
5.2.2. Динамика показателей неспецифического-иммунитета у больных контрольной группы 188
5.3. Микробиологические аспекты острых перитонитов 193
5.3.1. Микробиологические исследования перитонеальной жидкости у больных основной и контрольной групп 191
Заключение 202
Выводы 223
Практические рекомендации 224
Список литературы 226
- Факторы неспецифической антимикробной защиты организма при перитоните и их коррекция
- Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных контрольной группы
- Электронно-микроскопические исследования селезёнки и брыжеечных лимфатических узлов
- Микробиологические исследования перитонеальной жидкости у больных основной и контрольной групп
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на использование широкого арсенала высокотехнологичных методов диагностики и лечения, перитонит и в настоящее время остаётся основной причиной послеоперационных осложнений (Гостищев В.К. и соавт., 2002; Хачатрян Н.Н. и соавт., 2004; 2007; Савельев В.С. и соавт., 2006; 2008; Филимонов М.И. и соавт., 2006; Стручков Ю.В. и соавт., 2007; Седов В.М. и соавт., 2008; Плоткин Л.Л., 2008; Булава Г.В. и соавт., 2009; Шугаев А.И. и соавт., 2009; Lim C.T. et. al., 2005). Угнетение иммунного ответа и резкое снижение роли системы неспецифической и специфической защиты увеличивают подверженность организма к осложнениям, в первую очередь, ранней послеоперационной спаечной кишечной непроходимости и прогрессированию перитонита, которые, как правило, требуют повторных операций (Ерюхин И.А. и соавт., 2003; Шуркалин Б.К. и соавт., 2007; Булава Г.В. и соавт., 2009; Cereto F. et. al., 2003).
Известно, что перфторан, используемый в качестве кровезаменителя, проявляет мембраностабилизирующие и сорбционные свойства, улучшает капиллярный кровоток и оксигенацию тканей (Белоярцев Ф.Ф., 1985; Иваницкий Г.Р. и соавт., 1986; Мороз В.В., 1995; Голубев А.М. и соавт., 2001, 2003; Ярема И.В. и соавт., 2003; Жукова А.Г. и соавт., 2006), стимулирует органы иммунной системы (Кузнецова И.Н., 2001) и функциональное состояние перитонеальных макрофагов (Голубев А.М. и соавт., 1995; Аскерханов Г.Р. и соавт., 2000; Гусейнов А.Г., 2000), предупреждает образование послеоперационных спаек (Ярема И.В. и соавт., 2003; Магомедов М.А., 2003).
Известно также, что для эффективной санации брюшной полости используются озон-кислородные смеси и их растворы (Корабельников И.А. и соавт.,1997; Кудрявцев Б.П. и соавт., 1997; Аксенова С.В. и соавт., 2000; Лаберко Л.А. и соавт., 2000; Базиев А.М., 2006), обладающие бактерицидным, вирицидным, фунгицидным, анальгетическим, детоксикационным и иммуномодулирующим действиями (Перетягин С.П. и соавт., 1994; Васильев И.Т. и соавт., 1995; Бояринов Г.А. и соавт., 1999; Лелянов А.Д., 1999; Кувакина Н.А., 2006 и др.).
Хотя в литературе имеются сведения о высокой растворимости и стабильности озона в перфторуглеродных соединениях (Разумовский С.Д. и соавт., 2000), озонированные их растворы для лечения перитонитов ещё не использовались. Озонированный перфторан, как мы полагаем, в лечении перитонитов и профилактике их осложнений окажет более выраженный терапевтический эффект, нежели перфторан без озона или же озонированный физиологический раствор (Османов А.О. и соавт., 2005). Проведение подобных исследований при экспериментальном остром перитоните, апробация и внедрение результатов в клинику, на наш взгляд, является актуальным. Всё вышеизложенное и служило основанием для планирования и выполнения настоящего исследования. Работа выполнена по плану НИР ГОУ ВПО «ДГМА МЗ СР РФ». Номер госрегистрации темы диссертации 01201000001.
Цель исследования: оценка влияния внутрибрюшного введения озонированного перфторана на динамику развития воспаления брюшины в эксперименте и обоснование его клинического применения в комплексном лечении острых перитонитов и профилактике послеоперационных осложнений.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ реакции брюшины и показателей неспецифического иммунитета у интактных животных в четырёх сериях на внутрибрюшное введение: а) озонированного перфторана; б) озонированного физиологического раствора; в) перфторана; г) физиологического раствора;
-
Разработать методику выявления перфторана в исследуемых жидких средах и биологических тканях для изучения путей элиминации при введении его в брюшную полость;
-
Проследить динамику развития острого перитонита, изменений клеточного и микробного составов перитонеальной жидкости, неспецифических факторов иммунитета и морфологической перестройки регионарных иммунных органов на фоне внутрибрюшного введения указанных растворов;
-
Дать оценку влиянию изучаемых растворов на степень изменений цитологической картины и контаминации перитонеальной жидкости, параметров неспецифического иммунитета, морфологии регионарных иммунных органов при развитии острого перитонита в эксперименте;
-
Разработать в эксперименте новый способ лечения острого гнойного перитонита и предупреждения его осложнений;
-
Экспериментально обосновать возможность применения в клинической практике озонированного перфторана в профилактике и комплексном лечении острого перитонита;
-
Оценить эффективность клинического применения озонированного перфторана в комплексном лечении острого перитонита и профилактике послеоперационных осложнений.
Научная новизна исследования
Разработаны: а) два новых способа, три модификации методов окраски гистологических препаратов и мазков; б) способ выявления перфторана в биологических тканях и жидких средах; в) способы лечения острого гнойного перитонита и послеоперационного пареза кишечника, которые экспериментально обоснованы и апробированы в клинике с благоприятными результатами. Предложены способы озонирования перфторана и профилактики послеоперационного пареза кишечника и спаечного процесса в брюшной полости (на поданные заявки на патенты получены приоритетные справки).
Впервые дана оценка динамике изменений клеточного состава перитонеальной жидкости и параметров неспецифического иммунитета на фоне внутрибрюшного введения озонированного перфторана.
Впервые апробирован озонированный перфторан в эксперименте и клинической практике с целью коррекции показателей неспецифического иммунитета и профилактики послеоперационных осложнений при остром перитоните.
Впервые изучены общие закономерности и особенности морфогенеза брыжеечных лимфатических узлов, лимфоидных узелков тонкой кишки и селезёнки, структурных компонентов и клеточного состава этих органов в динамике развития острого перитонита на фоне внутрибрюшного введения озонированного перфторана, озонированного физиологического раствора и перфторана.
Впервые проведена сравнительная оценка результатов стандартного и комплексного (с введением озонированного перфторана) лечения острого перитонита и оценена эффективность озонированного перфторана в комплексном лечении острого перитонита и профилактике послеоперационных осложнений.
Практическая значимость результатов исследования
1. Разработанные нами способы окраски позволяют получить более качественное окрашивание гистологических препаратов и мазков, надёжную дифференцировку структурных компонентов тканей и клеток.
2. Разработанный и использованный нами в эксперименте «Способ выявления перфторана в биологических тканях и жидких средах» даёт возможность выявить частицы перфторана в перитонеальной жидкости и изучить его фармакокинетику.
3. Разработан способ озонирования перфторана, повышающий его функциональную активность.
4. Разработанный нами «Способ лечения острого гнойного воспаления в серозной полости» в условиях экспериментального калового перитонита позволяет произвести существенную коррекцию параметров неспецифической резистентности, снизить микробное число перитонеального экссудата в 102-105 раз, развитие пареза кишечника и спаечного процесса брюшной полости в 2,5-4,5 раза по сравнению с сериями, где аналогично вводили озонированный физиологический раствор (2-я серия), перфторан без озона (3-я серия) и физиологический раствор (4-я серия). У животных опытной группы при введении озонированного перфторана показатели летальности снижаются: по сравнению со 2-й серией на 21,3% (р=0,002), с 3-й – на 16,6% (р=0,005) и с 4-й – на 50,7% (р=0,000).
5. Включение в комплекс лечебных мероприятий разработанных нами способов профилактики и лечения перитонита и его осложнений позволяет: улучшить оксигенацию тканей, санацию брюшной полости и гемодинамические показатели (р=0,02); сроки антибактериальной терапии и пребывания больных в стационаре сокращаются на 1-2 дня при местном и 2-4 дня - распространённом перитонитах (р=0,00).
6. Внутрибрюшное и внутривенное введение больным озонированного перфторана снижает число послеоперационных осложнений (пареза кишечника на 33,3% (р=0,04), послеоперационной ранней спаечной кишечной непроходимости и прогрессирование перитонита – на 20,8% (р=0,05) по сравнению с контрольной группой, где проведено стандартное лечение).
Личное участие автора в получении результатов диссертационного исследования
Все эксперименты на крысах (n=510), наблюдение за динамикой перитонита в сериях экспериментов, приготовление мазков, проводка и приготовление гистологических препаратов, микроскопические и иммунологические исследования, клинические наблюдения за больными с острым гнойным перитонитом (48 человек), внутрибрюшное и внутривенное введение озонированного перфторана, использованного в комплексном лечении острого перитонита, исследование показателей неспецифической резистентности, регистрация показателей моторной функции кишечника с помощью фоноэнтерографа, микрофотографирование, обобщение полученных результатов, их анализ, статистическая обработка, формулировка выводов и практических рекомендаций, их внедрение в клиническую практику выполнены лично автором. Электронно-микроскопические и микробиологические исследования и все операции на больных с острым перитонитом проведены с участием автора.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Внутрибрюшное введение озонированного перфторана способствует усилению миграции перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и их функциональной активности, оказывает модулирующее влияние на параметры неспецифического иммунитета.
2. При экспериментальном каловом перитоните происходит снижение фагоцитарной активности лейкоцитов (ФАЛ), цитохимически определяемых катионных белков (КБ) и миелопероксидазы (МПО) нейтрофильных гранулоцитов, бактерицидной активности сыворотки (БАС) крови и уровня лизоцима, что указывает на угнетение неспецифической резистентности организма.
3. Прогноз при остром экспериментальном каловом перитоните более благоприятный на фоне внутрибрюшного введения озонированного перфторана, нежели озонированного физиологического раствора или перфторана без озона.
4. Озонированный перфторан проявляет бактерицидные свойства, препятствует распространению инфекции по брюшине, развитию пареза кишечника и спаечного процесса в брюшной полости, способствует очищению от детрита. Подтверждением этому является макроскопическая картина развития перитонита, динамика изменений характера и состава перитонеального экссудата, морфологии регионарных иммунных органов.
5. Внутрибрюшное и внутривенное введение озонированного перфторана при хирургическом лечении больных с перитонитом служит дополнительным этапом в санации брюшной полости, профилактики развития послеоперационного пареза кишечника, спаечного процесса и коррекции показателей неспецифического иммунитета.
Внедрение результатов работы в клиническую практику и учебный процесс. Основные положения диссертации внедрены в клиническую практику в хирургических отделениях № 1, 2 и 3 РБ №2 ЦСЭМП, республиканского отделения хирургической инфекции МБ №1 г. Махачкалы и используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами 4 - 6 курсов лечебного факультета на кафедрах факультетской хирургии №1 и №2, госпитальной хирургии, хирургии педиатрического, стоматологического и медико-профилактического факультетов, с врачами - курсантами на кафедре хирургии ФПК и ППС с курсом эндоскопической хирургии ГОУ ВПО «Даггосмедакадемия МЗ СР РФ». Методики окраски гистологических препаратов и мазков внедрены в работу лабораторий кафедр анатомии, гистологии и патологической анатомии, в лаборатории ГУ «НИИ морфологии человека РАМН», республиканского патологоанатомического бюро МЗ РД, способ выявления перфторана – в ГУ «НИИ общей реаниматологии РАМН», о чём имеются акты внедрения.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе шесть статей напечатаны в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ («Морфология», «Общая реаниматология», «Морфологические ведомости», «Уральский медицинский вестник») и в сборниках материалов съездов и международных конференций. Автором получены шесть патентов РФ на изобретения, три приоритетные справки на заявки на патенты, четыре удостоверения на рационализаторские предложения.
Апробация результатов работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: международных научно-практических конференциях «Перфторорганические соединения в биологии и медицине» (Москва, 2000, 2005; С.-Петербург, 2003), заседаниях общества анатомов, гистологов и эмбриологов Москвы и Московской области (2000) и отраслевой проблемной комиссии «Функциональная анатомия» (ММА им. И.М. Сеченова, 2000), юбилейных научно-практических конференциях, посвященных 70-ти и 75-ти летию ДГМА (Махачкала,2002, 2007), научно-практических конференциях молодых учёных и студентов (Махачкала, 1997, 2002, 2004), научно-практических конференциях «Новые технологии в медицине» (Махачкала, 2004, 2006), международной научно-практической конференции молодых учёных-медиков (Ереван, 2005), IV региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2007), научно-практической конференции кафедры хирургии ФПК и ППС ДГМА (Махачкала, 2009), заседаниях Дагестанского общества хирургов им. Р.П. Аскерханова (Махачкала, 2005, 2006), межкафедральной научной конференции ДГМА (23 декабря 2009 г., протокол № 23).
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 265 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 383 источника, в том числе 255 отечественных, 128 иностранных. Работа иллюстрирована 94 рисунками (фотографиями и диаграммами) и 23 таблицами.
Факторы неспецифической антимикробной защиты организма при перитоните и их коррекция
Компоненты антимикробной защиты организма при перитоните.
Поддержание постоянства внутренней среды является одним из фундаментальных качеств живого организма, реализация которого осуществляется через комплекс взаимодействующих между собой защитных систем [38, 44, 45, 46, 111, 117, 288, 314, 317, 356]. Центральная роль в этом механизме принадлежит фагоцитам. Нейтрофильные гранулоциты с макрофагами играют ведущую роль и в очищении тканей от гнойных очагов, как путём фагоцитоза детрита, так и выделением протеолитических ферментов при их разрушении [60, 208, 315, 320, 329, 357, 361, 373, 376, 377]. Необходимость надёжной упаковки больших количеств и объёмов биологически активных веществ, предопределяет наличие в цитоплазме нейтрофилов хорошо развитого гранулярного аппарата [103, 179, 180, 181, 188, 259, 261, 322, 326, 331, 332, 336, 345, 350, 354, 355, 365, 374].
Известно, что распространённый гнойный перитонит сопровождается развитием иммунодепрессии или вторичного иммунодефицита, обусловленного массивной микробной контаминацией [45, 46, 74, 177, 206, 293, 356]. При этом деструкция тканей и повреждение сосудистого эндотелия, нарушение реологических свойств эритроцитов, микроциркуляции и развитие гипоксии, интенсификация процессов перекисного окисления липидов и выра-, ботка ряда биологически активных веществ, сопровождающие острый гнойный процесс, вызывают нарушения в регуляции иммунной системы, ведут к ещё большему угнетению иммунитета [146, 231, 244, 270, 293]. А это, в свою очередь, способствует усилению воспалительного процесса в брюшной полости и нарастанию интоксикации [244,356]. При этом в мезентеральных лимфатических узлах первая иммунная реакция появляется раньше, чем в крови [204]. Но микроорганизмы, попадая в полость брюшины, ещё раньше вступают во взаимодействие с перитонеальной микро- и макрофагальной системой. Поэтому одним из важных компонентов антимикробной защиты при перитоните является система фагоцитарных клеток ПЖ: макрофаги, моноциты и полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты. Активация макрофагов имеет защитный характер, так как они участвуют в реализации всех звеньев иммунного ответа. Совокупность биологических эффектов про- и противовоспалительных цитокинов макрофагов обеспечивает антибактериальную и противовирусную защиту организма; с ними связан нейтрофильный лейкоцитоз в крови, опосредованный стимулирующим воздействием их на гемопоэз [146, 231, 310].
Систему мононуклеарных и полинуклеарных фагоцитов в целом рассматривают как своеобразный биологический фильтр крови и лимфы, удаляющий из них микроорганизмы (в том числе осуществляющий трансцеллю-лярный перенос бактерий), токсины, различные метаболиты [60].
Но мощная противовоспалительная реакция, которая формируется на фоне внутрисосудистого воспаления и повреждения эндотелия сосудов при перитоните, способствует снижению экспрессии HLA-DR антигена и развитию анергии моноцитов, что в конечном итоге приводит к снижению процессов синтеза антител - иммуноглобулинов классов М и G [198]. Поскольку лимфоциты и гранулоциты выполняют генетически запрограммированную функцию, участвуя в процессе воспаления, на них повлиять, как указывают авторы, практически невозможно.
Предъявление сверхвысоких требований к этой системе изменяет режим её работы: переход на экстенсивный путь снижает возможность полноценной замены отработавших свой срок структур [39, 60, 373]; появляются активированные незрелые элементы (в случае с системой нейтрофильных лейкоцитов происходит сдвиг формулы крови влево), что связано с повышением экспрессии CD lib и понижением L- селектина. Юные формы нейтрофильных лейкоцитов не могут в полной мере выполнять свои функции. У них снижена способность к адгезии, фагоцитозу, продукции активных форм кислорода.
Функциональное состояние перитонеальной микро- и макрофагальной систем определяет характер и тяжесть течения гнойного процесса в брюшной полости и его прогноз. По мнению Д.С. Саркисова и соавт. [207], В.Н. Таланкина и соавт. [60], по мере прогрессирования воспаления, снижается захватывающая и бактерицидная способность лейкоцитов. С одной стороны, вследствие повреждающего действия на них циркулирующих в крови токсинов, а с другой - истощения энергетических потенциалов нейтрофильных гранулоцитов ещё до выхода из кровеносного русла. В ходе реализации специфической функции нейтрофила, его бактерицидная и поглощающая способности могут изменяться непараллельно. Снижение бактерицидности при сохранении уровня поглощения встречается при сепсисе. Кроме того, способность убивать бактерии истощается в нейтрофилах раньше способности поглощать их [207, 208, 283]. Ограничение функциональных возможностей полиморфноядерных лейкоцитов связывают также с изменением жирнокис-лотного состава их мембран. Тяжёлое течение гнойного воспаления ведёт к повышению проницаемости мембран НЛ вплоть до полного разрушения [60, 206, 373,380,381].
Нейтрофильные гранулоциты обладают интрацеллюлярным блоком микробицидных факторов, представленным катионными белками и миелопе- д роксидазной системой. Последняя включает в себя миелопероксидазу, НгСЬ, и окисляемые кофакторы - ионы хлора, йода, брома. Соединения, обеспечивающие микробицидность без участия кислорода, выявляют с помощью ли-зосомально - катионного теста [72, 154, 170, 180, 181, 290, 311, 369].
Оценка антимикробных свойств нейтрофилов по цитохимическим показателям нашло широкое применение не только в эксперименте, но и в клинической практике [23, 92, 60, 170, 180, 214, 262, 263, 264, 265, 266, 269, 287, 313,328,333,334].
Изучение катионных белков НЛ у больных с прободными гастродуоде-нальными язвами [187] показало, что при прогрессировании перитонита, их цитохимический показатель снижается, а неудержимое снижение уровня КБ является прогностически неблагоприятным признаком. По функциональной морфологии КБ нейтрофильных гранулоцитов можно оценивать эффективность проводимой терапии и прогнозировать вероятность осложнений [170, 313,334].
Исследования В.Е. Пигаревского и соавт. [179] показали, что у больных гнойным перитонитом в циркулирующих нейтрофилах снижена активность МПО. Это свидетельствует о снижении антибактериального потенциала азурофильной зернистости до выхода НЛ в очаг воспаления. Содержание катионных белков при этом остаётся в пределах статистической нормы. В то же время в цитоплазме НГ перитонеального экссудата снижена активность как МПО, так и КБ, т.е. дегрануляция цитоплазматической зернистости ней-трофилов происходит при непосредственном контакте с бактериями в очаге гнойного воспаления. Лизосомальные катионные белки обладают не только антимикробной активностью, но и свойствами медиатора воспаления и стимулятора фагоцитоза [72].
Известно, что пероксидаза лейкоцитов крови обладает антитоксическими; антивирусными и антибактериальными свойствами, то есть её ферментативная активность является показателем состояния неспецифической резистентности организма [325, 326, 348, 372, 373].
Вызванная перитонитом массивная бактериальная токсемия, оперативное вмешательство, "ударная" антибактериальная терапия, проведение большого количества инвазивных вмешательств способствуют развитию некор-ригируемых изменений в иммунной системе и полифункциональной недостаточности [143, 277].
Распространённый гнойный перитонит сопровождается избыточным поступлением в биологические среды организма микробных антигенов и бактериальных токсинов одновременно из трёх основных источников -гнойно-деструктивного очага в брюшной полости, перитонеального экссудата и паралитически изменённой тонкой кишки. Это приводит к эндогенной интоксикации и, в конечном итоге, полиорганной недостаточности [98, 288, 314,323,339].
Цитокины, являясь низкомолекулярными медиаторами межклеточных взаимодействий, регулируют характер, глубину и продолжительность воспаления и иммунного ответа организма человека [118, 325, 375, 379]. Точно установлена корреляция между содержанием интерлейкина-6 (ИЛ-6) и тяжестью состояния больных перитонитом [183], а также стабильно высоким уровнем цитокинов TNF, IL-1, IFN-a и летальностью [198]. Однако продолжается поиск более совершенных показателей для оценки иммунологического статуса и особенностей течения процессов локального и системного воспаления. В литературе есть сведения, что актуальным при перитоните маркером воспаления, возможно, станет экспрессируемыи на миелоидных клетках триггерный рецептор TREM-1 [198].
Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных контрольной группы
Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных 1 серии
Через сутки после введения озонированного перфторана у крыс 1-й серии (рис. 6, а.) отмечается выраженное увеличение количества клеток моно-нуклеарного ряда, в первую очередь, макрофагов.
Преобладающее большинство из них - это широкоплазменные, вакуо-лизированные макрофаги, известные в литературе как «перфторофаги». Количество макрофагов увеличивается более чем в 2 раза и достигает 7,64=Ы,03 (у интактных крыс - 3,78±0,97). Число моноцитов существенно не меняется, хотя наблюдается некоторая тенденция увеличения их плотности (Ме=0, р25=0, р75=1,5, min=0, max=2).
Усиливается миграция эозинофилов, количество их, по сравнению с интактными животными, увеличивается (Ме=2, р25=1, р75=2, min=0, max=3; р 0,05), в контрольной серии - (Ме=0, р25=0, р75=0, min=0, max=l), т.е. они обнаруживаются не во всех мазках и полях зрения, а всего лишь в 1/5 случаях. На 1-е сутки в мазках определяются зрелые ПлК(Ме=1, р25=0,5, р75=2, min=0, max=3; р 0,05), и незрелые ПлК (Ме=0, р25=0, р75=1, min=0, max=2). У интактных крыс зрелые ПлК обнаруживаются значительно реже. В 4-х из 5-ти исследованных полей зрения каждого мазка обнаруживаются митозы (Ме=1, р25=0, р75=1, min=0, max=2), тогда как в контрольной серии картины митозов наблюдаются реже. Однако количество клеток лимфоцитарного ряда меньше, чем в контроле, в основном за счет уменьшения числа средних лимфоцитов (Ме=0, р25=0, р75=1, min=0, max=2; р 0,05).
При этом относительное содержание средних лимфоцитов снижается до 2,6% (в контроле 10,4%), а НЛ - от 24,6% до 16,5%, хотя абсолютное их количество в мазке существенно не меняется (3,36±0,93; р 0,05).
Плотность клеток ПЖ возрастает в 1,5 раза, в основном за счет МФ, эо-зинофильных лейкоцитов и плазматических клеток (от 13,33±1,83 до 19,55±1,08/ 8000 мкм"; р 0,05). При этом уменьшается процентное содержание клеток лимфоцитарного ряда, особенно за счет средних лимфоцитов (Ме=0, р25=0, р75=1, min=0, max=2; р 0,05).
На 2-е сутки эта тенденция сохраняется как в отношении клеток мак-рофагального, так и лимфоцитарного ряда. Плазматических клеток меньше, чем на 1-е сутки (Ме=1, р25=1, р75=1, min O, max=l;), но их количество на исследованной площади значимо больше по сравнению с контролем (р 0,05). Плотность лимфоцитов, по-прежнему, мала. На 2-е сутки МФ составляют почти 49% состава клеток перитонеального мазка, в т.ч. более 40% - широкоплазменные макрофаги (у интактных крыс МФ составляли не более 30% без учета количества эритроцитов). Общее количество клеток на площади мазка 8000мкм составляет 16,78±0,96, что меньше, чем на 1-е сутки (р 0,05), но выше по сравнению с контролем (р 0,05). На 2-е сутки снижается число клеток гранулоцитарного ряда (количество НЛ - 2,89±0,78; р 0,05).
На 3-й сутки число НЛ и лимфоцитов увеличивается до уровня показателей контрольных крыс. Значимо повышается плотность моноцитов (Ме=2, р25=0, р75=2, min=l, max=3; р 0,05) и митотическая активность клеток (Ме=1, р25=0, р75=1, min=0, max=2; р 0,05). Плотность «перфторофагов» на 8000 мкм площади мазка снижается до 6,22±0,84, что относительно ниже, чем на 2-е сутки. Общая плотность клеток на указанной площади составляет 18,89±1,77(рис. 6, б).
На 7-14-е сутки идет постепенное снижение плотности клеток — до 16,0±1,5 на 7-е сутки и до 14,14±1,5 - на 14-е сутки. К этому сроку снижается до уровня контроля, как плотность клеток ПЖ, гак и количество МФ. Относительно чаще встречаются клетки плазматического ряда: незрелые ПлК (Ме=1, р25=0,5, р75=1, min=0, max=2) и зрелые ПлК (Ме=1, р25=1, р75=1,5, min=0, max=2; р 0,05), их число на 7-14-е сутки выше, чем у интактных крыс (Р 0,05).
Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных 2 серии
На фоне введения озонированного физ. р-ра через 24 часа увеличивается плотность клеток в мазках (до 16,44±1,65; р 0,05). При этом наиболее выражена реакция со стороны клеток гранулоцитарного ряда, в первую очередь, НЛ. Количество их, по сравнению с контролем, увеличивается (до 6,11±1,05; р 0,05, в контроле - 4,11±1,05). В отношении МФ и плазматических клеток существенные сдвиги не обнаруживаются.
Несколько больше, чем в контроле, обнаруживаются фрагменты клеток, представленные в основном апоптозными телами; встречаются отдельные клетки гранулоцитарного и мононуклеарного ряда с набухшими ядрами. Количество тучных клеток не меняется (Ме=0, р25=0, р75=1, min=0, max=2), но среди них больше клеток в стадии дегрануляции. Встречаются также эо-зинофильные лейкоциты, примерно в таких количествах, что и тучные клетки (Ме=0, р25=0, р75=1, min=0, max=2).
Еще через сутки, т.е. на 2-е сутки эксперимента количество клеток увеличивается до 18,22±2,52. Однако несколько меняется процентное соотношение клеток. Количество больших лимфоцитов достигает 1,78±0,96 (р 0,05), в контрольной серии встречалось значительно реже (Ме=0, р25=0, р75=1, min=0, max=l) и не во всех полях зрения.
К этому сроку, по-прежнему, увеличена также плотность нейтрофиль-ных гранулоцитов (р 0,05), редко встречаются палочкоядерные формы (рис. 7, а). На 3-й сутки плотность клеток ПЖ остаётся несколько повышенной, но меняется клеточный состав. В основном, гранулоциты представлены сегмен-тоядерными НЛ. Вместе с тем, отмечается снижение плотности клеток по сравнению с предыдутцими сроками экспериментов.
На 7-е сутки плотность и состав клеток перитонеальной жидкости крыс 2-й серии практически не отличается от нормы. Мононуклеарных фагоцитов примерно столько же, что у интактных крыс, но среди них превалируют моноциты, количество которых на данный срок составляет 2,0±0,54. Количество макрофагов при этом снижается (р 0,05 по сравнению с контролем). Лим-фоцитарный ряд представлен в основном средними и малыми лимфоцитами.
На 7-е сутки количество НЛ снижается, приближается к норме и эта тенденция сохраняется до 14-ти суток (рис. 7, б). На 14-е сутки общая плотность (13,62±1,38) и клетоточный состав в мазках такие же, что у интактных крыс(13,33±1,86).
Цитодинамика перитонеальной жидкости у животных 3 серии
Динамика клеточного состава ПЖ у крыс 3 серии совпадает с показателями 1 серии. Усиление миграции МФ, что обнаруживалось у животных 1 серии, на 1-7 сутки наблюдается и в 3 серии.
При этом на 1-2-е сутки повышается количество широкоплазменных вакуолизированных макрофагов (рис. 8, а), а на 3-е сутки, вместе с тем, и число моноцитов; количество их значимо увеличивается только к данному сроку (Ме=1, р25=1, р75=2, min=l, max=3, р 0,05 по сравнению с контролем), хотя и на остальные сроки эксперимента они обнаруживаются чаще,, чем у интактных крыс.
Макрофаги, основная масса которых представлена «перфторофагами», составляют на 1-е сутки - 41,1%, на 2-е сутки - 47,42%, на 3-й сутки — 33,8%, на 7-е сутки - 32,22% и на 14 сутки — 26,17%, т.е. наиболее выраженная мак-рофагальная реакция отмечается в 1—2-е сутки эксперимента. Количество НЛ у крыс 3 серии в динамике эксперимента практически не меняется, однако в 1-е сутки наблюдается увеличение количества эозинофильных лейкоцитов (Ме=1,5, р25=1, р75=2, min=0, max=3; р 0,05), что составляет 7,4% от состава клеток ПЖ, в контрольной серии их количество составляло не более 1,6%). На 1 - 7-е сутки после введения ПФ до 6 до 8 раз (по сравнению с ин-тактными крысами) увеличивается число плазматических клеток, что в 1 - 2-е сутки составляет 4 — 5 % от клеточного состава ПЖ, а в 3 - 14-е сутки - до 7 % (в контроле - 0,8 % ).
Электронно-микроскопические исследования селезёнки и брыжеечных лимфатических узлов
Электронно-микроскопические исследования проведены только в 2-х сериях экспериментов, т.е. в сериях, где прослежена динамика развития калового перитонита на фоне введения озонированного НФ и озонированного физ. р-ра. Исследованы структуры селезёнки и брыжеечных лимфатических узлов, изъятых после декапитации животных (материал сразу фиксировали в растворе глютаральдегида) в сроки 24, 48, 72 часа и 7 суток с начала эксперимента.
Динамика ультраструктурной организации селезёнки и брыжеечных лимфатических узлов у животных 1-й серии опытной группы
У животных 1-й серии в 1-е сутки в красной пульпе селезёнки обнаруживаются лимфоциты, макрофаги, ретикулярные и ПлК. Встречаются широкоплазменные «пенистые» клетки. В цитоплазме этих клеток, помимо обычного набора орган елл и лизосом, определяются крупные вакуоли или ассоциации мелких пузырьков размерами 100-200 нм, а также вторичные ли зосомы (фагосомы) с остатками эритроцитов (рис. 45, а, б, в).
Пузырьки не окружены мембранами и напоминают мелкодисперсную эмульсию. Указанные клетки в литературе известны как «перфторофаги» (Голубев A.M. и соавт., 1995). В белой пульпе селезёнки часто встречаются крупные клетки с активным ядром, светлым матриксом и множеством полисом в цитоплазме, напоминающие клетки центров размножения. Повсеместно видны и ПлК.
В брыжеечных лимфатических узлах на этот срок перитонита определяется четкое разграничение зон коркового вещества: периферии, где плотно, наподобие кластеров, располагаются малые тёмно-ядерные лимфоциты с электронно-плотной цитоплазмой (иногда они формируют кластеры вокруг макрофага) и герминативной зоны, где встречаются более крупные клетки бластного типа и большие лимфоциты с обильной цитоплазмой и более активным ядром (рис. 46, а, б).
В обеих зонах коркового вещества встречаются макрофаги с длинными массивными отростками, плотными остатками и лизосомами в цитоплазме и единичные плазмоциты. В центрах размножения ЛУз видны разные фазы деления лимфобластов (рис. 47, а).
В строме межузелковой зоны определяются кровеносные капилляры со спокойным эндотелием, рядом с ними часто встречаются макрофаги, а иногда - ретикулярные клетки (рис. 47, б).
Через 48 часов в красной пульпе селезёнки обнаруживаются юные эритроциты. В синусах наблюдаются макрофаги с большими вакуолями и полуразрушенным фагоцитированным материалом и «перфторофаги» (рис. 48, а). В белой пульпе определяется много молодых лимфоцитов с активным синтезом, но митохондрии в отдельных из них разрушены.
На 2-е сутки периферическая зона коркового вещества брыжеечного лимфатического узла имеет примерно такую же картину, что в первый срок, но граница между зонами не всегда чётко определяется. В некоторых случаях демаркация границы осуществляется отростками ретикулярных клеток или цепочкой макрофагов, которые более активны в периферической зоне.
Через 72 часа электронно-микроскопическая картина красной и белой пульпы селезёнки существенно не отличается от предыдущего срока, в цитоплазме макрофагов, по-прежнему, определяются пузырки, не окруженные мембранами, которые напоминают мелкодисперсную эмульсию ПФ (рис. 48, б). Однако довольно часто попадаются молодые формы лимфоцитов и ПлК с расширенными цистернами эндоплазматического ретикулюма. Видны также некоторые клетки с липидными гранулами.
В герминативной зоне ЛУз брыжеечных лимфатических узлов встречаются ПлК. Вокруг узелков определяется относительно развитый коллаге-новый каркас (тонкие фибриллы коллагена 3 типа). В этот срок перитонита кровеносные капилляры стромы межузелковых зон с более активным эндотелием, нежели в предыдущие сроки эксперимента (рис. 49, а).
На 7 сутки перитонита в красной пульпе селезёнки определяются единичные эозинофильные лейкоциты. Относительно много макрофагов с обширными вакуолями и фагоцитированным материалом, такие же клетки встречались и на 3-й сутки (рис. 49, б).
В отдельных фагоцитах содержатся слившиеся «пузырьки» из эмульсии ПФ. Белая пульпа представлена преимущественно молодыми лимфоцитами.
В брыжеечном лимфатическом узле определяется четкая граница между зрелой и герминативной зонами. В герминативной зоне более интенсивно, чем в предыдущие сроки, протекает пролиферация лимфоцитов, встречаются фигуры митозов и картины, характерные для апоптоза. Отдельные макрофаги нагружены остатками ядер лимфоцитов, подвергшихся апоптозу. Эндотелий кровеносных капилляров относительно спокойный.
Динамика ультраструктурной организации селезёнки и брыжеечных лимфатических узлов у животных 2-й серии опытной группы
У животных 2-й серии в первые сутки острого калового перитонита в просветах синусоидов селезёнки выявляются макрофаги с многочисленными лизосомами и остатками эритроцитов. Встречаются также дегенеративные НЛ и лимфобласты с повреждёнными мембранами и митохондриями, а в ин-терстиции - НЛ и эритроциты.
В структурах брыжеечных лимфатических узлов определяются признаки острой фазы воспаления, в частности: НЛ обнаруживаются как в краевых, так и промежуточных синусах. Границы «зрелой» и «незрелой» зон коркового вещества — нечёткие. Кровеносные капилляры лимфатического узла с активным «раздражённым» эндотелием. Определяются макрофаги с крупными гранулами и лизосомами и юные лимфоциты с повреждениями мембран митохондрий; фигуры митозов встречаются редко (рис. 50, а).
Микробиологические исследования перитонеальной жидкости у больных основной и контрольной групп
Изученные при поступлении в стационар средние статистические показатели фагоцитарного блока (включая КЛ), количества цитохимически выявляемых КБ, уровней МПО нейтрофильных гранулоцитов, сывороточных бактерицидных факторов и лизоцима плазмы крови, которые являются важными компонентами врождённого иммунитета, основными неспецифическими факторами защиты организма, в исследованных клинических группах (основной и контрольной) очень близки при сопоставлении. Разности их средних величин и межгрупповая дисперсия незначительны.
Но все эти показатели крови больных как основной, так и контрольной групп (при поступлении в стационар), явно отличались от таковых среднестатистических исследованных добровольцев (3-я группа).
Однако на 3-й сутки лечения разница между средними статистическими показателями в основной и контрольной группах увеличивались, и по ряду показателей выявлялись значимые расхождения (табл. 23).
КЛ крови в контрольной группе до лечения составляло (11,54±4,74)х109/л, а на 3-й сутки явно снижалось (до (9,93±3,61)х109/л), что, несколько отличалось от первой группы - (9,27±0,89) х109/л, хотя разница между ними несущественна. Однако фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов в контрольной группе на 3-й сутки не отличалась от исходного уровня, тогда как в основной группе ФЧ увеличивалось до 61,0±3,98% и было близко к контролю. А другой показатель фагоцитарного блока (ФИ) также значительно ниже в контрольной группе (2,2±0,69), по сравнению с основной группой (2,87±0,5), хотя последний в среднем составлял 80,6% от такового у здоровых людей.
Такова же картина в отношении показателей внутриклеточной микро-бицидной системы, которая является клеточным фактором неспецифического иммунитета. Из клеточных факторов уровень как цитохимически выявляемых катионных белков, так и активности МПО нейтрофильных гранулоцитов на 3-й сутки лечения повышался только в основной группе (рис. 84, а, б).
При этом уровень активности МЛО в основной группе больных (1,93±0,19 у.е.) не отличался от нормы (р 0,05), что на 12% выше, чем в контрольной группе (1,7±0,21у.е.), а СЦП катионных белков - на 17,5% (р 0,05 по сравнению с исходным показателем и контрольной группой).
Из гуморальных факторов неспецифического иммунитета, уровень только лизоцима (4,37±1,82) в контрольной группе был несколько выше среднего исходного показателя (3,77±1,65), но в основной группе он значительно превышал исходный показатель и достигал 5,3±1,86. БА крови в контрольной группе не отличалась от той, которая наблюдалась у больных при поступлении и составляла 68,58±13,21%, а в норме - 93,6±2,17% .
На 5-е сутки стандартного лечения в крови у больных контрольной группы насчитывалось (8,95±2,08)х109/л лейкоцитов, что больше, чем показатель основной группы (р 0,05). Но, тем не менее, это количество значительно выше нормы - (5,19±0,49)х109/л, как в контрольной, так и в основной группе.
Фагоцитарное число (53,64±5,97%) на данный срок в контрольной группе не отличалось от показателя исходного и предыдущего срока. Но в основной группе, как уже отмечалось, он очень близок к норме (в основной группе - 62,17 3,38% и в норме - 64,5±4,84% соответственно). Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных контрольной группы сохранялась на низком уровне не только на 3-й (2,2±0,69), но и на 5-е сутки (2,4±0,43) с начала лечения, что также несравненно ниже нормы (3,56±0,45) и среднего показателя основной группы больных (2,96±0,49) к этому сроку лечения. Цитохимически выявляемые КБ и активность МПО нейтрофильных гранулоцитов составляли соответственно 0,88±0,08 у.е. и 1,75±0,14 у.е., что практически мало отличались от среднего показателя исходного уровня их содержания (рис. 85, б).
У больных контрольной группы выявляется тенденция к повышению (в отношении гуморальных компонентов) неспецифического иммунитета. БАС к 5-ти суткам увеличивалась на 7,3% и составлял 74,55±9,0%, а уровень ли-зоцима - более чем на 20% от исходного уровня, однако так же, как и другие показатели врождённого иммунитета, малы (рис. 86, 87), по сравнению с таковыми показателями здоровых людей (р=0,000).
При подключении к стандартному лечению внутрибрюшного орошения и внутривенной инфузии озонированного ПФ корригируется ряд факторов неспецифического иммунитета: к 3 суткам - частично и к 5-м суткам с начала лечения - полностью. И, как показали наши наблюдения, при комплексном лечении больных острым перитонитом не возникала необходимость в релапаротомии, тогда как в контрольной группе (24 больных) рела-паратомии были проведены у 5 больных (применив точный критерий Фишера, р=0,05).
Вместе с тем, у больных основной группы уже на 1-2-е сутки при лёгкой степени тяжести перитонита, и на 3-5-е сутки при перитоните средней степени тяжести, восстанавливалась также моторная активность желудочно-кишечного тракта, нормализовались реологические и многие биохимические показатели крови, ЛИИ, температура тела, ЧДД, ЧСС и др., тогда как у большинства больных контрольной группы те же показатели восстанавливались значительно позже (табл. 21).
