Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Структурная организация, кровоснабжение и лимфоток подкожно жировой клетчатки и мышц 12
1.2. Регенерация лимфоидной ткани в условиях нарушения ее целостности. 15
1.3. Современные представления о раневом процессе 16
1.4. раневой процесс и морфологическая характеристика ран 26
1.5. Лимфатическая система и метаболизм при обширной хирургической травме 28
1.6. Биостимуляторы и раневой процесс 32
1.6.1. Биостимулирующие свойства ангиогенина 32
1.6.2. Биостимулирующие свойства гиалуроновой кислоты 33
1.7. Морфология васкуляризированных комплексов тканей после их трансплантации 34
1.8. Резюме
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Объект исследования 41
2.2. Характеристика применяемых БАВ 43
2.3. Статистические методы обработки 46
Результаты собственных исследований
Глава 3. Структурная организация подкожно-жировой клетчатки в различные сроки после обширной хирургической раны при ее спонтанном заживлении
Глава 4. Структурная организация обширной хирургической раны после применения ангиогенина
Глава 5. Структурная организация обширной хирургической раны после применения куриозина
Глава 6. Структурная организация обширной хирургической раны после комплексного интраоперационного применения ангиогенина и куриозина ...76
Глава 7. Обсуждение результатов исследования 84
Выводы 96
Практические рекомендации 97
Список литературы
- Современные представления о раневом процессе
- Биостимулирующие свойства ангиогенина
- Статистические методы обработки
- Структурная организация обширной хирургической раны после применения куриозина
Современные представления о раневом процессе
Двухфазовая классификация, предложенная Barr Н., (1938) и подразделяющая на основе митотической активности клеток процесс заживления на пролиферативную фазу и фазу созревания, по существу, близка к классификациям, названным выше. Существенно иное содержание двух фаз раневого процесса содержится в классификации И. Г. Руфанова (1957) и А. И. Струкова (1971), характеризующих гистологическую картину заживления с точки зрения физико-химических процессов, протекающих в ране.
Необходимо отметить, что наиболее существенные различия в работах разных авторов касаются оценки сущности первой стадии раневого процесса. Некоторыми авторами эта стадия (Шимкевич А.И., 1977; Howes S., Horvey, 1929) понимается как фаза "латентного" состояния раны с заторможенностью метаболических процессов.
По характеристике же других авторов начальная фаза раневого процесса трактуется как активная фаза, сопровождающаяся процессом воспаления, существенным метаболизмом. Установлено, что в этой фазе происходит перестройка тканевого дыхания за счет усиления гликолиза, увеличивается проницаемость капилляров, миграция лейкоцитов, происходит повышение активности ряда ферментов в клетках и тканях (Hooker G.D., Taylor В.М., Driman D.K., 1999), усиливается фагоцитоз и литический процесс (Okada Т., 1986; Саркисов Д.С., 1977), что позволяет характеризовать эту фазу как фазу воспаления.
Определение первой фазы процесса заживления раны, как фазы воспаления, очевидно противоречит представлению о начальном периоде, как "латентном" и согласуется со взглядом на начальные проявления пост раневого процесса, как решающие и определяющие во всем процессе заживления в целом (Danpny Jackson 1962; Давыдовский И.В., 1969).
Положение о ключевой роли первой фазы в процессе заживления ран важно потому, что, если первая фаза во многом определяет последующее течение раневого процесса, следовательно, она должна определяться эволюционно закрепленными и индивидуально модифицированными особенностями организма - своеобразной "нулевой" фазой.
Ключевое значение подобной "нулевой" фазы утверждается или подразумевается многими исследователями. Так, В. И. Иоффе в 1970 г. подчеркивал значение периода, предшествовавшего заболеванию, и указывал на необходимость изучения иммунологических сдвигов организма в этом периоде. Это же положение, но уже применительно непосредственно к проблемам сепсиса в хирургии и лечении ран обосновывается в работах И. Г. Руфанова (1944), А. Д. Адо, В. М. Абросимова (1967), В. И. Стручкова и соавт. (1975).
Эти эволюционно закрепленные, но индивидуально модифицирующиеся потенции организма есть база для поддержания организма в состоянии гомеостаза путем адекватного реагирования различных его систем на любой воздействующий фактор.
Способность к гомеостазу является свойством высокоорганизованной саморегулирующейся системы и обнаруживается на любых уровнях организации системы от физиологического (Павлов И.П., 1930) до генетического (Петров Р.В., 1977). Индивидуальная изменчивость в способности к поддержанию гомеостаза отражается в изменчивости общей реактивности организма, которая проявляется и в типах конституции высшей нервной деятельности, и в различиях в обмене веществ, и в иммунологической реактивности. Все они отражают общую реактивность организма, как взаимосвязанные части целого, и имеют самое прямое отношение к раневому процессу (Вишневский А.А.,1989 Костюченок Б.М., 1975; Курбангалеев СМ. и соавт., 1977; Савельев B.C., 1976; Стручков В.И. и соавт., 1975; Стручков В.И., 1981; Шапошников Ю.Г., 1991).
Наиболее полно и обоснованно вопрос о воспалении и инфекции был освещен в трудах И. И. Мечникова (1884,1892), создавшего учение о воспалении как об активной реакции организма на действие повреждающих факторов внешней среды и в первую очередь возбудителей инфекции. Под влиянием этой теории хирурги перестали смотреть на гнойно-воспалительный процесс только как на результат отравления организма микробными и другими ядами, а увидели в нем защитную реакцию организма, способствующую устранению повреждающего фактора.
Такой взгляд на роль воспаления мог установиться в хирургии только после открытий Пастера и Листера, в новую антисептическую эру, когда воспалительные процессы стали протекать более доброкачественно и тяжелые септические осложнения ран, приводившие в большинстве случаев к летальному исходу, уже не носили такого массового характера, как в до антисептический период.
Еще в 19-м веке рядом авторов был поддержан и развит взгляд об активных защитно-приспособительных реакциях организма, происходящих в самой ране (Клейн К., 1884; Дмитриев Н. Н., 1891; Шанявский С. А., 1896; Афанасьев Н. Н., 1897; Цейдлер Г. Ф., 1899; Noetzel А., 1898).
В связи с этими представлениями действие антисептических средств, стало рассматриваться под новым утлом зрения: к ним стали предъявляться требования не столько убивать бактерии в ране, сколько ослаблять их и способствовать их уничтожению силами организма, т. е. антисептики должны были действовать бактериостатически.
Учитывая недостатки антисептического метода, хирурги стали стремиться к тому, чтобы уничтожать микробы другими способами, без применения ядовитых химических веществ. Способ уничтожения микроорганизмов с помощью физических факторов (например, высокая температура), получил название асептического, оказался превосходным при обработке перевязочного материала, инструментов и других предметов, выдерживающих высокую температуру. К началу XX столетия "асептический" метод лечения ран стал господствующим во всех странах.
Биостимулирующие свойства ангиогенина
Работа проводилась на 402 лабораторных крысах обоего пола, которые были разделены на 5-ть групп. Животные содержались в клетках в стандартных условиях вивария. Распределение животных по сериям и срокам представлено в таблице 1. Материалом для исследования послужили мягкие ткани после создания модели обширной хирургической раны межфасциального пространства в области спины путем туннельного отсепарирывания кожи с подкожной жировой клетчаткой и поверхностной фасции от прилежащих мягких тканей площадью до 12 см2, в последующем рана ушивалась только по краю разреза кожи, моделируя тем самым вариант аутопластики. Все манипуляции на животных проводили под эфирным наркозом. В группе сравнения происходило спонтанное приживление ткани вдоль отсепарированного межфасциального пространства. В третьей, четвертой и пятой группах, перед ушиванием обширной хирургической раны межфасциальное пространство обрабатывалось однократно ангиогенином, куриозином и их комплексом.
В последнее время сформировалось новое научное направление "терапевтический ангиогенез", в котором используются клонированные гены факторов роста кровеносных сосудов (Ляхович В.В. и др., 2002). В лаборатории генотерапии НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН отработан способ суспензионного культивирования бактерий в вихревом биореакторе "БИОК" для получения рек-ангиогенина человека (Мертвецов Н.П., 2002). Такие препараты перспективны для использования в генотерапии, но в какой степени они могут быть применены в условиях обширных асептических хирургических ран пока не известно, что и явилось одной из задач нашего исследования.
Средство включает основу, в виде водорастворимого полимерного геля полиэтиленоксида, и белок ангиогенина, в виде рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека при следующем соотношении компонентов: - рекомбинантный химерный белок ангиогенина человека 0,5-1000 мкг/мл - водорастворимый полимерный гель до 1 мл. В качестве рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека оно содержит генно-инженерный продукт, полученный культивированием бактерии Escherichia coli штамм BL21(DE3) pZZSA и выделенный из культуральной жидкости с использованием методов хроматографии. Средство дополнительно содержит бактериостатик (бензойную кислоту или бензоат натрия) в количестве не более 1,0 масс.%. Ангиогенин представляет собой катионный полипептид, состоящий из 123 аминокислот с молекулярной массой 14 кД и являющийся белковым фактором ангиогенеза. Он стимулирует функции эндотелиальных клеток важных для развития кровеносных сосудов. Этим объясняется интерес к ангиогенину, как к перспективному средству для лечения ран, ожогов, язв и сердечно-сосудистой патологии. Водорастворимый гель полиэтиленоксида с рН 5,0-7,0 и динамической вязкостью 3,0-5,0 Па/сек при 30С получают в соответствии с ВФС 42-3017-97 путем облучения 1%-ного водного раствора полиэтиленоксида-1500 ускоренными электронами. Продукт разрешен для использования в медицине и косметике. Срок хранения при + 20С шесть месяцев, а при температуре не выше + 10С в течение 2-х лет. Гель полиэтиленоксида (ПЭО) придает средству желеобразное состояние, оказывает на рекомбинантный белок некоторое стабилизирующее действие и повышает удобство пользования указанным средством.
В настоящее время значительный арсенал препаратов на основе гиалуроновой кислоты становятся предметом обширного научного поиска. Исследование ранозаживляющего действия гиалуроновой кислоты показало, что она является основой, на которой организуется нормальная тканевая архитектура. Кроме того, гиалуроновая кислота, являясь основным межклеточным веществом организма, способствует активации макрофагов, стимулирует физиологические репарационные процессы, ангиогенез и в определенной степени подавляет фиброгенез, обладает выраженной антибактериальной активностью и рядом других свойств. М. Т. Азнабаев, А. Р. Имаева, С. А. Башкатов, А. Ф. Габдрахманова (2004) на экспериментальных моделях in vivo показали, что гиалуроновая кислота оказывает антиэкссудативное действие, сопоставимое с эффектом нестероидных противовоспалительных средств. Гиалуроновая кислота проявляет антагонизм в отношении воспалительных эффектов гистамина. Учитывая вышесказанное, в своем исследовании мы использовали куриозин — препарат на основе гиалуроновой кислоты.
Куриозин (выпускает компания «Гедеон Рихтер») — вязкий, прозрачный стерильный раствор во флаконах по 10мл. Одобрен государственным фармакологическим комитетом МЗ России, регистрационный номер П № 011511/01-1999. Действующее вещество — ассоциат гиалуроновой кислоты и цинка. Расход препарата - 1 капля на 1см2 поверхности. Цинк является компонентом более 70 ферментов, большинство из которых участвуют в заживлении ран. По данным A.B.Lansdown (1996), при заживлении ран в фазе грануляции и эпителизации потребность в цинке повышается.
Оценка состояния процессов заживления раны и эффективности лечения проводилась до 30 суток. Объектом исследования служила ткань из зоны заживающей раны, кторая забиралась на 1, 3, 5, 7, 10, 15 и 30 сутки эксперимента. Забой животных производили путем декапитации под эфирным наркозом.
Статистические методы обработки
В качестве рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека оно содержит генно-инженерный продукт, полученный культивированием бактерии Escherichia coli штамм BL21(DE3) pZZSA и выделенный из культуральной жидкости с использованием методов хроматографии. Средство дополнительно содержит бактериостатик (бензойную кислоту или бензоат натрия) в количестве не более 1,0 масс.%. Ангиогенин представляет собой катионный полипептид, состоящий из 123 аминокислот с молекулярной массой 14 кД и являющийся белковым фактором ангиогенеза. Он стимулирует функции эндотелиальных клеток важных для развития кровеносных сосудов. Этим объясняется интерес к ангиогенину, как к перспективному средству для лечения ран, ожогов, язв и сердечно-сосудистой патологии. Водорастворимый гель полиэтиленоксида с рН 5,0-7,0 и динамической вязкостью 3,0-5,0 Па/сек при 30С получают в соответствии с ВФС 42-3017-97 путем облучения 1%-ного водного раствора полиэтиленоксида-1500 ускоренными электронами. Продукт разрешен для использования в медицине и косметике. Срок хранения при + 20С шесть месяцев, а при температуре не выше + 10С в течение 2-х лет. Гель полиэтиленоксида (ПЭО) придает средству желеобразное состояние, оказывает на рекомбинантный белок некоторое стабилизирующее действие и повышает удобство пользования указанным средством.
В настоящее время значительный арсенал препаратов на основе гиалуроновой кислоты становятся предметом обширного научного поиска. Исследование ранозаживляющего действия гиалуроновой кислоты показало, что она является основой, на которой организуется нормальная тканевая архитектура. Кроме того, гиалуроновая кислота, являясь основным межклеточным веществом организма, способствует активации макрофагов, стимулирует физиологические репарационные процессы, ангиогенез и в определенной степени подавляет фиброгенез, обладает выраженной антибактериальной активностью и рядом других свойств. М. Т. Азнабаев, А. Р. Имаева, С. А. Башкатов, А. Ф. Габдрахманова (2004) на экспериментальных моделях in vivo показали, что гиалуроновая кислота оказывает антиэкссудативное действие, сопоставимое с эффектом нестероидных противовоспалительных средств. Гиалуроновая кислота проявляет антагонизм в отношении воспалительных эффектов гистамина. Учитывая вышесказанное, в своем исследовании мы использовали куриозин — препарат на основе гиалуроновой кислоты.
Куриозин (выпускает компания «Гедеон Рихтер») — вязкий, прозрачный стерильный раствор во флаконах по 10мл. Одобрен государственным фармакологическим комитетом МЗ России, регистрационный номер П № 011511/01-1999. Действующее вещество — ассоциат гиалуроновой кислоты и цинка. Расход препарата - 1 капля на 1см2 поверхности. Цинк является компонентом более 70 ферментов, большинство из которых участвуют в заживлении ран. По данным A.B.Lansdown (1996), при заживлении ран в фазе грануляции и эпителизации потребность в цинке повышается.
Оценка состояния процессов заживления раны и эффективности лечения проводилась до 30 суток. Объектом исследования служила ткань из зоны заживающей раны, кторая забиралась на 1, 3, 5, 7, 10, 15 и 30 сутки эксперимента. Забой животных производили путем декапитации под эфирным наркозом.
Материал фиксировали в растворе Лилли (4% раствор параформальдегида на фосфатном буфере, рН 7,4). Далее гистологический материал проводили по общепринятой методике. Кусочки ткани заливали в парафиновые блоки с добавлением 5-6% чистого воска. Серийные срезы толщиной 5-7 мкм с блоков делали вдоль продольной оси, включая соприкасающиеся футляры. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азур П-эозином - для обзорных целей и пирофуксином по Ван-Гизон - для выявления соединительно-тканных элементов, толуидиновым синим на тучные клетки (ТК) (Волкова О. В., Елецкий Ю. К., 1982). Окрашенные препараты заключали в пихтовый бальзам и накрывали покровным стеклом. Морфометрия тканевых структур проводилась при помощи окуляр-микрометра МОВ-1-15х на светооптических микроскопах "Люмам-1-2", МБИ-15 и МБС-10 в соответствии с общепринятыми требованиями (Катинас Г. С, Полонский Ю. 3., 1970; Автандилов Г. Г., 1990, 2002; Weibel E.R., 1979).
Характеристика морфофункционального состояния прилежащих мягких тканей складывалась из суммарной оценки признаков, наблюдаемых при визуальном изучении гистологических препаратов и количественных методов исследования.
В зоне повреждения определяли клеточную плотность в пересчете на 1 мм2 и процентное содержание лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов, плазмоцитов, фибробластов; подсчитывали общее количество кровеносных и лимфатических сосудов в пересчете на 1 мм2, размеры их просветов (в мкм) и определение емкости кровеносного русла в стандартном поле зрения на просветленных препаратах в метиловом эфире салициловой кислоты после прижизненной внутрисердечной инъекции кровеносного русла 50% водной взвесью черной туши.
Статистическая обработка данных проводилась на ПК Pentium III с использованием электронных таблиц Excel - 2000 и статистического пакета SPSS for Windows 10.0.5. Графические иллюстрации построены при помощи компьютерных программных пакетов «Excel». Вычислялись средние арифметические величины (М) в относительных единицах и их ошибки (т). Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин определяли, сопоставляя значение критерия достоверности (td) со стандартными значениями критерия Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990). Статистическую оценку результатов исследования проводили при минимальном доступном уровне вероятности (95%), используемом при медико-биологических исследованиях.
Структурная организация обширной хирургической раны после применения куриозина
Начиная с 5-х суток микроскопически лейкоцитарный вал на дне раны не выражен, при этом, численная плотность макрофагов начинает значительно снижаться и к концу второй недели соответствует норме (табл. 15).
При комплексном применении ангиогенина и куриозина наблюдается и более ранняя по сравнению с другими сериями опытов пролиферация фибробластов (табл. 17). На 3-й и 5-е сутки численная плотность фибробластов максимальна.
На 7-е и особенно 10-е сутки наблюдения отмечается лучший гистоархитектурныи порядок, лучшая васкуляризация и отсутствие клеток воспаления. К 15-му дню эксперимента в центре раны коллагеновые пучки очень тонкие, бледно окрашенные, длинные, напоминают фиброзную ткань. В новообразованной ткани преобладают клетки с овальными, реже круглыми ядрами, типичных фибробластов уже мало и их количество (табл. 17) достоверно не отличалось от нормы, встречались пролиферирующие и макрофагоподобные клетки, которые преимущественно располагались в подкожной клетчатке. Отличительной особенностью данной серии экспериментов было значительно более раннее снижение интерстициального отека тканей, то есть на 7-е сутки эксперимента.
Как показали результаты проведенного исследования, применение ангиогенина и гиалуроновой кислоты (куриозин) сокращает средние сроки эпителизации ран и уже на 5-е сутки эксперимента наблюдается значительное уменьшение размеров раны вследствие равномерного стягивания ее краев. При проведении исследований отмечено наличие высоких общих и местных противовоспалительных свойств применяемого метода.
Отмечено уменьшение дегенеративно-измененных форм нейтрофильных гранулоцитов в ране на 3 и 5 дни после применения ангиогенина и куриозина, что говорит об ускорении процессов некротизации дистрофических тканей. Макрофаги опытных групп отличались большей величиной, полиморфностью, большим количеством включений. Характер макрофагов и их выраженная макрофагальная реакция отражают реализацию защитной функции соединительной ткани в организме, повышение интенсивности обмена веществ и фагоцитоза.
Преобладание в грануляционной ткани фибробластов при лечении ран ангиогенином и куриозином приходится на 3-5 сутки, при отдельном применении ангиогенина и куриозина - на 5-7 сутки, в то время как при спонтанном заживлении ран аналогичный этап созревания грануляционной ткани наступает к 10-15 суткам.
Таким образом, как показали результаты проведенного исследования, применение биостимуляторов ангиогенина и куриозина сокращает период рубцевания ран почти на неделю и способствует раннему стиханию воспаления, что свидетельствует о наиболее эффективном варианте комплексного использования данных препаратов.
Следовательно, комплексное применение ангиогенина и куриозина позволит уменьшить количество послеоперационных осложнений, ибо почти в 2 раза сокращается процесс реабилитации.
Внедрение предложенного способа комплексного интраоперационного применения ангиогенина и производных гиалуроновой кислоты в клиническую практику поможет оптимизировать результаты лечения больных, которым в силу необходимости приходится проводить широкие оперативные доступы при обнажении сосудисто-нервных пучков, а также в пластической хирургии и косметологии.
Проведение хирургических вмешательств на сосудисто-нервных пучках конечностей зачастую требует их обнажения на довольно обширном протяжении, и благополучное течение послеоперационного периода напрямую зависит от скорости регенераторного процесса в области асептической хирургической раны. Пересадки васкуляризированных комплексов тканей на сосудистой ножке или с микроанастомозами сосудов значительно расширили возможности пластической и реконструктивной хирургии (Домников А.В.,2000; Ichinose A. et all., 2004 и др.). В период бурного развития микрососудистой хирургии в 80-е годы основные исследования были направлены, во-первых, на достижение положительных результатов технического исполнения сосудистого шва, и функционирования микрососудистых анастомозов, которые свидетельствовали об эффективном решении проблемы сохранения жизнеспособности тканей; во-вторых, на изучение гистопатологии микрососудистых анастомозов с проведением их биопсии. Однако, вопросы усиления потенциальных возможностей комплекса тканей в процессах ангиогенеза остались без внимания.
Раневой процесс представляет собой сложный комплекс биологических реакций, последовательно развивающихся в тканях раны в ответ на повреждение. В ходе его имеют место деструктивные и восстановительные изменения тканей: соединительной, эпителиальной, нервной, мышечной. В нем находят отражение проблемы воспаления, химии биологически активных веществ и многие другие (Кузин М.И., и др., 1981; Белоусов А.Е., ТкаченкоС.С.,1988; Федоров В.Д.,1991; Белоусов А.Е.,1998; Ono М et.all. 1999 и др.).
