Введение к работе
Актуальность проблемы. В современной клинической практике для борьбы с онкологическими заболеваниями используется широкий набор лекарственных средств, однако даже при использовании всех доступных препаратов доля больных, отвечающих на терапию, очень невелика. Это свидетельствует о необходимости разработки новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний, основанных на глубоком понимании молекулярных механизмов канцерогенеза.
За прошедшее время было выяснено, что в механизмах канцерогенеза одну из ключевых ролей играют протеинкиназы. Так, у мышей было идентифицировано семейство, включающее три изоформы Akt-протеинкиназ, гомологичных онкобелку v-akt. Показано, что Akt-киназы играют ключевую роль в процессах онкотрансформации, контролируя такие важные процессы как пролиферация и выживаемость, стабильность генома, клеточный размер/рост, метаболизм глюкозы и неоваскуляризацию. Стало очевидно, что Akt-киназы -важные участники сигнального каскада, состоящего из таких белков как PI3K, PTEN, mTOR, eIF4E и NF-kB. В то же время была обнаружена частая гиперактивация АКТ-киназ в опухолях человека, а в дальнейшем показано, что большинство из белков АКТ каскада ассоциировано с развитием онкологических заболеваний.
Исследования in vivo показали, что повреждения отдельных звеньев сигнального каскада Akt (АКТ) приводят к развитию новообразований, а кооперация с другими онкогенами определяет возникновение более агрессивных фенотипов. Однако, было установлено, что конститутивная активация той или иной изоформы самой Akt-киназы в клетках молочной железы, простаты и поджелудочной железы трансгенных модельных мышей не приводит к опухолеобразованию, тогда как в незрелых Т-клетках происходит раковое перерождение. Наличие у этих мышей латентного периода продолжительностью в 10-20 недель, предшествующего развитию злокачественных лимфом, позволил предположить, что механизм генерации лимфом является опосредованным, и для полной трансформации требуются дополнительные генетические события/участники.
Цель и задачи работы. Целью этой работы было выяснение на моделях трансгенных мышей механизмов онкотрансформации, происходящей при активации протеинкиназы Akt2 в Т-лимфоцитах.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Создать трансгенные линии мышей, в которых используется Lck промотор для запуска экспрессии конститутивно активированной (за счет миристилирования) формы Akt2 на ранних стадиях развития тимоцита; у этих Lck-MyrAkt2 мышей изучить случаи спонтанного опухолеобразования и цитогенетические изменения, возникающие в Т-клеточных лимфомах.
Идентифицировать гены, затронутые хромосомными перестройками у Lck-MyrAkt2 мышей, и показать, что они обладают онкогенным потенциалом.
Разработать низкомолекулярные ингибиторы для продуктов найденных генов и выяснить, блокируют ли эти молекулы пролиферацию Lck-MyrAkt2 лимфомных клеток, содержащих специфические хромосомные перестройки.
Научная новизна и практическая значимость работы. Получена новая Akt-трансгенная мышиная модель, уникальной особенностью которой является способность развивать опухоли спонтанно. При кариотипировании развивающихся злокачественных лимфом в нескольких независимых линиях мышей наблюдали две повторяющиеся от опухоли к опухоли (recurrent) соматические хромосомные абберации, затрагивающие локусы генов Т-клеточных рецепторов: транслокацию хромосом 14 и 15 - t(14;15) и инверсию хромосомы 6 - inv(6). Показано, что результатом транслокации t(14;15) является повышение экспрессии известного онкогена с-тус.
Что касается инверсии хромосомы 6, то ее границы затрагивают ген эмбрионального транскрипционного фактора Dlx5, что приводит к драматическому повышению продукции последнего. Впервые показано, что ген Dlx5 является онкогеном: сверхэкспрессия Dlx5 в клетках мыши вызывает повышение пролиферативной активности, а подавление его экспрессии с помощью РНК-интерференции, напротив, снижает пролиферативный потенциал клеток. Сверхэкспрессия гена DLX5 была обнаружена в клинических образцах 3 из 7 исследованных лимфом человека. По результатам скрининга панели образцов опухолей человека NCI-60 экспрессия DLX5 обнаружена в большинстве опухолей рака груди, яичников, а также рака легких и некоторых других типов рака.
На основании анализа кристаллической структуры транскрипционного фактора DLX5 предсказано несколько десятков химических структур его лигандов. После тестирования на культурах клеток 14-ти предсказанных соединений для 2 из них впервые показана специфическая способность блокировать пролиферацию Ак12-трансгенных лимфомных клеток мыши с инверсией хромосомы 6, характеризующихся повышенной экспрессией Dlx5, в отличие от Akt2-трансгенных лимфомных клеток, не экспрессирующих Dlx5.
Поиск и изучение молекулярных процессов, вовлеченных в развитие опухолей, является необходимым условием для создания новых эффективных адресных методов лечения онкологических заболеваний. Настоящая работа позволила идентифицировать ген Dlx5 (DLX5) как ранее неизвестный онкоген, который может служить мишенью для терапевтического воздействия при Т-клеточных лимфомах, а, возможно, и при других злокачественных новообразованиях, и выявила несколько перспективных низко молекулярных ингибиторов белка DLX5.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и ряд примененных в работе методов внедрены в учебный процесс на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "13th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference" и "14th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference" (Филадельфия, США, 2008 и 2009 гг), на научной конференции Фокс-Чейзовского Онкологического центра, Филадельфия, США (2007 г) и на семинарах кафедры молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (2009 и 2011 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы" и "Список литературы". Работа изложена на 108 страницах и включает 23 рисунка, 1 таблицу. Список литературы содержит 185 ссылок.
