Введение к работе
Актуальность проблемы. Зелёный флуоресцентный белок GFP стал основой для разработки целого набора весьма востребованных современных технологий для молекулярной и клеточной биологии и биомедицинских исследований. Потенциал открытия GFP и его внедрения в повседневную экспериментальную практику был оценен Нобелевской премией по химии 2008 года. Вместе с тем, именно огромная прикладная значимость флуоресцентных белков обусловила заметное смещение центра тяжести их исследований в технологическую область, оставив существенные «белые пятна» в фундаментальных представлениях об этом интересном объекте. Действительно, при наличии тысяч мутантных вариантов GFP-подобных белков, десятков молекулярных сенсоров на их основе, сотен методов количественного и качественного анализа, немыслимых без данного типа белков, все еще остаются без исчерпывающих ответов такие вопросы, как биологические функции GFP-подобных белков, детали механизмов созревания и видоизменения их хромофоров и др.
Особый интерес, в частности, представляют различные типы фотоконверсий (т.е. изменений спектральных свойств под действием света), обнаруженные для некоторых природных и мутантных флуоресцентных белков. В последние годы фотоконверсия флуоресцентных белков применяется в передовых методах флуоресцентной микроскопии для слежения за перемещениями биологических объектов (клеток, клеточных органелл или индивидуальных белков), а также для получения изображений со сверхвысоким разрешением. До недавнего времени этот феномен считался достаточно «экзотическим», присущим лишь небольшому числу известных GFP-подобных белков. Настоящая работа посвящена открытию и изучению нового типа фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков. Полученные данные позволяют пересмотреть наши представления о фотоконверсии GFP-подобных белков и предположить, что она свойственна большинству представителей семейства. Детальное изучение фотоконверсии флуоресцентных белков вызывает большой интерес как в фундаментальном, так и в прикладном смысле.
Цели и задачи работы. Целью данной работы было всестороннее описание обнаруженного нами явления фотоконверсии зелёных флуоресцентных белков в красную флуоресцентную форму в присутствии акцепторов электрона. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи: 1) Охарактеризовать условия in vitro, необходимые для прохождения окислительной фотоконверсии зелёных флуоресцентных белков и описать основные физико-химические особенности данного явления; 2) Проверить возможность прохождения окислительной фотоконверсии зелёных флуоресцентных белков in vivo. 3) Предложить способы практического применения обнаруженного феномена.
Научная новизна и практическая ценность работы. Описан совершенно новый тип фотоконверсии зелёных флуоресцентных белков различного происхождения. Показано, что в процессе формирования красной флуоресцентной формы GFP происходит окислительно-восстановительная реакция, в которой сам белок выступает в роли донора электронов. Выяснено, что в качестве электронных акцепторов в указанной фотореакции могут выступать вещества самой различной структуры: от простых неорганических окислителей до целых белков. Экспериментально подтверждено, что окислительная фотоконверсия GFP может протекать внутри эукариотических клеток,
причём последние существенно отличаются друг от друга по способности индуцировать реакцию. Сделано предположение о возможности применения флуоресцентных белков в качестве индикаторов окислительно-восстановительного статуса клеток или их компартментов. Проведены эксперименты, подтверждающие возможность осуществления фото конверсии эндогенных GFP in vivo, в клетках коралловых полипов. Выдвинута гипотеза о связи способности флуоресцентных белков к переносу электронов с их биологической функцией. Выявлена корреляция между окислительной фотоконверсией и фотообесцвечиванием зелёной формы флуоресцентных белков при визуализации в живых клетках. Предложены и протестированы новые методы повышения фотостабильности зеленых флуоресцентных белков, основанные на модификации состава культивационных сред.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 92 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 206 ссылок. Диссертация содержит 26 рисунков и 9 таблиц.
Апробация работы. Работа прошла апробацию на V съезде российского фотобиологического общества (Пушино, 2008), Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), а также на международной конференции по микроскопии в Кракове (2009) и на 2-й конференции по флуоресцентным белкам и биологическим сенсорам (США, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах.
