Содержание к диссертации
Список сокращений 7
Введение 11
I. Обзор литературы 13
1.1. Адапторные белки 13
Особенности LIM-доменов 13
Характеристика PDZ-доменов 16
П.ГенТШРб 18
1.3. Ген Ш 19
RIL - представитель семейства белков ALP/Enigma 20
Происхождение и эволюционная консервативность семейства ALP/Enigma 21
Геномная организация гена RIL человека 23
Альтернативные транскрипты гена RIL человека 24
Эволюционная консервативность RIL 27
Анализ экспрессии R1L и других членов семейства ALP/Enigma в различных тканях 27
Репертуар взаимодействий белка RIL 30
RIL взаимодействует с протеинтирозинфосфатазой PTP-BL 30
Краткая функциональная характеристика PTP-Bas/PTP-BL 31
RIL взаимодействует с LIM-доменным белком TRIP6 32
1.3.8. Роль RIL в поддержании структуры актиновых стресс-фибрилл 33
Краткая характеристика а-актининов 35
1.3.9. Транспортная функция RIL 37
1.3.10. Возможное участие RIL в злокачественной трансформации 38
1.3.11. Данные о дифференциальной экспрессии RIL, полученные с
использованием микропанелей олигонуклеотидов 40
Лентивирусная система экспрессии 41
РНК-интерференция 43
И. Материалы и методы 45
II. 1. Работа с культурами эукариотических клеток 45
П. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование 45
II. 1.2. Трансфекция 46
П.1.3. Упаковка лентивирусных частиц 47
П.1.4. Очистка вирионов и трансдукция 48
П. 1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности
заражения клеток 48
II. 1.6. Оценка скорости клеточного деления 49
II.1.7. Определение скорости миграции клеток 49
Метод «зарастания раны» 49
Оценка подвижности клеток с помощью трансмиграционных камер 49
П.1.8. Измерение клеточной адгезии 50
И. 1.9. Колониеобразование в полужидкой среде 51
II. 1.10. Проточно-цитометрический анализ 51
И.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование 52
И.2.1. Получение химически компетентных клеток E.coli 52
И.2.2. Трансформация химически компетентных клеток E.coli 52
П.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 53
П.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 53
И.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 53
П.2.6. Лигирование ДНК 53
П.2.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе 54
4 И.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих немеченые белки и белки,
слитые с эпитопами Flag, НА, GFP 55
П.2.9. Получение конструкций для экспрессии РНК-шпилек для РНК-
интерференции 57
И.2.10. Получение репортерных конструкций 58
И.З. Выделение и анализ РНК 60
П.3.1. Выделение РНК, фракционирование и перенос на мембраны 60
П.3.2. Нозерн-блот анализ 60
П.3.3. ОТ-ПЦР 61
И.3.4. Выделение и анализ мРНК, связанной полисомами 63
П.4. Методы выделения и анализа белков 64
П.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов 64
П.4.2. Получение Triton Х-100-растворимой и нерастворимой фракций 64
И.4.3. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция 65
И.4.4. Иммунопреципитация 68
П.4.5. Иммунофлюоресценция 68
П.4.6. Определение соотношения полимеризованного и неполимеризованного
актина с помощью конфокальной микроскопии 70
П.4.6. Колориметрическое измерение активности В-галактозидазы (ONPG-
окрашивание) 73
П.4.7. Измерение активности люциферазы 73
И.4.8. Оценка времени полужизни белка 74
III. Результаты и обсуждение 75
III. 1. Оптимизация некоторых методов 75
III. 1.1. Оптимизация упаковки псевдовирусных частиц 75
III. 1.2. Оптимизация структуры РНК-шпильки для РНК-интерференции 78
111.2. Влияние измененного уровня экспрессии TRIP6 и RIL на морфологию и
физиологию клеток карцином 80
Ш.2.1. Тестирование конструкций для экспрессии shPHK, специфичных генам
TRIP6nRIL 81
Ш.2.2. Подавление экспрессии гена TRIP6 приводит к изменению морфологии
клеток 82
Ш.2.3. Изменение уровня экспрессии гена RIL влияет на морфологию клеток 85
Ш.2.4. Влияние изменения уровней экспрессии TRIP6 и RIL на скорость
миграции клеток 86
Ш.2.5. Экспрессия TRIP6 и RIL и скорость пролиферации клеток 88
Ш.2.6. Экспрессия TRIP6 и RIL по-разному влияет на способность клеток к росту
в условиях анойкиса 89
Ш.2.7. Гиперэкспрессия RIL усиливает адгезию клеток 91
Ш.2.8. Возможные механизмы эффектов, наблюдаемых при подавлении
экспрессии TRIP6 92
111.3. Возможная роль RIL при раке молочной железы 93
Ш.3.1. Анализ экспрессии мРНК RIL в опухолях человека 95
Ш.3.2. Экспрессия RIL в культурах клеток рака молочной железы человека 96
Ш.3.3. Статус RIL обратно коррелирует с экспрессией эпителиального маркера Е-
кадгерина в культурах клеток рака молочной железы 97
Ш.3.4. Изучение механизмов регуляции экспрессии RIL и Е-кадгерина при раке
молочной железы 99
Ш.4. Роль альтернативных изоформ RIL в реорганизации актинового цитоскелета 103
Ш.4.1. Изучение взаимодействия RIL с а-актинином 103
Ш.4.2. Альтернативные варианты RIL имеют различную локализацию в клетке 105
Ш.4.3. Изоформы RIL меняют распределение а-актинина-1 между цитоскелет-
ассоциированным состоянием и цитозолем 109
Ш.4.4. RIL повышает степень полимеризации актина за счет своего LIM доменаї 10
Ш.4.5. LIM домен RIL ингибирует разборку актиновых волокон 112
Ш.5. Карбокситерминальный пептид альтернативных форм RIL является сигналом
протеасомной деградации 116
Ш.5.1. Выявление короткоживущих форм RIL 116
Ш.5.2. Альтернативный С-концевой пептид RIL дестабилизирует гетерологичные
белки 118
Ш.5.3. Альтернативный С-концевой пептид RIL содержит PEST-мотив - сигнал
протеасомной деградации 120
Выводы 122
Благодарности 123
Список литературы 124
Список сокращений
а.о. - аминокислотный остаток
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВИЧ - вирус иммудефицита человека
ВПЧ-18 - вирус папилломы человека 18 серотипа
ДКП - длинный концевой повтор
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ - дитиотрейтол
н. - нуклеотид
ОРС - открытая рамка считывания
ОТ - обратная транскрипция
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, проведенная на матрице, полученной при обратной
транскрипции п.н. - пара нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота СЯЭ - сигнал ядерного экспорта ФСБ - фосфатно-солевой буфер ЭГТА - этиленгликольтетрауксусная кислота ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭМТ - эпителиально-мезенхимальная трансформация ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка AF (AlexaFIuor) - общее название флюоресцентных красителей, разработанных компанией
Molecular Probes
8 ALP (a-actinin associated LIM domain protein) - а-актинин-ассоциированный LIM-доменный
белок АРС (от adematous ppliposis coli) - ген-опухолевый супрессор, мутации которого
идентифицированы при семейном аденоматозном полипозе и спорадических
опухолях ободочной кишки CEF (от chicken embryonic fibroblasts) - куриные эмбриональные фибробласты CLP-36 (от carboxyl-terminal LIM domain protein of 36 kDa) - карбокси-терминальный LIM-доменный белок массой 36 кДа CytB (Cytochalasin В) - цитохалазин Б DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) - ростовая среда Игла, модифицированная
Дульбекко DMSO (dimethyl sulfoxide) - диметил сульфоксид
EGFR (от epidermal growth factor receptor) - рецептор эпидермального фактора роста ENH (от Enigma homologue) - белок, гомологичный белку Enigma ERK (от extracellular signal-regulated kinase) - киназа, регулируемая внеклеточными
сигналами, дерегуляция этого сигнального каскада часто встречается в канцерогенезе FACS (fluorescense-activated cell sorting) - метод проточно-цитометрической селекции клеток,
основанной на их флуоресценции FITC (fluorescein isothiocyanate) - флуоресцеин изотиоцианат, зеленый флуоресцентный
краситель GFP (green fluorescent protein) - зеленый флуоресцентный белок НА (от haemoagglutinin) - гемагглютинин, мотив, часто используемый для мечения
экзогенно-экспрессируемых белков HIV-1 (human immunodeficiency virus typel) - вирус иммунодефицита человека, тип 1 НМЕС (human mammary epithelial cells) - клетки эпителия молочной железы человека HRP (от horseradish peroxidase) - пероксидаза хрена
9 ІкВ (от inhibitor of кВ) - ингибитор кВ JNK (от Jun N-terminal kinase) - киназа N-конца Jun lacZ - ген [3-галактозидазы LatA (Latrunculin A) - латрункулин A LB - среда Луриа-Бертани LEF (от lymphoid enhancer factor) - лимфоидный энхансерный фактор, один из компонентов
бета-катенин-зависимого сигнального каскада LIM - структурный белковый домен, названный по первым буквам генов Нп-11, ijl-І и тес-3,
кодирующих белки, у которых он был впервые описан LTR (long terminal repeat) -длинный концевой повтор mCMV (minimal promotor of cytomegalovirus early gene) - минимальный промотор раннего
гена цитомегаловируса MEGM (от mammary epithelium growth medium) - специализированная ростовая среда для
культуры первичных эпителиоцитов молочной железы MES - 2-(К-Морфолино)этансульфоновая кислота
M-MLV (от Moloney murine leukemia virus) - вирус Молони лейкоза мышей NA (от numerical aperture) - числовая апертура объектива, характеристика, определяющая
разрешающую способность линзы NFkB - ядерный фактор каппа Б (от nuclear factor кВ) ONPG - о-нитрофенил-Р-Б-галактопиранозид PDLIM (от PDZ and LJM protein) PDZ - структурный белковый домен, названный по первым буквам белков PSD95, DlgA и
ZO-1, у которых он был впервые описан PIPES - пиперазин-КМ'-бис(2-этан)сульфоновая кислота РТР (от protein tyrosine phosphatase) - тирозиновая фосфатаза RE (response element) - чувствительный элемент
10 RIL (reversion induced LIM gene/protein) RISC (от RNA-induced silencing complex) - РНК-индуцированный комплекс,
осуществляющий сайленсинг SDS - додецилсульфат натрия shPHK - короткая шпилечная РНК, используемая для РНК-интерференции (от англ. short
hairpin) SIN (от self-inactivating) - самоинактивирующийся ДКП, необходимый для получения
ретровирусов, неспособных к репликации siPHK- короткая интерферирующая РНК (от англ. short interfering) TCF (от T-cell factor) - фактор T клеток, транскрипционный фактор, компонент бета-катенин-
зависимого сигнального каскада, гиперактивация которого часто встречается в
канцерогенезе TGFp - трансформирующий фактор роста Р (от англ. transforming growth factor Р) THRp - рецептор тиреоидного гормона бета (от англ. thyroid hormone receptor) TRIP6 (thyroid hormone receptor interacting pjotein 6) VSV-G (от vescular stomatitit virus G protein) - оболочечный белок G вируса везикулярного
стоматита, часто используется для псевдотипирования рекомбинантных вирусных
частиц WPRE (от woodchuck hepatitis virus rx)sttranscriptional regulatory element) -
посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка, повышает
стабильность вирусных транскриптов X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-0-галактопиранозид ZASP (от Z-band alternatively spliced PDZ-motif protein) - альтернативно сплайсированный
PDZ-белок Z-диска
Введение к работе
Недавнее завершение проекта «геном человека» параллельно с определением полной первичной структуры геномов многих других организмов, а также накопление большого массива данных об экспрессируемых последовательностях ставят перед исследователями принципиально новые задачи по обобщению, классификации и структурированию этой информации. Определение функций отдельных генов, поиск функциональных связей между ними, объединение их в функциональные цепочки, а затем и в функциональные сети -приоритетное направление современных молекулярной биологии и молекулярной генетики. Ключевую роль в интеграции сигнальных каскадов и тонкой регуляции их взаимодействий играют ЫМ-доменные цитоскелет-ассоциированные адапторные белки, представителями которых являются продукты генов RIL и TRIP6.
В свете многочисленных исследований последних лет некогда принятая точка зрения, что актиновый цитоскелет - просто статическая структура, обеспечивающая поддержание формы клеток, выглядит чрезмерным упрощением. Состояние актинового цитоскелета модулирует активность многих сигнальных каскадов; его интактность - необходимое условие внутриклеточного транспорта органелл. Реорганизация актинового цитоскелета играет основную роль в процессах адгезии и миграции клеток, а также при их злокачественной трансформации. В связи с этим выявление конкретных механизмов регуляции состояния цитоскелета, а также поиск и всестороннее изучение белков, вовлеченных в эти процессы, является одним из приоритетных направлений современной молекулярной и клеточной биологии. Изучение функциональных особенностей цитоскелет-ассоциированных белков RIL и TRIP6 может пролить свет на многие аспекты клеточной физиологии и опухолевой прогрессии, открывает широкие перспективы для детального реконструирования механизмов их участия в реорганизации актинового цитоскелета в норме
12 и патологии и закладывает основы для разработки в будущем новых подходов к диагностике и лечению рака.
Основной целью данной работы явилось исследование функциональных особенностей цитоскелет-ассоциированных LIM-доменных белков TRIP6 и RIL, их влияния на реорганизацию актинового цитоскелета, на морфологию и физиологию клеток, а также их возможное влияние на инвазивные свойства опухолевых клеток.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
Изучение влияния уровня экспрессии TRIP6 на морфологические и функциональные особенности клеток линий карцином.
Изучение морфологических и функциональных особенностей клеток линий карцином с измененным уровнем экспрессии RIL.
Анализ уровня экспрессии RIL в опухолях различного гистогенеза, в частности при раке молочной железы.
Выявление роли доменов белка RIL при его взаимодействии с альфа-актинином, и их влияние на состояние актинового цитоскелета.
Определение функционального мотива белка RIL, влияющего на стабильность белка RIL, и исследование механизма его деградации.
В методической части работы были поставлены задачи по оптимизации упаковки лентивирусных частиц для повышения эффективности трансдукции экспрессионных кассет в клетки-мишени и по совершентствованию структуры РНК-шпильки для наиболее эффективной РНК-интерференции в рамках лентивирусной экспрессии.
