Введение к работе
Актуальность темы
Обнаружение РНК-интерференции (РНКи) является наиболее крупными открытием последних десятилетий в молекулярной биологии в связи с ее биологической и практической значимостью. РНКи заключается в снижении уровня мРНК гена-мишени в присутствии двуцепочечной РНК (дцРНК), комплементарной этой мРНК. Трансфекция клеток или даже инкубация целого организма (например, Caenorhabditis elegans) в растворе, содержащем длинную дцРНК, гомологичную определенному гену, приводит к существенному снижению количества его транскриптов. Простота и универсальность этого метода подавления экспрессии генов сделала РНКи незаменимым инструментом в фундаментальных исследованиях. Очевиден огромный потенциал РНКи для прикладных медицинских исследований. На сегодняшний день описан ряд механизмов, родственных РНКи, и связанных с различными типами коротких РНК. Эти механизмы играют ключевую роль в таких процессах, как борьба с РНК-вирусами и эндогенными ретроэлементами (собственно РНКи), регуляция экспрессии генов (miPHK путь) и подавление активности мобильных элементов (piPHK путь). Однако независимо от функции того или иного пути, их ключевыми компонентами являются белки семейства Аргонавт (Ago) и короткие РНК, с ними ассоциированные.
Анализ коротких РНК из предшественников половых клеток животных, помимо уже известных siPHK (small interfering РНК) и miPHK (micro РНК), обнаружил отдельный класс коротких РНК, которые получили название piPHK (Piwi-interacting RNA). Как видно из их названия, биология piPHK неразрывно связана с белками подсемейства Piwi из семейства Ago. Главной функцией piPHK является защита генома от активности мобильных элементов (МЭ), повышенная экспрессия которых в предшественниках половых клеток может привести к высокой частоте транспозиций и передаче потомству инсерционных мутаций. piPHK позволяют подавлять экспрессию МЭ путем разрезания их мРНК за счет эндонуклеолитической активности белков Piwi, а также за счет процессов сайленсинга на транскрипционном уровне. piPHK путь является высоко-консервативным механизмом регуляции экспрессии генов, обнаруженным у всех изученных животных, включая млекопитающих. Однако ключевые этапы piPHK пути исследуются на модельном объекте Drosophila благодаря огромному арсеналу молекулярно-генетических подходов, разработанных для этого классического объекта,
Биогенез piPHK отличается от биогенеза siPHK и miPHK рядом особенностей. Наиболее важной из них является то, что большая часть piPHK происходит из дискретных
локусов, лишенных генов, но обогащенных фрагментами разрушенных МЭ (Brennecke et al., 2007). Эти локусы, называемые piPHK кластерами, многочисленны (к примеру, ~150 кластеров у дрозофилы) и могут быть протяженными (более 200 т.п.н.). В случае дрозофилы piPHK кластеры расположены, как правило, в перицентромерных или субтеломерных областях хромосом и суммарно составляют примерно 3.5% генома. piPHK кластеры являются центральным звеном piPHK пути, так как мутации, приводящие к нарушению их работы, приводят к остановке всего piPHK пути и драматической активации МЭ, вызывающей стерильность. Кроме того, piPHK кластеры обеспечивают устойчивость организма к внедрению в геном новых МЭ, ибо интеграция МЭ в эти локусы провоцирует синтез новых piPHK и как следствие подавление активности этих МЭ.
На сегодняшний день остается непонятой не свойственная другим геномным локусам способность транскриптов, генерируемых piPHK кластерами, продуцировать короткие РНК. Исследование структурно-функциональных особенностей piPHK кластеров осложняется их протяженностью и насыщенностью повторами. Целью данной работы является изучение предпосылок формирования piPHK кластеров с помощью разнообразных трансгенных конструкций, содержащих фрагменты эндогенных piPHK кластеров или МЭ. С помощью такого подхода была исследована роль геномной локализации и отдельных структурных элементов piPHK кластеров, необходимых для продукции piPHK.
Понимание механизмов регуляции генов представляется важнейшей задачей молекулярной биологии. Одним из таких механизмов является piPHK путь, роль которого состоит в контроле экспрессии МЭ. Исследования работы piPHK кластеров, центрального компонента piPHK пути, принципиальны для понимания эволюции геномов животных в контексте борьбы с МЭ, являющимися мощным источником мутагенеза.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение свойств piPHK кластеров D. melanogaster, и исследование факторов, необходимых для продукции piPHK. Были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ продукции piPHK трансгенными конструкциями, интегрированными в эндогенные piPHK кластеры.
-
Выяснить, будут ли активными эндогенные гетерохроматиновые piPHK кластеры в составе трансгенных конструкций, расположенных в эухроматине.
-
Провести замену различных областей, в первую очередь промотора, транспозонных piPHK кластеров и генного piPHK кластера Traffic Jam в целях поиска компонентов, определяющих продукцию piPHK.
-
Выяснить причину супрессии активности ретротранспозона /-элемента трансгенными конструкциями, содержащими транскрибируемый участок ретротранспозона I.
Научная новизна работы
В данной работе впервые проведены генетические манипуляции с протяженными эндогенными piPHK кластерами дрозофилы. Мы разработали метод исследования протяженных piPHK кластеров, который позволил сделать важные выводы об их функционировании. Было обнаружено, что типичная перицентромерная локализация кластеров не является предпосылкой процессинга piPHK, ибо при инсерции в эктопические сайты генома трансгенные кластеры имели активность, сходную с их эндогенными копиями. Также мы обнаружили, что собственные промоторы piPHK кластеров не важны для продукции piPHK, так как их замена на искусственный промотор не приводила к остановке процессинга piPHK. Генерация piPHK происходит независимо от места инсерции репортерной кассеты в трансгенный кластер, что говорит о том, что piPHK кластер представляет собой независимый структурно-функциональный локус, фактически любые участки которого способны к генерации piPHK. Исследование трансгена, встроенного в эндогенный piPHK кластер, подтвердило это наблюдение, а также позволило сделать вывод, что транскрипция кластеров имеет сильные отличия от транскрипции генов, так как здесь игнорируются сайты сплайсинга и терминации транскрипции. Эти свойства необходимы для сквозной транскрипции piPHK кластеров в связи с присущей им гетерогенностью последовательности. Помимо их важности для исследования биологии коротких РНК, искусственные piPHK кластеры представляются перспективным инструментом направленного подавления экспрессии генов в терминальных тканях, что может использоваться как в методических, так и в практических целях.
Апробация результатов
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях: на семинарах Отдела молекулярной генетики клетки ИМГ РАН, на семинарах Биологического факультета Калифорнийского института технологий, на международных конференциях по биологии коротких РНК (Ванкувер, Канада, 2012; Сноуберд, США, 2012; Уистлер, Канада, 2013)
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 статей в международных рецензируемых научных журналах.
Структура
Диссертация изложена на 95 страницах и включает в себя следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы. Диссертация содержит 4 таблицы, 15 рисунков и 176 ссылок.
