Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и методы 94
Глава 2. Изучение чувствительности клеток культуры ткани mdck к вирусам гриппа а и в, вызывавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в 1997-2004 гг 105
2.1. Опыт применения клеток культуры ткани MDCK для первичной изоляции вирусов гриппа из носоглоточных смывов 107
2.2 Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа A(H3N2) и их филогенетические связи с эталонными вариантами 118
2.3. Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1) и их филогенетические связи с эталонными вариантами 125
2.4. Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа В и их филогенетические связи с эталонными вариантами 131
Глава 3. Вакцинопрофилактика гриппа и тактика ее применения в группах риска 140
3.1. Оценка прививочных свойств и эффективности ди- и трехвалентных ЖГВ и ИГВ у детей школьного возраста в многолетнем наблюдении (1989-1995) 140
3.2. Выбор оптимальной схемы в тактике вакцинации против гриппа лиц пожилого возраста 167
3.3. Изучение эффективности отечественных ИГВ субъединичного типа 175
3.3.1. Изучение прививочных свойств и эффективности инактивированной субъединичной вакцины Грипповак СЕАЖ у лиц пожилого возраста 175
3.3.2. Изучение полимер-субъединичной трехвалентной вакцины Гриппол у детей школьного возраста 179
3.3.3. Изучение полимер-субъединичной трехвалентной вакцины Грипполулиц саллергозаболеваниями 187
3.3.4. Изучение полимер-субъединичной трехвалентной вакцины Гриппол у лиц пожилого возраста 193
3.4. Изучение прививочных свойств и эффективности зарубежных ИГВ расщепленного и субъединичного типов, а также тактика их применения в группах риска 200
3.4.1. Тактика применения вакцины Ваксигрип у детей с соматической патологией 200
3.4.2. Эффективность вакцины Ваксигрип у школьников в период одного прививочного сезона 206
3.4.3. Оценка эффективности Инфлювакт у детей дошкольного и школьного возраста 217
3.4.4. Сравнительное изучение прививочных свойств и эффективности ИГВ у лиц пожилого возраста 225
3.4.5. Опыт применения вакцины Ваксигрип при комплексной иммунизации призывников срочной службы 239
Глава 4. Изучение специфического действия химиопрепарата арбидола на эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В 247
4.1. Активность действия арбидола в отношении эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В in vitro 247
4.2. Оценка защитного действия арбидола в период эпидемических подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ у взрослых и детей 6-15 лет 248
Обсуждение результатов 258
Заключение 279
Выводы 281
Список литературы 283
- Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа A(H3N2) и их филогенетические связи с эталонными вариантами
- Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1) и их филогенетические связи с эталонными вариантами
- Выбор оптимальной схемы в тактике вакцинации против гриппа лиц пожилого возраста
- Оценка защитного действия арбидола в период эпидемических подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ у взрослых и детей 6-15 лет
Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп является одной из приоритетных задач
здравоохранения многих стран мира, имеющей важное медико-социальное значение. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), ежегодно в мире болеет гриппом от 3 до 5 млн. человек (249). В последние годы число официально регистрируемых случаев гриппа и острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) в РФ не превышало 30 млн. в год, при этом показатели заболеваемости в зависимости от эпидемического сезона составляли 645,7-5220,3 и 15950,3-29632,1 на 100 тыс. населения соответственно (25,48,79,80). Доказана роль гриппозной инфекции в обострении хронических соматических заболеваний и развитии осложнений, нередко приводящих к летальному исходу (25,67,395). «Дополнительная» смертность от гриппа в период эпидемий в разных возрастных группах колеблется от десятков до сотен случаев, а в период пандемии показатель может достигать 1000 случаев на 100 тыс. населения (25,68,155,249).
Эпидемии гриппа наносят огромный ущерб, как отдельным лицам, так и обществу в целом. По данным Минздравсоцразвития РФ, в 2004 г. экономические потери от гриппа и ОРВИ составили 82,6 млрд. рублей или 86,0% от всего ущерба, наносимого инфекционными болезнями.
В последние годы существенно изменился эпидемический процесс, для которого стали характерными длительная циркуляция антигенно-родственных вариантов вирусов гриппа A(H3N2), A(H1N1) и В и увеличение доли населения с высоким иммунитетом к ним; снижение интенсивности и удельного веса гриппа в структуре ОРВИ; высокие показатели заболеваемости детей, превышающие показатели взрослых в 2-3 раза (25,92,69). Кроме того, эпидемическая ситуация в мире осложнилась участившимися случаями инфицирования людей вирусами гриппа птиц A(H5N1), A(H7N7), A(H7N3) и A(H9N2), которые могут представлять опасность в плане формирования нового пандемического варианта и привести к 4-5 кратному увеличению заболеваемости (234,235,241,236-250,311,345,350,375,401).
В связи с вышесказанным, актуальными на сегодняшний день остаются проблемы, связанные с контролем за циркуляцией вирусов гриппа, изучением их антигенных и биологических свойств, внедрением новых гриппозных вакцин, поиском химиопрепаратов с противовирусной активностью, а также совершенствованием тактики их применения для достижения наибольшей эффективности специфической профилактики.
7 В России к середине 1990-х годов возникли проблемы с изоляцией из клинического материала вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В; вызывающих эпидемические подъемы заболеваемости, что резко- снизило уровень диагностики, ограничило включение российских штаммов в международный- мониторинг, затруднило отбор штаммов для производства гриппозных вакцин. Основная причина заключалась в снижении тропизма вирусов гриппа к тканям развивающихся куриных эмбрионов (к.э.), классической системе, используемой в течение многих десятилетий для их изоляции. В тоже время, была выявлена высокая чувствительность клеток культуры тканей млекопитающих (MDCK, Vero), которые, как показали многие исследователи, имели отличную структуру поверхностных рецепторов при сравнении с к.э. (148,185,443). Все это определило необходимость проведения изучения чувствительности различных систем для* первичной изоляции и культивирования эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В.
Несмотря на то, что грипп относят к неуправляемым инфекциям, результаты большого числа наблюдений свидетельствовали о высокой защитной эффективности гриппозных вакцин (5,7,13,17,25,36,77,100,86,156,165,189,195,199,204,288,302,318,328,331,351,376).
К началу проведения наших исследований отечественные живая (ЖГВ) и инактивированная цельновирионная (ИГВ) гриппозные вакцины представляли собой дивакцины, в состав которых входили вирусы гриппа A(H1N1) и A(H3N2). Эпидемическая значимость вируса гриппа В определила необходимость включения его в состав существующих дивакцин и изучения прививочных свойств вакцин как трехвалентных препаратов.
В 1990-х годах в Институте иммунологии Минздрава РФ (г.Москва) была подготовлена к клиническим испытаниям ИГВ полимер-субъединичнного типа Гриппол (83,84). Структурная композиция этой вакцины отличалась низким содержанием вирусных белков (по 5,0 мкг НА каждого из трех эпидемических вирусов) и включала в себя высокомолекулярный иммуномодулятор Полиоксидошиг (500 мкг), что могло способствовать расширению спектра рекомендаций по профилактике гриппа в разных возрастных группах населения и, в первую очередь, у детей младше 3-х лет, а также у лиц, имеющих в анамнезе хронические соматические заболевания.
В период проводимых исследований прошли лицензирование и ограниченные испытания на добровольцах новые для российских исследователей ИГВ зарубежных фирм-производителей расщепленного (сплит) типа - Бегривак (Chiron Bering, Германия), Ваксигрип (Aventis Pasteur, Франция), Флюарикс (Glaxo SmithKline, Германия) и субъединичного типа - Инфлювак (Solvey Pharma ГМБХ, Нидерланды), в
8 инструкциях по применению которых были включены рекомендации для детей в возрасте б мес. и старше (6,18,23,29,30,77).
Таким- образом, широкий спектр гриппозных вакцин определил актуальность проведения исследований- по изучению прививочных свойств и тактики их применения в различных группах населения и, в первую очередь, высокого риска заболевания гриппом и риска возникновения постгриппозных осложнений.
Наряду с вакцинацией важное* значение имеет поиск новых химиопрепаратов со
специфической противовирусной активностью. Одним из них стал отечественный
препарат арбидол, который был разработан в ЦХЛС-ВНИХФИ им. С.Орджоникидзе,
г.Москва. Авторами была показана его иммуномодулирующая,
интерферониндуцирующая и антиоксидантная активность, а также в опытах in vitro и in vivo ~ ингибирующая активность к ранее циркулировавшим вирусам гриппа А/Япония/1/57 (H2N2), В/Ли/40 и В/Сингапур/222/79 (26). Для последующей оценки эффективности арбидола необходимо было провести изучение его активности в отношении новых антигенных вариантов вирусов гриппа А и В; а также оценить его профилактическую эффективность в период эпидемических подъемов заболеваемости, особенно среди детей.
Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований, представленных в настоящей работе.
Цель исследования: разработка и обоснование тактики эффективного применения специфических средств профилактики гриппа в условиях современного эпидемического процесса.
Задачи исследования:
выявить особенности циркуляции вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В и их роль в современном эпидемическом процессе;
провести сравнительное изучение антигенных, биологических и молекулярно-генетических свойств эпидемических штаммов, циркулирующих в России, и вирусов гриппа, признанных экспертами ВОЗ в качестве эталонных (вакцинных) вариантов;
оценить прививочные свойства и эффективность отечественных трехвалентных ЖГВ и ИГВ у детей школьного возраста при их многолетнем применении;
изучить реактогенность, иммуногенную активность и защитную эффективность новой отечественной полимер-субъединичной инактивированной вакцины Гриппол в группах риска (дети, лица с аллергопатологией, пожилые);
оценить прививочные свойства и эффективность новых для- российского здравоохранения ИГВ расщепленного (Бегривак , Ваксигрип , Флюарикс ) и субъединичного (Инфлювак) типов в разных возрастных группах;
обосновать целесообразность схем последовательного И' комбинированного применения гриппозных вакцин в группах высокого риска заражения и высокого риска развития осложнений;
определить специфическую активность препарата арбидол в отношении эталонных и современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В;
изучить профилактическую эффективность арбидола в период подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ в организованных коллективах и разработать оптимальную схему его применения для детей.
Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН в период 1989-2004 гг., координационные планы по проблеме РАМН «Грипп, гриппоподобные заболевания, их профилактика и лечение».
Научная новизна исследования. Впервые в лабораториях службы
эпидемиологического надзора России внедрена и широко использована культура ткани-MDCK, что позволило повысить эффективность первичной изоляции эпидемических вирусов гриппа и уровень проведения вирусологических исследований; выявить штаммы, наиболее актуальные для диагностики и профилактики гриппа; составить ориентировочные прогнозы для Минздрава РФ.
В результате изолированы и изучены оригинальные штаммы вирусов1 гриппа, определившие направление их изменчивости в последующие годы. Штамм А/Москва/17/98 (выделен на MDCK), антигенный вариант новой эволюционной ветви вирусов гриппа A(H1N1), первым эталонным вариантом которой стал А/Пекин/252/95, был изолирован в нашей стране за 2 года до его активизации в качестве эпидемического. Штамм А/Москва/10/99 (выделен на к.э.) рекомендован экспертами ВОЗ с 2000 г. на 4 эпидемических сезона в качестве эталона вакцинного штамма A(H3N2). Штамм А/Москва/34/03 (выделен на MDCK) стал представителем новой разновидности вирусов гриппа, подобных эталону А/Фуцзянь/411/03(НЗЫ2), получивших наиболее широкое распространение в РФ в сезоне 2003-2004 гг. С возвратом после 10-летнего перерыва в активную циркуляцию вирусов гриппа, подобных В/Виктория/2/87, установлена циркуляция реассортантных форм эпидемических вирусов гриппа В (в сезоне 2002-2003 гг.), несущих поверхностные белки штаммов разных эволюционных ветвей (НА от В/Виктория/2/87-подобных и NA - от В/Ямагата/16/88-подобных).
Впервые изучены свойства и эффективность, отечественных трехвалентных ЖГВ и ИГВ при массовой многолетней иммунизации школьников, результаты которой выявили более высокую- профилактическую эффективность ЖГВ и позволили обосновать необходимость перерывов до 2 лет после 2-3-х летней ежегодной вакцинации.
Показана более высокая эффективность ИГВ* или ее комбинированного применения с ЖГВ для лиц пожилого возраста.
Представлены рекомендации по применению полимер-субъединичной инактивированной гриппозной вакцины Гриппол среди школьников, пожилых людей и лиц с аллергопатологией.
Доказана специфическая активность арбидола в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа А и, В. Впервые дана эпидемиологическая оценка профилактической эффективности применения различных схем и дозировок препарата арбидола у детей 3-15. Основные положения, выносимые на защиту.
Современный эпидемический процесс определяется циркуляцией вирусов гриппа A(H3N2), A(H1N1) и В, активность и долевое участие которых являются неравнозначными. Наряду с продолжающимся дрейфом вирусов гриппа, связанных с изменчивостью поверхностных белков (НА и NA), для современных эпидемических штаммов характерно снижение чувствительности к тканям куриного эмбриона и выраженный тропизм к клеткам культуры ткани млекопитающих (MDCK).
Внедрение клеток культуры ткани MDCK для первичной изоляции и культивирования эпидемических штаммов вирусов гриппа существенно улучшает систему этиологического и эпидемиологического надзора при гриппе в РФ, а также обеспечивает корректную оценку защитной эффективности гриппозных вакцин и химиопрепаратов.
Широкий спектр гриппозных вакцин, включающий в себя как отечественные препараты (ЖГВ, ИГВ цельновирионного типа, Гриппол), так и предлагаемые зарубежными фирмами-производителями (ИГВ расщепленного и субъединичного типов), расширяет возможности вакцинопрофилактики для эффективной защиты населения в целом и, в первую очередь, групп высокого риска заболевания и развития осложнений.
Эффективность вакцинопрофилактики зависит от многих факторов, среди которых - соответствие свойств вакцинных штаммов свойствам эпидемических вариантов, возраст прививаемых контингентов, тип вакцины, схема и кратность вакцинации, охват прививками коллективов.
Химиопрепарат арбидол обладает специфической антивирусной активностью' и подавляет размножение эпидемических штаммов «вирусов гриппа АиВ'в клетках культуры ткани MDCK.
Арбидол является эффективным профилактическим» препаратом для взрослых и детей 3-15 лет в период эпидемических подъемов заболеваемости, вызванных циркуляцией вирусов гриппа А и В.
Практическая значимость работы. Опыт изучения чувствительности клеток культуры ткани MDCK к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В позволил рекомендовать ее широкое применение для первичной изоляции в вирусологических лабораториях областных и городских Центров Госсанэпиднадзора (ЦГСЭН) ряда регионов России, провести обучение специалистов 26 регионов РФ и передать культуру для работы на местах. Данные, полученные автором настоящей работы, учтены при составлении «Методических рекомендаций по выделению вирусов, гриппа в клеточной культуре», подготовленных в ГУ НИИ гриппа РАМН, г. Санкт-Петербург и утвержденных Руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России 24.11.1999 г.
Результаты изучения антигенных и биологических свойств эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В позволили уточнить этиологию эпидемий и сезонных подъемов заболеваемости (1997-2004 гг.), особенности их территориального распространения; определить направления эволюционной изменчивости; выявить оригинальные штаммы. Полученные данные были включены в ежегодные информационные письма Минздрава РФ по итогам эпидемических сезонов * по гриппу и ОРЗ в России, которые также были представлены в штаб-квартиру ВОЗ и Всемирные справочные центры ВОЗ по гриппу.
Выделено 295 и изучено 551 (в т.ч. 256 - из базовых лабораторий ЦГСЭН ряда регионов РФ) эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Коллекция лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН пополнена 307 отечественными штаммами, 106 из которых переданы для включения в международный мониторинг в два Международных центра по гриппу - Отдел гриппа Центров по борьбе с заболеваемостью и профилактике (CDC&P), Атланта, США и Национальный институт медицинских исследований (NMR), Лондон, В еликобритания.
В Государственную коллекцию вирусов депонировано 4 оригинальных штамма -А/Москва/17/98 (H1N1), А/МоскваЛО/99 (H3N2), А/Москва/34/03 (H3N2), В/Москва/3/03. Один из перечисленных вирусов, А/Москва/10/99 (H3N2), был рекомендован экспертами
12 ВОЗ в качестве эталона вакцинного штамма, который использовали в составе гриппозных вакцин в течение 4 эпидемических сезонов (2000-2004 гг.).
Результаты изучения свойств гриппозных вакцин г позволили внедрить препараты в практику и совершенствовать тактику применения в различных группах населения. Данные были учтены при составлении Приказа Минздрава РФ N101/46 от 19.04.1995 г. «О- защите населения- от гриппа и других острых респираторных заболеваний», приложения 1 Приказа Минздрава РФ N25 от 27.01.1998 г. «Об усилении мероприятий по профилактике гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций». Результаты использованы при составлении двух «Инструкций по применению вакцины гриппозной трехвалентной полимер-субъединичной жидкой Гриппол», утвержденных главным Государственным санитарным врачом 08.07.1999 г. и 22.06.2001 г.; трех «Инструкций по применению препарата арбидол», утвержденных Фармакологическим комитетом Минздрава РФ от 11.05.1995 г., 11.12.1997 г. и 11.04.2002 г.
Использование широкого спектра вирусологических и серологических методов диагностики гриппозной инфекции позволило выявить закономерности формирования иммунитета при вакцинации; а также оценить профилактическую эффективность арбидола при гриппе и ОРВИ.
Апробация результатов исследования; Данные, вошедшие в материалы
диссертации, были доложены на II Международной конференции по «Выбору средств борьбы с гриппом» (Куршевиль, Франция, 1992); Первом Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1992); IX Международном конгрессе по вирусологии (Глазго, Шотландия, 1993); III Азиатско-Тихоокеанском конгрессе по медицинской вирусологии (Пекин, Китай, 1994); III Международной конференции по «Выбору средств борьбы с гриппом» (Квинсленд, Австралия, 1996); XXX Юбилейной международной конференции «Грипп - XXI век» (С.-Петербург, 1997); 7-ом съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); IV Международной конференции по «Выбору средств борьбы с гриппом» (Крит, Греция, 2000); Конференции, посвященной 100-летнему Юбилею А.А. Смородинцева (С.Петербург, 2001); I Европейской конференция по гриппу (Мальта, 2002); Всероссийской научно-практической конференции «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2002); Международном симпозиуме «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества» (С.-Петербург, 2003); 6-ой Международной конференции по молекулярной биологии (С.-Петербург-Москва, 2003); V Международной конференции по
13 «Выбору средств борьбы с гриппом» (Окинава, Япония, 2003); Научно-практической конференции «Факторы риска и здоровье населения в регионах России» (Липецк, 2004); I Международной конференции по гриппозным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004); Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (С.-Петербург, 2004); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (С.-Петербург, 2004).
Основные результаты диссертации отражены в 107 статьях, тезисах докладов на международных и всероссийских конгрессах, съездах и конференциях, а также методических рекомендациях.
Данные получены в соавторстве с А.Н.Слепушкиным, В.Т.Ивановой, А.Л.Беляевым, Н.П.Обросовой-Серовой, Т.А.Оскерко, Л.Н.Власовой, Е.Л.Феодоритовой, Е.С.Шевченко, С.Г.Чешиком, Л.В.Колобухиной, Л.Н.Меркуловой, Р.И.Вартанян (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН); Г.И.Александровой, Л.Г.Руденко, Е.П.Григорьевой, А.Егоровым, А.Р.Рекстиным (НИИ ЭМ, г. Санкт-Петербург); Г.Н.Агафоновой, В.Е.Брагиной, Л.И.Петровым, Л.И.Голубевой (Новгородский городской отдел здравоохранения и ЦГСЭН); М.А.Горбуновьгм, Г.А.Елыииной, Н.И.Лонской (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.Л.А.Тарасевича Минздрава России, г.Москва); А.С.Ивановой, Н.Г.Пучковой, Л.В.Панфиловой, А.В.Пичугиным (ГНЦ РФ Институт иммунологии Минздрава России, г.Москва); А.Л.Заплатниковым, Н.А.Коровиной (Российская медицинская академии последипломного образования МЗ РФ, г.Москва); И.В.Полеско, О.В.Шамшевой, Учайкиным В.Ф. (РГМУ и ООО Диавакс - Диагностика и вакцины, г.Москва); И.Л.Митюшиным, В.К.Таточенко (Научный центр здоровья детей РАМН, г.Москва); ВІВ.Рихтером, Р.А.Артюковым, Н.Н.Тарасевичем (Военно-медицинское управление ГКВВ МВД РФ, г.Москва); коллегами городских и областных ЦГСЭН в гг. Липецке, Ярославле, Томске, Новгороде Великом, Владимире, Челябинске, Омске, Н.Новгороде, Москве, Рязани, Хабаровске; Т.А.Гуськовой, И.С.Николаевой (ЦХЛС-ВНИХФИ им.С.Орджоникидзе, г.Москва); Л.В.Феклисовой, В.М.Шебековой (МОНИКИ, г.Москва); А.А.Сомининой, Е.М.Войцеховской (ГУ НИИ гриппа, г.С.-Петербург), а также коллегами других стран - А.Кендалом, Н.Кокс, Г.Холл, А.И.Климовьш (CDC&P, США); А.С.Монто (Школа здравоохранения Мичиганского университета, Энн Арбор, США); А.Хэем (NMR, Лондон, Англия); Г.Тэнноком (Королевский Мельбурнский технологичесий университет, Мельбурн, Австралия). Автор глубоко благодарен и признателен всем своим соавторам, а также выражает глубокую признательность и
14 искреннюю благодарность научному консультанту, Заслуженному деятелю науки РФ, профессору, доктору медицинских наук А.Н.Слепушкину.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, указателя литературы, состоящего из ПО работ отечественных и 360 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста и включает 75 таблиц и 37 рисунков.
Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа A(H3N2) и их филогенетические связи с эталонными вариантами
В популяции вирусов гриппа A(H3N2), циркулировавших в рассматриваемый период, определены 3 эталонных варианта - А/Сидней/5/97, А/Москва/10/99 и А/Фуцзянь/411/02 (табл.13). Изменчивость вирусов A(H3N2) происходила последовательно, и каждый следующий антигенный вариант сохранял свойства предыдущего эталона. С 1997 г. штамм А/Сидней/5/97 на протяжении двух эпидемических сезонов был признан эталоном для данного подтипа вируса гриппа А. В 1999-2000 гг. антигенные свойства эпидемических штаммов настолько изменились, что специфические антитела к А/Сидней/5/97 только на 1/4 и ниже гомологичного титра ингибировали их гемагглютинирующую активность. С этого периода в качестве эталонного варианта стал штамм А/Москва/10/99 (в Западном полушарии подобный ему А/Панама/2007/99), сравнение со свойствами которых проводили изучение эпидемических вирусов гриппа A(H3N2) на протяжении последующих 5 эпидемических сезонов. Результаты типирования штаммов в сезоне 2002-2004 гг. выявили некоторую гетерогенность вирусов гриппа A(H3N2) по результатам их взаимодействия с сывороткой к А/Москва/10/99. Позже, эксперты ВОЗ выбрали новый эталонный вариант А/Фуцзянь/411/02 (отечественный вариант - А/Москва/34/03). В перекрестных реакциях подтверждены их различия по антигенным свойствам: специфические антитела к А/Москва/10/99 нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса А/Москва/34/03 до 1/4 и ниже гомологичного титра, в тоже время, антитела к последнему из вирусов нейтрализовали активность вируса А/Москва/10/99 до 1/32 титра.
Долевое участие антигенных вариантов вирусов гриппа A(H3N2) распределилось следующим образом. Активность вирусов A(H3N2) в качестве ведущего фактора подъемов заболеваемости определена в 5 из 7 эпидемических сезонов, отсутствие изолятов - в 2000-2001 гг. и их низкая активность - 2001-2002 гг. Необходимо отметить и неоднородность эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H3N2), циркулирующих в пределах одного сезона. С 1997 г. социркулировали вирусы, подобные двум эталонным вариантам - А/Сидней/5/97 и А/Москва/10/99, сначала - приблизительно с равным долевым участием в эпидемическом процессе, с каждым последующим годом число штаммов последней разновидности увеличивалось, полностью вытеснив предыдущий эталон к 2001 г.
Необходимо отдельно остановиться на свойствах штамма А/Москва/10/99 (H3N2). В отличие от основной популяции вирусов гриппа A(H3N2), выделенных в эпидемическом сезоне 1998-1999 гг. в MDCK, этот штамм изолирован сотрудниками ЦГСЭН в г. Москве с использованием куриных эмбрионов и передан в нашу лабораторию для последующего изучения. Проведенное нами изучение биологических свойств штаммов А/Москва/і 0/99 и А/Сидней/5/97, результаты которого представлены в табл.14, показало, что они были сходны по ряду свойств. Оба вируса обладали термостабильным гемагглютинином при исследовании с широким спектром эритроцитов. Наибольшую чувствительность наблюдали к ингибиторам сыворотки морской свинки, наименьшую - к ингибиторами сыворотки крысы. Штамм А/Москва/10/99 хорошо репродуцировался в куриных эмбрионах (б lg ЭИД50/0Д мл) и обладал высокой иммуногенной активностью. Этот вирус легко адаптировался к другой чувствительной системе - клеткам MDCK, в то время, как только немногие из штаммов этого сезона, выделенные в культуре клеток, могли адаптироваться к куриным эмбрионам.
В рамках международного сотрудничества штамм был передан в два Международных центра ВОЗ по гриппу - NIMR, Англия и CDC&P, США. Включив этот штамм в сравнительное изучение с вирусами гриппа, изолированными в других странах, Комитет экспертов ВОЗ рекомендовал его в качестве вакцинного эталона на 1999-2000 гг. эпидемический сезон. Эталонным штаммом вируса гриппа A(H3N2) для гриппозных вакцин А/Москва/10/99 был в течение 4 эпидемических сезонов, в связи с чем представлялось целесообразным его депонирование в Государственную коллекцию.
Последние два эпидемических сезона (2002-2003 и 2003-2004 гг.) были вызваны преимущественной циркуляцией вирусов гриппа A(H3N2) - 66,0 и 100% соответственно. В антигенных свойствах циркулировавших эпидемических штаммов выявлены различия по сравнению с эталонным вариантом А/Москва/10/99. Подавляющее большинство эпидемических вирусов гриппа было отнесено к новому эталонному варианту -А/Фуцзянь/411/02 (отечественный антигенный вариант - А/Москва/34/03). Однако уже в последнем из анализируемых сезонов (2003-2004 гг.) некоторые эпидемические вирусы отличались от последнего эталонного варианта и нейтрализовались специфическими антителами к А/Москва/34/03 до 1/4 гомологичного титра и ниже. Процент таких штаммов в общей структуре составил - 10,0 (10 штаммов из 101 штамма в целом), что указывало на продолжающийся дрейф вирусов гриппа A(H3N2). Так как штамм А/Москва/34/03 стал одним из первых новых антигенных вариантов эталона А/Фуцзянь/411/02, приняли решение о депонировании его в Государственную коллекцию вирусов в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Результаты секвенирования НА1 отдельных представителей эпидемических вариантов вирусов гриппа A(H3N2) представлены в табл.15.
Антигенная характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1) и их филогенетические связи с эталонными вариантами
Эталоны вируса гриппа A(H1N1) были 3 антигенными вариантами -А/Иоганесбург/82/96, А/Пекин/262/95 и А/Новая/Каледония/20/99, последние два из которых определили начало новой эволюционной группы (табл.17). Специфические антитела к А/Иоганесбург/82/96 ингибировали эти вирусытолько до 1/16 титра и ниже. В тоже время, вирусы гриппа А/Пекин/262/95 и А/Новая Каледония/20/99 также отличались по своим антигенным свойствам.
Активность вирусов гриппа А(НШ1) в качестве ведущего этиологического фактора отмечена в двух сезонах - 1997-1998 гг. (54,0%) и 2000-2001 гг. (81,0%). В 2001-2002 гг. вирусы гриппа A(H1N1) изолировали только от спорадических случаев заболеваний (6,0%). В эпидемическом сезоне 2002-2003 гг. вирусы этого подтипа выделяли только в отдельных регионах РФ (22,0%), причем значительное большинство из них в г. Москве и Московской области (85,0%), остальные вирусы поступили из ЦГСЭН во Владимирской, Липецкой, Пермской и Ярославской областях.
Типирование эпидемических изолятов в РТГА со спектром специфических антител, определило их антигенную принадлежность к эталонным вариантам, а также их долевое участие в эпидемическом процессе. В структуре вирусной популяции штаммов сезона 1997-1998 гг. 49,0% составляли вирусы гриппа, подобные эталону А/Иоганесбург/82/96 (H1N1). Также выделены два изолята (5,0%), которые слабо реагировали со специфическими антителами к последнему из указанных эталонов (1/16 - 1/32), но в тоже время, реагировали с антителами к А/Пекин/262/95 (H1N1) до 1/4 гомологичного титра (А/Москва/17/98, выделен на MDCK) и 1/8 (А/Новгород/37/98, выделен на к.э.). Изоляция этих штаммов определила начало циркуляции вирусов гриппа А(НШ1) новой эволюционной ветви, первым эталоном которой стал А/Пекин/262/95. В табл.18 представлена характеристика свойств эпидемического штамма А/Москва/17/98 по сравнению с двумя эталонами вируса гриппа А(НШ1) -А/Иоганесбург/82/96 и А/Пекин/262/95. Изучение биологических свойств этого штамма показало, что вирус обладал термолабильным гемагглютинином; при прогревании в течение 1 часа титр вируса снижался с 1:256 до 1:64. Для штаммов А/Иоганесбург/82/96 и А/Москва/17/98 отмечена чувствительность к неспецифическим ингибиторам сыворотки кролика и отсутствие таковой в реакциях с сыворотками морской свинки и крысы. Так как штаммы с аналогичными свойствами ранее не были выделены на территории России вирус А/Москва/17/98 также депонировали в Государственную коллекцию.
Эпидемические штаммы, подобные вирусу гриппа А/Новая/Каледония/20/99, стали доминирующими в популяции циркулирующих среди людей вирусов гриппа А(НШ1) с началом эпидемического сезона 2000-2001 гг., заменив в качестве нового эталона вирус гриппа А/Пекин/262/95. В последующие сезоны активность этого подтипа вируса гриппа А составляла 6,0% и 22,0% в сезонах 2001-2002 гг. и 2002-2003 гг. соответственно.
В табл.19 представлены результаты сравнения характера аминокислотных замен в молекуле гемагглютинина (НА1) между эпидемическими и эталонными вариантами вируса гриппа А(НШ1). Общие аминокислотные замены для штамма А/Москва/17/98 и нового эталона А/Новая Каледония/20/97 отмечены в позициях 153,183 и 191.
В популяции вирусов гриппа A(H1N1), циркулировавших несколько позже, в 2000-2001 гг., также определены аминокислотные замены, позволившие отнести их к подобным эталонному варианту вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1). Эпидемические вирусы последующего периода циркуляции 2001-2003 гг. имели общие замены, отличные от последнего эталона в позициях 166 и 252.
Таким образом, общее число замен было связано со штаммовой специфичностью: 12-при сравнении с эталоном А/Иоганесбург/82/96, от 6 до 14 при сравнении с А/Пекин/262/95 и от 2 до 5 - с А/Новая Каледония/20/99. Замены были выявлены преимущественно в антигенных сайтах Са и SB, а также по всей молекуле НА1. Полученные результаты определили филогенетические связи между российскими штаммами, эталонами и вирусами гриппа, циркулировавшими в других странах мира, что демонстративно представлено на рис.13.
Выбор оптимальной схемы в тактике вакцинации против гриппа лиц пожилого возраста
Под эгидой ВОЗ в рамках российско-американского сотрудничества по программе, согласованной с Минздравом России и Комитетом социальной защиты населения г. Москвы, осенью 1995 г. организовано наблюдение по сравнительному изучению прививочных свойств и защитной эффективности трехвалентных отечественной ЖГВ и ИГВ (Флюшилд, США) при разных схемах их применения у пожилых людей. Исследование проведено совместно с сотрудниками отдела клинической вирусологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Отделения гриппа Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P), США.
В группы наблюдения были включены лица, имеющие в анамнезе хронические заболевания легких, сердечно-сосудистой, мочевыделительной и эндокринной систем в стадии компенсации, а также нарушения процессов обмена веществ и т.п. Из числа лиц, объединенных общим статусом здоровья, методом случайной гнездной выборки, были сформированы 6 групп наблюдения. Их численность и возрастная структура представлены в табл.37. Вакцинацию ЖГВ и ИГВ проводили в октябре 1995 г., ревакцинацию ЖГВ через 28-30 дней.
Оценка реактогенности ЖГВ и ИГВ. У 6,0% привитых ЖГВ регистрировали в основном наличие жалоб на головную боль и развитие катаральных явлений. Среди привитых ИГВ - было отмечено развитие гиперемии 26-50 мм - у 16,0% и гиперемии более 51 мм с инфильтрацией - в 1 случае (2,0%), сопровождающиеся также и кожным зудом. У лиц, привитых обеими вакцинами, регистрировали жалобы (6,0%), температурную реакцию до 38,2С у 1 привитого и развития гиперемии 26-50 мм - у 19,0% и более 51 мм с инфильтрацией - у 10,0%. Длительность реакций не превышала 2-4 дней. В контрольной группе на введение плацебных препаратов никаких реакций зарегистрировано не было. При последующей ревакцинации ЖГВ развитие реакций не наблюдали.
Изучение гтмупогепности ЖГВ и ИГВ. Результаты выявления диагностических приростов титров анти-НА к вакцинным вирусам гриппа, полученные в РТГА с парными сыворотками лиц групп наблюдения, представлены в табл. 38. Из приведенных данных видно, что у значительного большинства привитых ИГВ или ИГВ+ЖГВ (54,0-80,0%) и только у каждого 4-го из группы привитых ЖГВ регистрировали 4-х кратное нарастание титров антител к вирусам гриппа А и В (t 3 для всех групп привитых при сравнении с группой контроля). При схемах комбинированного применения двух вакцин, а также ревакцинации ЖГВ разница в показателях числа сероконверсий была незначительной и статистически недостоверной при сравнении с группой привитых только ИГВ (t= 0,7-1,2). При этом необходимо отметить, что в отношении вирусов гриппа А не были получены и статистически значимые различия по числу сероконверсий у лиц с исходными титрами антител 1:10 и ниже или имеющие анти-НА в титрах 1:20 и выше. В тоже время, в этой же группе такие различия были отмечены к вирусам гриппа В: у лиц с исходными титрами анти-НА 1:10 и ниже показатели были в среднем выше в 2 раза, по сравнению с серопозитивными лицами.
Анализ структуры поствакцинального иммунитета, представленный на рис.22, также выявил различие сравниваемых групп по характеру иммунного ответа. В группе привитых ЖГВ только половина лиц имела положительную динамику в титрах анти-НА. При этом, из числа ответивших положительно - 6,0% ответили диагностическими приростами ко всем трем вакцинным вирусам, 15,0% - к двум и 29,0% - к одному из штаммов.
Среди групп, привитых по схемам с использованием ИГВ, высокие показатели были получены в отношении приростов к 3 и 2 вакцинным вирусам (в сумме 67,0-78,0%), при показателях к одному из штаммов 16,0-27,0%, при этом, не ответили на вакцинацию только 3,0-11,0%. Между показателями в группах, привитых с применением ИГВ, статистически значимых различий получено не было.
Динамика показателей СГТ анти-НА в группах наблюдения приведена в табл.39. У привитых ЖГВ кратность приростов увеличилась к вирусу гриппа A(H1N1) -в 1,2 раза, A(H3N2) - в 1,25 раза и вирусу гриппа В - в 1,2 раза. В тоже время, в группах привитых ИГВ эти показатели соответственно составили: 1,9-2,2 раза, 1,6-1,96 раза и 1,4-1,5 раза. Статистически значимых различий в показателях анти-НА после законченной вакцинации среди групп привитых ИГВ по разным схемам выявлено не было. На рис.23 в сравнительном плане представлены показатели процента лиц с защитными титрами анти-НА (1:40 и выше)?после законченной вакцинации (декабрь 1995 г.) Четко выявляется разница между группами наблюдения, а также при сравнении их с группой контроля. В отношении вирусов гриппа А(НШ1) и A(H3N2) были получены статистически достоверные результаты различий между привитыми и непривитыми (при наименьших показателях в группе ЖГВ- 26,0±3,2 и 27,0±3,3, показатели в группе контроля, составили 12,0±2,9 и 7,0±2,3 соответственно). В отношении вируса гриппа В достоверные различия получены только для. групп, в которых применяли ИГВ; в тоже время, в группе, привитых ЖГВ разница показателей при сравнении с группой контроля оказалась не достоверной (ЖГВ!- 58,0±3,6и контрольная группа- 51,0±4,5). Необходимо отметить, что высокие исходные показатели уровней анти-НА к вирусу гриппа В могли повлиять в большей степени на приживаемость ЖГВ, что и стало причиной слабовыраженной динамики у привитых в этой группе наблюдения.
Оценка эпидемиологической эффективности. Эпидемический подъем, заболеваемости гриппом и ОРВИ был обусловлен активной циркуляцией вируса гриппа В, подобного В/Харбин/7/94, а также вируса гриппа А(НШ1), подобного А/Тайвань/1/86. Вирус гриппа A(H3N2) вызывал лишь, отдельные спорадические случаи. Таким образом, по антигенной структуре вакцинные штаммы в основном полностью1 совпадали с эпидемическими, вариантами. Оценку профилактической эффективности гриппозных вакцин, проводили! по двум показателям - суммарной заболеваемости гриппом и ОРВИ в течение декабря 1995 г. -апреля 1996 г., а также путем определения уровней инфицированности вирусами гриппа в сравниваемых группах. Отсутствие статистически значимых различий. в иммунологических показателях в группах, где ЖГВ и ИГВ применяли совместно, для большей достоверности оцениваемых результатов были объединены в одну. Полученные результаты представлены в табл.40. Показатели заболеваемости гриппом и ОРВИ по клинически выраженным случаям были ниже в группах привитых по сравнению с группой контроля в 1,4-2,7 раза, коэффициенты эффективности составили 31,8-52,0% соответственно. Однако, показатели эффективности для группы привитых ЖГВ были статистически недостоверными.
Оценка защитного действия арбидола в период эпидемических подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ у взрослых и детей 6-15 лет
Таким образом, в наблюдаемом коллективе имела место вспышка респираторных заболеваний смешанного характера, обусловленная вирусами гриппа A(H3N2) и В, а также парагриппа и аденовирусами.
Результаты изучения заболеваемости по клиническим диагнозам в разные периоды учета представлены в табл.73. Интервалы этих периодов составляли в среднем 2-3 недели. До приема препаратов в коллективе был достаточно высокий подъем заболеваемости ОРВИ, который в среднем составил 34,4%. Это и определило целесообразность начала проведения профилактики с помощью предлагаемого препарата арбидол. Необходимо также отметить, что до и после завершения профилактики арбидолом заболеваемость в обеих группах наблюдения была практически равной. Лишь в период приема препарата среди лиц, получавших арбидол, показатель заболеваемости ОРВИ бьш ниже в 2,3 раза по сравнению с лицами контрольной группы, разница показателей статистически достоверна.
Для изучения влияния арбидола на иммунологические показатели и, в частности, уровни специфических антител к вирусам гриппа А и В, парагриппа и аденовирусной инфекции, обследованы парные сыворотки у части лиц из групп наблюдения. Образцы крови собраны до начала профилактики и спустя 1,5 месяца после ее завершения. Показатели СГТ антител представлены в табл.74. Четко установлено, что уровень СГТ антител изменялся лишь незначительно и имел одинаковые тенденции к их повышению или снижению в обеих группах. При этом разница динамики во всех случаях была статистически недостоверной.
Таким образом, в настоящем наблюдении было изучено защитное действие арбидола на фоне сезонного подъема заболеваний ОРВИ в организованном коллективе молодых людей. Полученные результаты показали, что прием арбидола в дозе 0,2 г. ежедневно в течение 19 дней способствовал снижению случаев заболевания в 2,3 раза. Арбидол не оказывал влияния на показатели уровней СГТ антител к респираторным вирусам, в том числе вирусам гриппа A(H3N2) и В. Эти данные позволили подтвердить отсутствие иммунодепрессивного действия арбидола в период его применения.
Изучение эффективности разных схем применения арбидола в качестве профилактического средства у детей 6-15 лет. Работа выполнена в соответствии с «Постановлением Фармакологического комитета от 11.02.1993 г.», «Инструкции по клиническому изучению арбидола у детей в качестве лечебного и профилактического средства при гриппе и парагриппе», предоставленной ЦХЛС-ВНИХФИ, Программе испытания химиопрепарата арбидол для профилактики гриппа и ОРЗ у детей 3-14 лет, утвержденной директором НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, акад. Д.К. Львовым 1.02.1993, а также календарного плана. От органов здравоохранения Московской области получено и оформлено разрешение на изучение профилактического действия арбидола в закрытых детских коллективах.
В зимне-весенние периоды сезонов 1992-1993 гг., 1993-1994 гг. и 1994-1995 гг. на фоне подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ в детских коллективах закрытого типа (детские дома и школа-интернат) проводили профилактику с помощью арбидола. В наблюдение включали только здоровых детей 6-15 лет, не имеющих противопоказаний по состоянию здоровья в анамнезе или какого либо ОРВИ на момент начала профилактики. Группы наблюдения составили: в 1992-93 гг. - 99 детей, 1993-94 гг. - 132 ребенка и 1994-95 гг. - 104 ребенка, с учетом групп контроля. Исследование проведено совместно с сотрудниками МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, НИИ гриппа РАМН, г. С.-Петербург.
Коллективы детей были разделены на 2 группы: дети первой группы получали арбидол, второй - плацебо. Препараты принимали до еды из расчета 3-4 мг на 1 кг массы тела: дети 6-12 лет получали по 0,1 г, дети 13-15 лет - по 0,2 г. В разные эпидемические сезоны использованы отличные схемы приема препаратов. Препарат арбидол и плацебо получены из ЦХЛС-ВНИХФИ.
Профилактическую эффективность арбидола оценивали по учету случаев ОРВИ в указанные сроки, совпадающие с приемом препаратов, а также проведением лабораторной диагностики всех случаев ОРВИ титрованием парных сывороток в РТГА и ИФА. Кроме того, проведена оценка интерферониндуцирующего действия арбидола у 35 детей, у которых были взяты образцы крови перед профилактикой, на 14 день приема арбидола (плацебо) и через 1 день после окончания приема. В табл.75 представлены результаты изучения профилактической эффективности арбидола по данным показателей заболеваемости ОРВИ за три периода наблюдения. Необходимо отметить, что среди детей, получавших плацебо, регистрировали достаточно высокие показатели заболеваемости (79,1-141,9%), в том числе и частоту повторных случаев (17,3-32,8%), что является характерным для закрытых детских коллективов. В тоже время, у детей, принимавших арбидол, регистрировали снижение обоих показателей. При оценке эффективности разных схем применения арбидола, были получены более высокие показатели в случае применения препарата 3 раза в неделю или в течении 5 дней с последующим 2-ух дневным перерывом. Индексы эффективности составили 2,1, коэффициенты эффективности 51,3-51,5% соответственно.
