Содержание к диссертации
Список сокращений 7
Введение 8
Цели и задачи исследования 9
Научная новизна и практическая значимость работы 9
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Таксономическое положение полиовнруса и краткая
систематика семейства Picornaviridae 11
1.2. Молекулярно-биологическая характеристика полиовнруса 11
-
Структура и состав полиовирусной частицы 11
-
Строение генома полиовнруса 13
-
Жизненный цикл полиовнруса 15
1.23.1 Проникновение вируса в клетку 15
1 2 3.2. Трансляция геномной цепи РИК 15
1.2 3 3. Образование зрелых вирусных белков 16
/ 2 3.4 Переключение с трансляции на репликацию РНК 16
1.2.3.5 Образование нуклеотид-белковой затравки для
синтеза РИК 17
1.2.3.6 Синтез (-) цепей РНК 18
1.2.3.7. Синтез (+) цепей РНК 18
1.2.3.8 Сборка вирусных частиц 19
-
Функции неструктурных вирусных белков 19
-
Цис-элементы РНК полиовнруса 22
1.2.5.1. Oril 11
1.2.5.1. IRES 23
1.2.5 1. OriR 25
1.2.5.1. Oril 26
1.3. Основные механизмы изменчивости генома полиовнруса 29
-
Мутационная изменчивость 29
-
Рекомбинационная изменчивость 31
1.3.2.1. Репликативная модель рекомбинации 32
1.3.2 2. Нерепликативная модель рекомбинации 35
1.4. Эволюция полиовируса 36
-
Гетерогенность вирусной популяции 36
-
Негативная и позитивная селекции 37
-
«Нейтральная эволюция» 38
-
Скорость фиксации мутаций 40
1.5. Паралитический полиомиелит 42
-
Патогенез 42
-
История полиомиелита 43
-
Создание полиовирусной вакцины 44
-
Вакцинно-ассоциированный паралитический полиомиелит 45
1.6. Вакцшшо-родственные штаммы полиовируса 46
1.6.1. Фенотипические и генетические особенности
вакцинных штаммов 47
1.6.2. Мутационная изменчивость вакцинных штаммов полиовируса 50
1.6 2.1. Накопление мутаций штаммами Сэбина in vitro 50
1.62.2. Накопление мутаций штаммами Сэбина in vivo 52
1.6.3. Рекомбинационная изменчивость вакцинных штаммов
полиовируса 53
1.63.1. Методышявіениярекомбииантов 53
1.63.2 Частота выделения межтиповых
рекомбинантных штаммов 57
1.63 3. Организация геномов рекомбинантных штаммов 58
1.6 3 4. Рекомбинация между вакципно-родствеиными и дикими
штаммами полиовируса (или энтеровируса кластера С) 59
1.6.4. Сильно измененные штаммы полиовируса вакцинного
происхождения 63
1.64.1. iVDPV 63
1.64.2.cVDPV 64
1.7. Программа ВОЗ глобальной ликвидации
полиомиелита в мире 66
Постановка задачи 71
Глава 2. Материалы и методы исследования 72
-
Штаммы полиовируса 72
-
Молекулярные методы исследования полновирусных
штаммов 76
-
Подтверждение вакцинного происхождения с помощью ПЦР 76
-
Выделение РНК 77
-
Обратная транскрипция 78
-
Полимеразная цепная реакция 78
-
ПДРФ анализ 81
-
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 82
2.3. Методы молекулярного клонирования 83
-
Гидролиз ДНК эндонуклеазами 83
-
Аналитический и препаративный электрофорез в агарозном геле 84
-
Очистка фрагментов ДНК 84
-
Лигирование 85
-
Трансформация культуры клеток плазмидной ДНК 85
-
Размножение бактериальных колоний и выделение
плазмидной ДНК 85
2.4. Получение рекомбинантного и мутантных полиовирусов 86
-
Получение рекомбинантной плазмидной конструкции 87
-
Внесение мутаций в плазмиду pT7Sae3 90
-
Внесение мутаций в плазмиду pVS!(T7)IC-0(T) 91
-
Получение полноразмерных транскриптов 93
-
Трапсфекция и заражение первичной культуры клеток Vero 93
-
Использованные компьютерные программы 94 Глава 3. Результаты 95 3.1. Исследование эпидемиологических ситуаций, связанных с
рекомбинантными штаммами полиовируса вакцинного
происхождения 95
3.1.1. Независимая эволюция полиовирусных популяций
в одном организме 95
-
Рекомбинация - показатель родства между штаммами полиовируса 99
-
Длительная циркуляция вакцинно-родственных
рекомбинантных штаммов полиовируса 101
3.1.4. Циркуляция вакцинно-родственных штаммов полиовируса
в период временного прекращения вакцинации от полиомиелита 105
3.1.5. Рекомбинанты между штаммами вакцинного и дикого
происхождения 110
3.2. Анализ вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов
полиовируса, исследование причины их селекции 116
3.2.1. Выявление рекомбинантов среди природных изолятов
полиовируса 116
-
Определение районов рекомбинации 117
-
Предпочтительные схемы рекомбинации 124
-
«Горячие» и «холодные» районы рекомбинации 125
-
Вторичная структура РНК вакцинных штаммов полиовируса
в районах рекомбинации 128
3 2.5 1. Вторичная структура РИК в районах
«горячих точек» перекреста 128
3.2.5 2 Положение точно определенных точек перекреста
на элементах вторичной структуры 130
-
Возможная причина селекции рекомбинантов 131
-
Проверка гипотезы о селективном преимуществе рекомбинантов
и о селекции против аргинина в 15-м положении белка ЗА 134
Глава 4. Обсуждение результатов 140
4.1. Значение эпидемиологического исследования
природных рекомбинантов 140
4.1.1. Одинаковая рекомбинантная организация геномов-
показатель родства между изолятами 140
-
Фрагменты разного «возраста» и происхождения в составе геномов вакцинно-родственных рекомбинантных штаммов полиовируса 141
-
«Неопределенные» VDPV 144
-
Рекомбинантная организация геномов дериватов вакцины 145
4.2. Частота выявления рекомбинантов среди природных вакцинно-
родственных изолятов полиовирусов трех серотипов 146
4.3. Роль рекомбинации в эволюции полиовирусных популяций 148
-
Влияние рекомбинации на фенотип полиовируса 148
-
Возможность влияния рекомбинационных перестроек генома
на скорость и точность репликации 152
4.3.3. Вероятность количественного преобладания рекомбинантов
в популяциях полиовирусов 153
4.3.4. Возможное влияние особенностей механизма рекомбинации
на организацию геномов рекомбинантиых штаммов 154
Выводы 157
Список литературы 159
Список сокращений
ВАПП - вакцинно-ассоциированный паралитический полиомиелит
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ДТТ - дитиотреит
кДНК-ДНК-копия
МАВР - метод анализа вирусных рекомбинантов
нт. - нуклеотид
3'(5')-НТР - 3'(5') - нетранслируемый район
ОВП - острые вялые параличи
ОКИ - острая кишечная инфекция
ОПВ - оральная полиовирусная вакцина
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция
ОТ - обратная транскрипция
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РПИ - Расширенная программа иммунизации
темед - тетраметилэтилендиамин
ЦНС - центральная нервная система
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
AGMK - клетки почек зеленой африканской мартышки (african green monkey kidney)
CRE - цис-элемент репликации (cis-actlng replication element)
elF - фактор инициации трансляции эукариот (eukaryotic initiation factor)
IRES - сайт внутренней инициации трансляции (internal ribosome entry site)
MAP - связанный с микротрубочками белок (microtubul-associated protein)
MAPREC (mutant analysis by polymerase chain reaction and restriction enzyme cleavage)
-анализ мутаций с помощью ПЦР и рестрикции РАВР - поли-А связывающий белок (poIy-A binding protein) РСВР - поли-С связывающий белок (poIy-C binding protein) PTB - поли-пиримидин связывающий белок (polypyrimidine tract-binding protein) SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulphate) TBP - белок, распознающий ТАТА-промотор (TATA-binding protein) TNF - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor) VDPV - дериваты полиовирусной вакцины (vaccine derived polioviruses)
Введение к работе
Полиовирус является возбудителем тяжелого заболевания человека -паралитического полиомиелита. Его история насчитывает не одно тысячелетие, однако наиболее страшный удар человечеству он нанес в первой половине XX в , вызвав множество эпидемий во всем мире. Появление полиовирусных вакцин позволило начать борьбу с этим инфекционным агентом. И в настоящее время принято считать, что полиовирус почти побежден. Однако существуют факты, заставляющие в этом усомниться.
В 1988 г. Всемирная Организация Здравоохранения провозгласила Программу глобальной ликвидации полиомиелита, главная задача которой -прекратить циркуляцию диких штаммов полиовируса во всем мире. Основным оружием в борьбе с полиовирусами дикого типа являлась и является живая вакцина, содержащая ослабленные штаммы полиовирусов всех трех серотипов, не вызывающие заболевание, но способные выработать устойчивый иммунитет к полиовирусной инфекции. Ее применение позволило остановить циркуляцию диких штаммов полиовируса в большинстве регионов мира, снизить уровень заболеваемости полиомиелитом на несколько порядков. Однако, быстро эволюционируя, вакцинные штаммы, постоянно вносимые в человеческое сообщество, в процессе репродукции в желудочно-кишечном тракте человека зачастую приобретают нейровирулентность и способность к длительной трансмиссии, характерные для диких штаммов. Эти свойства делают их эпидемически опасными. Подтверждение тому - вызванные измененными вариантами вакцины вспышки заболевания паралитическим полиомиелитом. Нельзя исключить, что в случае победы над полиовирусами дикого типа их место займут полиовирусы вакцинного происхождения. В связи с этим изучение измененных вакцинных штаммов, механизмов и законов их эволюции в настоящее время является чрезвычайно важной задачей.
Существуют два основных способа изменения полиовирусного генома -накопление мутаций и рекомбинация. Известно, что некоторые мутации играют адаптивную роль в эволюции полиовирусов, способствуя повышению их жизнеспособности. Значение же рекомбинации неясно до сих пор. Понять его, а также разобраться в некоторых вопросах, касающихся биологического смысла образования рекомбинантов, и особенностей их распространения в человеческом сообществе мы попытались в нашем исследовании.
