Введение к работе
Актуальность темы. Нарушения ритма сердца - одно из наиболее частых и тяжелых осложнений различных сердечно-сосудистых заболеваний. Известно, что более чем у 90% пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда, возникают опасные для жизни нарушения ритма сердечных сокращений, которые могут привести к фибрилляции и внезапной остановке сердца (Каверина, 1986). В настоящее время антиаритмическая фармакотерапия является основным методом лечения нарушений сердечного ритма (Фогорос, 2009). Несмотря на появление большого количества антиаритмических препаратов, новых методов диагностики и схем фармакотерапии, достаточного эффекта от применения антиаритмической терапии до сих пор не получено. По данным мультицентровых исследований, эффективность противоаритмических препаратов составляет 50-70% (Touboul, 1990; Wyse et al., 2001; Каверина и соавт., 2007; Гиляров, Сулимов, 2009; Piccini et al., 2009), при этом отмечается их недостаточная эффективность в купировании аритмий и профилактике их рецидивов. Отдельной проблемой представляется наличие у многих известных и широко применяемых в медицинской практике антиаритмических средств (хинидин, новокаинамид, пропранолол, амиодарон, соталол, верапамил) аритмогенного действия (Бобров, Крупновицкая, 1991; Дощицын, 1993; Алперт, Фрейсис, 1994). Риск развития аритмогенного эффекта, по данным ряда авторов, составляет около 10% для большинства антиаритмических средств и чаще встречается у больных с сердечной недостаточностью в стадии декомпенсации и с нарушениями функции левого желудочка (Gorgeles et al., 1992; Сметнева и соавт. 1993). В этой связи разработка новых эффективных и безопасных антиаритмических средств, основанная на знаниях о молекулярных основах патогенеза аритмий, а также изучение механизмов их действия является актуальной задачей.
5-амино-экзо-3-азатрицикло[5.2.1.02'6]декан-4-он (лабораторный шифр Р11) -синтезирован и фармакологически изучен в ФГБУН Институте органической химии УНЦ РАН (Горпинченко и др., 2005; Петров и др., патент РФ № 2281938, 2006). Выбор соединения в качестве объекта исследования обусловлен его высокой биологической активностью, установленной в доклинических исследованиях in vivo, а главное, сложным фармакологическим спектром, включающим антиаритмические, противовоспалительные, анальгетические и ноотропные свойства. Проведенные исследования показали, что соединение проявляет выраженную активность в трёх экспериментальных моделях аритмии, воспроизводящих различные нарушения ритма сердца, включая наиболее опасную для жизни - фибрилляцию. Соединение по
выраженности антиаритмического действия превосходит большинство известных антиаритмических средств и нетоксично.
Лекарственное средство аллапинин (лаппаконитина гидробромид) был разработан в Институте химии растительных веществ АН Узбекской ССР в конце 70-х годов XX века и в настоящее время успешно применяется в медицине в качестве антиаритмического средства. Препарат проявляет высокую активность при различных формах нарушений ритма сердца, особенно при различных формах желудочковых аритмий, пароксизмальной мерцательной аритмии и при хронической монофокусной предсердной тахикардии (Джахангиров и др., 1987; Соколов, Джахангиров, 2002).
Изучение молекулярных механизмов формирования биологической активности лекарственных препаратов является приоритетной задачей фундаментальных фармакологических исследований, как на этапе доклинического отбора новых потенциальных лекарственных средств, так и для характеристики спектра действия уже применяющихся препаратов. С этой точки зрения большой интерес представляет изучение молекулярных механизмов формирования антиаритмической активности и оценка кардиотоксичности оригинальных и ранее известных препаратов. Данная работа посвящена исследованию механизмов действия веществ с антиаритмической активностью - оригинального соединения 5-амино-экзо-З-азатрицикло [5.2.1.0 ' ] декан-4-она и используемого в клинической практике препарата аллапинин. Следует подчеркнуть, что в доступной нам литературе сведения о молекулярных механизмах действия биологически активных веществ подобной химической структуры не обнаружены, что определяет приоритетный характер данных исследований. Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение молекулярных механизмов антиаритмической активности лекарственного средства аллапинин и оригинального соединения Р11 и оценка их потенциальных аритмогенных свойств. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Идентификация молекулярных мишеней оригинального соединения - 5-амино-экзо-
3-азатрицикло[5.2.1.0 ' ]декан-4-она (РП) и антиаритмического препарата аллапинин
в условиях моделирования нарушений сердечного ритма in vivo;
-
Разработка in vitro тест-системы для выявления потенциальных аритмогенных свойств химических соединений;
-
Оценка аритмогенных свойств оригинального соединения РП и препарата аллапинин с использованием разработанной тест-системы.
Научная новизна. Впервые проведено исследование молекулярных механизмов антиаритмической активности оригинального производного 5-амино-З-азатрицикло [5.2.1.0 ' ]декан-4-она. При сравнительном анализе изменений экспрессионного статуса генов в сердце крыс, индуцированных РП на фоне моделируемой in vivo
аритмии, выявлено 16 генов, воспроизводимо меняющих уровень экспрессии. Регулируемые препаратом гены кодируют белки внеклеточного матрикса (Gpcl, Timp2, Тітр 3), внутриклеточного сигналинга (Did, Ptp4al, Pde4D, PIK3R1, Gnal2), гликолиза (Pflcl), межклеточного взаимодействия (Jup), системы гемостаза (Plat), мембранно-связанных насосов и транспортеров (Slcl6al, Atpla) и другие (C-fos, Tip, Anxal). Полученные нами данные об избирательном влиянии Р11 на гены, продукты которых вовлечены в механизмы аритмогенеза, позволяют рассматривать это соединение в качестве перспективного средства патогенетически ориентированной фармакотерапии аритмий.
Проведено углубленное изучение молекулярных механизмов действия препарата аллапинин. Установлено, что на фоне аконитиновой аритмии аллапинин вызывает увеличение уровня мРНК генов, кодирующих различные типы К-каналов (Кспаб, Kcnjl, Kcnj4, Kcnq2, Kcnq4), Ca -канала (Cacnalg), везикулярного переносчика ацетилхолина (Slcl8a3). Снижение уровня мРНК отмечено для генов, кодирующих Na -канал (Scn8a), К+-каналы (Kcnel, Kcnsl), генов мембранных транспортеров (Atp4a, Slc6a9). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях аконитиновой аритмии аллапинин модулирует экспрессию генов Na -, К-, Ca -каналов, проводящих ионные токи (INa, ho, Iks, ікі, ІСат), которые участвуют в формировании различных фаз потенциала действия. Выявленное влияние препарата на уровень мРНК генов, кодирующих переносчики ацетилхолина и глицина, позволяет сделать предположение об участии указанных нейромедиаторов в механизмах реализации антиаритмических свойств аллапинина.
Получена тест-система для определения потенциальной аритмогенной активности исследуемых соединений, в основе которой лежит подход, основанный на детекции изменений локализации белков калиевого канала hERG при действии тестируемых соединений (Wible et al., 2005). Нами предложен более точный и чувствительный способ детекции результатов анализа с использованием проточной цитометрии, позволяющий количественно оценить эффект соединений на локализацию hERG канала. Впервые получены данные об отсутствии ингибирующего влияния на поверхностную экспрессию белков hERG канала соединения Р11 и препарата аллапинин.
Научно-практическая значимость работы. Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения данной работы, дополняют и расширяют существующие представления о спектрах и механизмах проявления фармакологической активности и возможных побочных эффектах исследованных соединений, что чрезвычайно важно для безопасной фармакотерапии аритмий. Использование полученной нами тест-системы на ранних стадиях разработки
соединений в качестве лекарств позволит отбирать потенциально кардиотоксичные
соединения и исключать их из дальнейших исследований. Знания о молекулярных
механизмах антиаритмической активности лекарственных соединений позволят
прогнозировать спектры фармакологических свойств и возможные побочные
эффекты препаратов, а также откроют новые перспективы их клинического
применения.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны ФЦП "Научные и
научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы" (ГК
02.740.11.0290; Соглашение № 8046), Грантом Президента РФ (Договор №
16.120.11.3290 - МД), Грантом по инновационным исследованиям "У.М.Н.И.К." (ГК
001200850086) и Грантом Программы Президиума РАН "Фундаментальные науки -
медицине".
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII Всероссийской
научной конференции с международным участием "Химия и Медицина" (Уфа, 2010),
XV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -
наука XXI века" (Пущино, 2011), IV Съезде фармакологов России "Инновации в
современной фармакологии" (Казань, 2012), III Всероссийской школе-конференции
молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии "Биомика-наука
XXI века" (Уфа, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи
в журналах из перечня ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы
