Введение к работе
Актуальность работы. Под молекулярным клонированием понимают ряд методов молекулярной и клеточной биологии, обеспечивающих размножение молекул ДНК в таких условиях, что потомство каждой исходной молекулы (то есть молекулярный клон) отделено от прочих. Для получения молекулярных клонов, как правило, молекулы клонируемой ДНК в составе ДНК-вектора внедряют в клетки так, что в клетку с высокой вероятностью попадает не больше одной молекулы такой рекомбинантной ДНК. В процессе роста и размножения клеток размножаются и рекомбинантные ДНК. Собственно на этой стадии и осуществляется молекулярное клонирование. Таким образом, получение нужных молекулярных клонов сводится к поиску и отбору клеток, содержащих в себе требуемые рекомбинантные ДНК. Отбор обычно проводят на основании фенотипических признаков, обусловленных присутствием в клетках искомой ДНК. При скрининге огромных генных библиотек, когда искомые клетки находятся среди миллионов других, становится актуальным повышение эффективности молекулярного клонирования. Существующие методы скрининга клонов используют один из двух основных форматов презентации живых клеток: двумерный формат (2D), используемый, например, при выращивании бактериальных колоний на поверхности агара, или одномерный формат (1D) проточной цитометрии, когда клетки, выстроенные по одной в цепочку в струе жидкости, сканируют, пропуская через детектор. В случае 20-формата клетки или клеточные колонии могут быть надежно идентифицированы по их морфологии или другим признакам; каждая из них занимает уникальное положение и поэтому может быть повторно исследована и извлечена для размножения. Однако у этого метода есть существенный недостаток - низкая пропускная способность. Высокую скорость скрининга (до 105 клеток в секунду) обеспечивает проточная цитометрия. Но идентификация клеток в этом случае не настолько полна и надежна, как при анализе клеток в 20-формате, и к заинтересовавшей исследователя клетке нельзя вернуться. Также клеточная сортировка, основанная на проточной цитометрии, приводит лишь к обогащению исходной популяции клетками выбранного типа, но не к получению истинных клонов. Совмещение преимуществ 1D- и 20-форматов скрининга клеток позволило бы существенно повысить эффективность молекулярного клонирования.
При работе с эукариотическими клетками, помимо скорости и надежности скрининга, возникает проблема поддержания клеток в физиологическом состоянии,
і
максимально приближенном к условиям многоклеточного организма. Имитацию таких условий обеспечивают трехмерные (3D) культуры, где клетки «подвешены» в матриксе геля. Однако клетки в этом случае расположены на разной глубине от поверхности геля, из-за чего они находятся не только в разных физико-химических условиях, таких как скорость газообмена, поступления питательных веществ и удаления продуктов метаболизма, но и не доступны для одновременного наблюдения, что существенно затрудняет их быстрый скрининг. От этих недостатков избавлены традиционные двумерные (2D) культуры, где клетки выращивают на поверхности стекла или пластика. Однако окружение клеток в 20-культурах существенно отличается от естественного, что препятствует правильному проявлению фенотипа. Это определяет актуальность совмещения преимуществ 3D- и 20-культур.
Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось повышение эффективности (быстроты и надежности) выделения клонов бактериальных и эукариотических клеток путем совмещения преимуществ одномерного и двумерного форматов скрининга, а также двумерного и трехмерного форматов культивирования клеток. Для достижения этой цели был применен метод слитых гелей, ранее изобретенный в лаборатории вирусных РНК Института белка РАН, и решены следующие задачи:
найти виды слитых гелей и способы их приготовления, обеспечивающие прочную иммобилизацию и жизнеспособность внедренных в гель бактериальных и эукариотических клеток, а также способность клеток размножаться в геле;
найти способы выстраивания внедренных прокариотических и эукариотических клеток в монослой;
найти способы регулирования глубины залегания клеточного монослоя;
определить максимально достижимую плотность монослоя для клеток разных типов;
оценить скорость скрининга клеток в монослое, максимально достижимую при ручном способе анализа;
найти способы извлечения из геля жизнеспособного потомства одиночных клеток;
использовать разработанные подходы для получения стабильных линий эукариотических клеток, продуцирующих заданный белок;
генетически охарактеризовать полученные чистые линии: определить копийность и место интеграции гена, кодирующего заданный белок.
Научная новизна и практическая значимость. Разработан метод анализа бактериальных клеток, совместивший производительность одномерной проточной цитометрии с преимуществами двумерного формата чашки Петри. Разработан метод культивирования эукариотических клеток, совместивший преимущества 3D- и 2D-культур. Разработан метод быстрого и прямого (в отсутствие антибиотиков и иных способов химической селекции, способных влиять на физиологическое состояние клетки) выделения стабильных линий эукариотических клеток. Продемонстрирована способность метода выделять истинные клоны эукариотических клеток. Разработан способ точного определения мест случайной интеграции известной чужеродной ДНК в клеточных хромосомах в отсутствие какой-либо дополнительной информации, кроме того факта, что интегрирована часть этой ДНК, которая кодирует селективный признак.
Разработанные методы могут быть использованы во многих областях молекулярной и клеточной биологии, а также в биотехнологии и медицине, в том числе с целью молекулярного и клеточного клонирования и белковой инженерии; исследования гетерогенных клеточных популяций и клеточной физиологии, дифференцировки стволовых клеток, морфогенеза тканей, злокачественной трансформации клеток, терапевтического и токсического действия лекарственных препаратов; клинической диагностики и выявления лекарственно устойчивых патогенных микроорганизмов.
Апробация работы и научные публикации. Работа прошла апробацию на открытом семинаре лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН. Результаты работы опубликованы в 2 статьях в международных научных журналах и доложены на 5 российских и международных научных конференциях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного методам скрининга и клонирования клеток, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и
