Введение к работе
Актуальность проблемы. Многочисленные исследования убедительно показали, что ДНК является критической мишенью при действии ионизирующей радиации на клетку. Кроне того, дефекты ДНК являются не только результатом действия патогенетических Факторов, но и процессов, связанных с нормальным функционированием генома (Cook, Brazell, 1975,1976; Filippovich et al., 1988). Поэтому, одной из актуальных задач современной радиобиологии является расшифровка механизмов, связывающих первичные повреждения ДНК с конечным эффектом действия радиации на клетку - с гибелью клетки,
С помощью различных физико-химических методов, продемонстрирована прямая корреляция между эффективностью репара-тивной системы клеток и их выживаемостью после облучения (Хестяников, 1986). Обычно репарация повреждений ДНК изучается усредненной по большому количеству клеток, что не позволяет наблюдать какую либо разницу между индивидуальными клетками в популяции. Можно предположить, что нерепариро-ванные повреждения не случайно распределены в популяции, а главным образом локализованы в некоторых клетках. Это делает необходимым проведение количественного определения репарации и уровня поврехденности ДНК в индивидуальных клетках.
Большинство информативных и широко используемых методов, с помощью которых изучают дефекты ДНК, позволяют получать лишь интегральные характеристики поврежденности клеточной популяции СОстермак, 1983). Наиболее чувствительные из них, неизбежно связаны с формированием надмолекулярного геля, в свойствах которого отражаются особенности структурной организации хроматина в клетках перед их лизисом (Olive et al., 1992). Это затрудняет интерпретацию получаемых результатов. Сравнительно недавно в литературе появились первые сообщения об использовании методов, связанных с наблюдением нуклеоидов и ДНК индивидуальных клеток (Uogelstein et al., 1980; Ostling, Johanson, 1984; Roti Roti, Wright, 1937; Gedik et al., 1992). Помимо высокой чувствительности, эти методы предоставляют уникальную возможность поклеточной регистрации повреждений ДНК, и тем самым оценивать гетероген-
'кость клеточных ПОПУЛЯЦИЙ.
Ранее е работах посвященных изучению фенонена интерфазной радиационной гибели липФоцитов тииуса ныыей CFilippovich et al. , 1982, 1983) было показано, что они характеризуются еысокой гетерогенностью по радиочувствительности, и высказано предположение о корреляции их радиочувствительности с уровней спонтанных повреждений ДНК в клеточных Фракциях. Дополнительное количество фоновых дефектов приводит к добавочной релаксации структуры хроматина, что делает геном более ранимый и изменяет условия функционирования репэративных ферментов С Evans et al., 198?; Schwartz, Vaughan, 1989). Кроне того, возрастание фонового уровня дефектов может способствовать запуску механизма интерфазной гибели клеток, поскольку известно, что один из механизмов запуска апоптоза связан с индукцией разрывов ДНК (Сорокина и др., ' 1988; Roy et al., 1992).
Поэтому цель» работы: явилось выяснение сзязи различной радиочувствительности липфоидных клеток с уроЕнеп спонтанной поерєждонности (СП) ДНК и гетерогенностью ПОПУЛЯЦИИ по этому показателю.
Для достижения сФорнулироЕанной цели необходимо было решить следіт.'іпе задачи:
-
Разработать вариант метода оценки повгежденности ДНК в одиночных клетках. Оценить воспроизводимость и информативность метода.
-
Исследовать гетерогенность, поврежденность и репарацию ШУ, в лимфоцитах тимуса мыпей - неделяшлхся радиочувствительных к .летках, погибающих главным образом в интерфозе (по механизму апоптоза),
-
Исследовать особенности структурной организации нук-леоидов, спонтанную поврежденность ДНК, пострадиационную репарацию и гетерогенность по этим показателям двух линий мышиной лимфоны L5178Y, различающихся по радиочувствительности.
Научная новизна и практическая ценность работы.
8 работе представлены данные по Феноменологии злектро-Форбтической миграции сверхполимерной ДНК одиночных клеток.
Впервые исследована повреждаемость и репарация индивидуального клеточного генома тимоцитов мышей и двух линий
клеток лимфомы L5178Y, различающихся по радиочувствительности. Охарактеризована гетерогенность этих клеток по спонтанной и индуцированной поврежденности генома.
Показано, что уровень спонтанных дефектов генома, двух линий клеток мышиной лимФомы L5178Y-R и L5178Y-S, прямо соответствует их радиочувствительности: чем выше уровень СП, тем выше радиочувствительность клеток. Это является ПРЯИЫМ экспериментальным подтверждением гипотезы о роли предсущес-твующих разрывов в радиочувствительности клеток.
Теоретическое значение диссертации определяется полученными данными о роли спонтанной поврежденности ДНК и гетерогенности популяции по этому показателю в различной радиочувствительности лимфоидных клеток. Основные положения работы позволяют обосновать поклегочный подход, при изучении повреждающего воздействия на популяцию в целом.
Практическая ценность работы состоит в том, что разработана новая методика анализа повреждений и репарации ДНК в индивидуальных клетках. Методика характеризуется простотой, точностью, воспроизводимостью, отсутствием радиоактивной метки и требует черезвычайно . малого количества клеточного материала. Ее выгодно отличает использование ЗВИ для автоматического анализа проб. Методика позволяет оценивать гетерогенность клеточной популяции по поврежденности и репарации ДНК, и выявлять в клетках субпопуляции с высокой радиоустой-чивостью/радиочувствительностью. Это дает возможность использовать ее для оценки эффективности лучевой и химической терапии опухолей, обнаруживать сравнительно небольшую часть поврежденных клеток в органах, т. е. оценивать токсическую нагрузку со стороны окружающей среды обитания (в том числе малых доз радиации).
Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на 28 конференции"Биохимического общества, Варшава, Польша, 1992; на 3-м конгрессе Международного общества радиационной защиты СIRPA8), Монреаль, Канада, 1992; на 2-м Радиобиологическом съезде, Киев, Укрэина, 1993; на радиобиологическом семинаре НХФ РАН, Москва, 1994; на иежлабораторной конференции ГНЦ РФ - Институт биофизики, Москва, 1995. Публикации. 'По материалам"диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментальных исследований, обсуждения, полученных результатов и выводов. Она изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 6 таблиц.;'. Список литературы включает 146 работ отечественных и зарубежных авторов.
