Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы , Ю
1.1. Определение болезни, история изучения 10
1.2. Эпизоотическая ситуация по ИБК, экономический ущерб 11
1.3. Организмы, восприимчивые к вирусу ИБК 12
1.4. Филогенетическая характеристика вируса ИБК 13
1.5. Морфология вируса ИБК 15
1.5.1. Поверхностные структуры 15
1.5.2. Геном 16
1.6. Механизм репликации вируса ИБК 18
1.7. Ранний патогенез ИБК 20
1.8. Тканевой тропизм возбудителя и клинические проявления инфекции ИБК ' 23
1.9. Патологоанатомические и гистологические изменения у птиц при заболевании ИБК 26
1.10. Антигенные свойства вируса ИБК 28
1.11. Природа иммунного ответа при ИБК 31
1.11.1. Особенности иммунной системы кур 31
1.11.2. Формирование иммунного ответа при ИБК 32
1.11.3. Локальный иммунитет при ИБК 3 5
1.12. Выделение вируса 36
1.12.1. Сбор образцов для выделения вируса ИБК 36
1.12.2. Системы для выделения вируса ИБК 41
1.14. Использование ТОК для исследования
прочих возбудителей 43
1.15. Заключение по обзору литературы 46
2. Собственные исследования 48
2.1. Материалы 48
2.1.1. Материалы для анализа эпизоотической ситуации по ИБК в различных странах мира и Российской Федерации , 48
2.1.2. Куриные эмбрионы 48
2.1.3. Птица (48
2.1.4. Сыворотки , 49
2.1.5. Вирус ИБК 49
2.1.6. Возбудители других инфекционных болезней 50
2.2. Методы исследования 51
2.2.1. Оптимизация методики приготовления и поддержания трахеальной органной культуры 51
2.2.2. Оценка цилиарной активности в ТОК 51
2.2.3. Определение чувствительности ТОК к возбудителям, вызывающим респираторные заболевания птиц 52
2.2.4. Выделение изолятов вируса ИБК 52
2.2.5. Количественный учет вируса ИБК 53
2.2.6. Оценка патогенности изолятов вируса ИБК 53
2.2.7. Определение безвредности живой вакцины против ИБК 54
2.2.8. Оценка иммунобиологических свойств отечественных изолятов вируса ИБК 54
2.2.8.1. Постановка реакции нейтрализации в ТОК 54
2.2.8.2. Перекрестное заражение 54
2.2.9. Подтверждение идентичности выделенных изолятов вируса ИБК 56
2.2.10. Определение антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур 57
2.2.11. Определение патогенности полевых изолятов Mycoplasma gallisepticum для восприимчивых животных 58
2.2.12. Статистическая обработка результатов экспериментов 58
2.3. Результаты собственных исследований 59
2.3.1. Эпизоотическая ситуация по ИБК 59
2.3.1.1. Антигенный спектр вируса ИБК 5 9
2.3.1.2. Эпизоотическая ситуация по ИБК в России 64
2.3.2. Оптимизация методики приготовления, поддержания ТОК, изучение чувствительности к вирусу ИБК 66
2.3.2.1. Оптимизация способа приготовления колец ТОК 68
2.3.2.2. Влияние способа культивирования ТОК 71
2.3.2.3. Влияние степени сформированности тканей трахеи на качество ТОК 73
2.3.2.4. Подбор поддерживающей среды для ТОК 75
2.3.3. Чувствительность ТОК эмбрионов кур к вирусу ИБК 76
2.3.4. Чувствительность ТОК к вирусам, вызывающим респираторные расстройства у птиц 78
2.3.5. Чувстствительность ТОК к возбудителям респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита птиц 19
2.3.6. Исследование иммунобиологических свойств патогенных изолятов вируса ИБК, выделенных на территории РФ 85
2.3.6.1. Исследование изолята «Щелковский» вируса ИБК 85
2.3.6.2. Исследование биологических свойств изолята вируса ИБК, выделенного в Краснодарском крае 88
2.3.7. Оценка антигенного родства изолятов вируса ИБК, выделенных на территории РФ 91
2.3.7.1. Получение гипериммунных сывороток 92
2.3.7.2. Реакция нейтрализации на ТОК 93
2.3.7.3. Оценка протектиености вакцины, приготовленной из изолята «Щелковский» вируса ИБК 97
2.3.8. Безвредность живой вакцины против ИБК с учетом
сохранения ЦА трахеи иммунизированных цыплят 98
2.4. Обсуждение результатов исследований 100
3. Выводы 112
4. Практические предложения 114
5. Список литературы
- Эпизоотическая ситуация по ИБК, экономический ущерб
- Системы для выделения вируса ИБК
- Материалы для анализа эпизоотической ситуации по ИБК в различных странах мира и Российской Федерации
- Оценка иммунобиологических свойств отечественных изолятов вируса ИБК
Введение к работе
Актуальность темы. Инфекционные болезни птиц, протекающие с признаками поражения респираторного тракта, являются1 актуальной проблемой для современного промышленного птицеводства. К наиболее распространенным заболеваниям относится инфекционный бронхит кур (ИБК), борьба с которым осложнена тем, что вызывающий его коронавирус способен проявлять высокую изменчивость, что приводит к появлению штаммов с новыми антигенными свойствами. Важным условием эффективной профилактики ИБК является соответствие антигенных свойств полевых изолятов возбудителя и штаммов, используемых для изготовления вакцины. Это обусловливает необходимость постоянного изучения выделенных возбудителей.
Определение антигенных свойств вирусов с использованием лабораторных моделей, таких как развивающиеся куриные эмбрионы (КЭ) или клеточные культуры, затруднено из-за продолжительной адаптации полевого вируса к указанным биологическим системам. За это время могут изменяться биологические и антигенные свойства штамма. Специфическое патогенное действие вируса на КЭ проявляется только после проведения 5-10 и более слепых пассажей, что удлиняет время выделения и затрудняет типирование вируса в реакции нейтрализации (РН). Некоторые штаммы вируса ИБК даже после продолжительного пассирования в КЭ не проявляют четкого эмбриопатического действия, что затрудняет детекцию и количественный учет вируса. Одной из альтернатив КЭ является выделение вируса ИБК в переживающих эксплантатах трахеи, где активная репликация вируса и проявление его цитопатического действия происходит уже в первом пассаже. Это значительно ускоряет и удешевляет процесс исследования, а также позволяет избегать изменений свойств вируса.
Применение переживающих эксплантатов трахеи куриных эмбрионов и цыплят - трахеальной органной культуры (ТОК) - для вирусовыделения и серологических исследований рекомендовано МЭБ и широко используется для исследования вируса ИБК. С этой целью практикуются различные способы ее приготовления и использования, которые, как правило, в публикациях иностранных авторов описаны недостаточно подробно, и в связи с этим затруднена воспроизводимость полученных результатов (60, 82, Кроме этого, имеются сообщения о высокой чувствительности ТОК к другим инфекционным агентам, вызывающим респираторные болезни птиц (63, 139).
Недостаточная изученность проблемы получения и практического использования ТОК послужила основанием для проведения комплексных исследований в этом направлении.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось обоснование использования переживающих эксплантатов трахеи куриных эмбрионов и цыплят для выделения и изучения биологических и иммунологических особенностей вируса инфекционного бронхита кур и других инфекционных возбудителей респираторных болезней птиц.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• на основе литературных данных проанализировать эпизоотическую ситуацию по ИБК в мире и в России;
• оптимизировать методику приготовления и поддержания органной культуры трахеи куриных эмбрионов и цыплят;
• определить чувствительность трахеальнои органной культуры к различным инфекционным агентам, вызывающим респираторные расстройства у птиц;
• разработать методику титрования вируса инфекционного бронхита кур и возбудителей других болезней в трахеальнои органной культуре;
• разработать методику типирования вируса инфекционного бронхита кур с использованием переживающих эксплантатов трахеи;
• оценить биологические свойства четырех изолятов вируса ИБК, встречающихся в России, в трахеальнои органной культуре;
• разработать метод оценки безвредности и иммуногенности вакцин с учетом сохранения цилиарной активности в эксплантатах трахеи.
Научная новизна исследований. В результате проведенных нами исследований: впервые в России разработана методика приготовления, поддержания и использования трахеальнои органной культуры куриных эмбрионов и цыплят для выделения и исследования биологических свойств возбудителей респираторных заболеваний птиц;
• определена чувствительность ТОК к вирусам ИБК, ньюкаслской болезни (НБ), вирусу инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ), пневмовирусу птиц (ПВП), аденовирусу 4 птиц, возбудителям респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита птиц;
• разработана методика титрования вышеуказанных инфекционных агентов;
• разработана методика оценки антигенного родства штаммов и изолятов вируса ИБК в реакции нейтрализации (РН) в ТОК;
• предложен метод оценки безвредности и иммуногенности вакцин против ИБК. Практическая значимость исследований. Практическое значение работы состоит в том, что разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
• «Методические указания по выделению, титрованию и оценке антигенного родства вариантов вируса инфекционного бронхита кур в трахеальной органной культуре», 2006 г.;
• «Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят», 2006 г.
Трахеальная органная культура использована для выделения отечественных штаммов изолятов вируса ИБК «Щелковский», «IBV663-07» и оценки биологических и серологических свойств штаммов «Калужский», «Таганрогский», изолятов «Щелковский», «IBV663-07», которые были использованы для создания полиштаммной вакцины против ИБК. Оценена патогенность изолятов «Щелковский» и «IBV663-07» вируса ИБК. Результаты научных исследований вошли в следующие нормативные документы, одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
• СТО «Вакцина против инфекционного бронхита кур полиштаммная инактивированная эмульсионная», 2006 г.;
• промышленный регламент на производство вакцины против инфекционного бронхита кур полиштаммной инактивированной эмульсионной», 2006 г.
Эпизоотическая ситуация по ИБК, экономический ущерб
Первоначально вирус ИБК относили к порядку Virales как Tarperia pulli, что было предложено R. A. Packer в 1950 г. и продолжено С. Е. van Rooyen, в 1954, который поместил возбудителя ИБК в подпорядок III, Zoophaginae, к вирусам, возбуждающим болезни животных. Инфекционный бронхит кур включили в сем. VII, Reedellaceae fam. nov., (вирусы, вызывающие генерализованную системную "инфекцию, характеризующуюся лихорадкой и некрозом ткани при отсутствии образования обширных макул, папул или везикул или выраженного повреждения нервных клеток), и род III, Tarperia - вирусы группы гриппа, включающие заболевания, характеризующиеся і принципиально вовлечением респираторного тракта (69).
Коронавирусьіі были признаны особой группой в 1968, а затем их выделили в отдельное семейство (исследования Almeida J. D. и др.). В настоящее время данный высокоинфекционный для цыплят агент относится к сем. Коронавирусы (Coronaviridae), роду Коронавирус (Coronavirus) (52).
Коронавирусы - моногенетическое семейство из 11 видов (172). Вирус ИБК является типоспецифичным для Coronaviridae. (36).
Семейство Coronaviridae включает вирусы, вызывающие серьезные заболевания кошек, крупного рогатого скота, свиней, кроликов, крыс, мышей и человека. Прежде всего они вызывают респираторные и пищеварительные расстройства; однако, вирус гепатита мышей вызывает энцефаломиелит, вирус инфекционного перитонита кошек ассоциирован с васкулитом, медиатором которого является иммунный комплекс, а вирус ИБК может поражать почки и репродуктивные органы (52); коронавирус также вызывает миокардит, сиалодакриаденит, и нефрологические, репродуктивные, иммунные расстройства (103).
Как правило, коронавирусы называли по их хозяину и иногда по связанному с ними заболеванию, т. е. вирус инфекционного бронхита кур (IBV, вирус ИБК), вирус гепатита мышей (MHV), вирус сиалодакренита крыс (SDAV), коронавирус крупного рогатого скота (BCV), гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней (HEV), коронавирус синего гребня индеек (TCV), респираторный коронавирус человека (HCV), вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (TGEV), респираторный коронавирус поросят (PRCV), коронавирус лошадей (CCV), вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV), вирус энтерита кошек (FECV), коронавирус кроликов (RbCV).
Коронавирусы в основном поражают одного хозяина, хотя при экспериментальном заражении других видов может происходить ограниченная репликация, как правило, без заболевания.
Вирион имеет сферическую форму, плеоморфен, диаметр оценивается в 90-120 нм, с выростами около 20 нм (52), по другим данным диаметр вириона составляет 80-100 нм (37). Нуклеокапсид окружен билипидным «конвертом» клеточного происхождения, что делает вирион чувствительным к растворителям. В окружающую мембрану вириона встроены два гликозилированных протеина: большой протеин булавовидных выростов S и мембранный белок М. Наружная оболочка окружает гелиоморфный нуклеокапсид, состоящий из рибонуклеиновой кислоты (РНК) и третьего из основных структурных белков - протеина нуклеокапсида (N) (52).
Частица плеоморфная, на фотографиях, полученных при помощи электронного микроскопа, она окружена «короной» булавовидных выростов или шипов длиной 20 нм. Эти шипы (также пепломеры) - один из основных протеиновых элементов вириона. Два остальных основных протеина -мембранный (М), который, как и протеин выростов (S) ассоциирован с оболочкой вириона, и нуклеокапсидный протеин (N), связанный с РНК вириона. Три основных компонента вириона - шипы, мембрана и нуклеокапсид - составляют в молярном соотношении приблизительно как 1:15:6(37).
Исследованиями пепломеров занимались Cavanagh, Davis, Pappin, Darbyshire и другие (1981-1983 гг.). Шипы вируса ИБК сформированы из двух отдельных пептидных компонентов, находящихся в эквимолярной пропорции, обозначенных S1, молекулярным весом 90000 и S2, молекулярным весом 84000 дальтон. В свою очередь эти два полипептида формируются посттрансляционным расщеплением белка-предшественника массой 170000 дальтон приблизительно через 30 мин после синтеза. Оба компонента выростов гликозилированы: удаление олигосахаридов эндогликозидазой Н приводит к появлению полипептидов молекулярной массой 64000 и 61000 дальтон соответственно. Удаление у вириона шипов обработкой неионным детергентом NP40 с последующим соосаждением с каталазой в градиенте сахарозы приводило к появлению пептида 350000, что предполагает наличие в шипах олигомера, состоящего из S1 и S2 по 2 копии каждого. Однако удлиненная форма шипов может потребовать соотношения мономеров иного, чем сферический белок, поэтому нельзя не принимать в расчет, что могут присутствовать 3 копии каждого из гликопротеидов. Высвобождение компонентов вириона мочевиной свидетельствует, что шипы прикрепляются к мембране вириона белком SI, S2 не связан прочно с мембраной. Обработка вириона такими редуцирующими агентами, как дитиотриэтол, влияла на форму выростов, но не высвобождала S1. Это показывает, что присутствуют внутрибелковые бисульфидные мостики, но не межбелковые связи (37).
Системы для выделения вируса ИБК
Основное преимущество трахеальной органной культуры перед КЭ -неадаптированные к КЭ состоит в том, что не требуется длительнная адаптация полевых штаммов вируса ИБК, в связи с чем значительно сокращается процедура по индикации и идентификации выделенного возбудителя, производят быстрый цилиостатический эффект на первом Iі пассаже.
Кроме того, ТОК является несложной в приготовлении и позволяет сократить расходы на исследования за счет уменьшения необходимого количества СПФ-эмбрионов. В отличие от других индикаторных систем (РКЭ, клеточные культуры) вирус ИБК диагностируется в этой системе без аккомодации, так как неадаптированные полевые вирусы ведут в трахеальной культуре к цилиостазу. В РКЭ вирус должен пройти, как правило, 5-7 пассажей, прежде чем начинает вызывать типичные для вируса ИБК изменения эмбриона. При этом антигенные свойства вируса могут значительно измениться. Так, было обнаружено, что между штаммами D207 и D274 после проведения 134-х пассажей в КЭ существует более высокая степень родства, чем между D274 в 136 пассаже и тем же самым штаммом вируса в 56-м пассаже в КЭ (76, 168).
Недостатком этого метода является то, что для приготовления и поддержания ТОК необходимы особые условия и оборудование. Другой потенциальный фактор, ограничивающий применение ТОК - необходимость дифференциации вируса ИБК от других вирусов в полевых образцах. Вирус ИБК вызывает цилиостаз в тонких кольцах ТОК (53). Вирус ИБК и вирус НБ производят цилиостатический эффект в ТОК в течение 3 дней. Аденовирусы
1 птиц реплицируются в ТОК, не вызывая быстрого и полного цилиостаза, поэтому их присутствие может проходить незамеченным (70, 82). Для
1 получения органных культур рекомендовано использовать эмбрионы, т. к. эмбриональные ткани обладают более высокой потенцией роста, в частности, лочки, легкие, кожа, тимус, тестикулы. Указанные органы необходимо брать не позднее 2-3 ч после убоя, измельчать на кусочки 1-4 мм, обрабатывать .ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и др. Затем отдельные клетки суспендируют в питательной среде при температуре 37 С. Для культивирования вирусов используют, только молодые культуры клеток , сроком приготовления не более 3 суток (26).
Castro с соавт. (82) использовали для приготавления ТОК СПФ-цыплят, а также фазанов, индеек и уток 1-5-дневного возраста. Эвтаназию проводили диоксидом углерода, асептически извлекали трахею под ламинарным потоком стерильного воздуха, помещали в стерильные чашки Петри с теплой средой. При помощи стерильных скальпелей (№21) их очищали и нарезали на кольца толщиной 1 мм по секциям. Влажные чистые кольца немедленно помещали в 24-луночные культуральные плашки с питательной средой, содержащей сбалансированный солевой раствор (MEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 4 тМ 1-глутамина, 10 тМ пирувата натрия, 100 ug/см3 гентамицицина и 100 ug/см3 канамицина. Каждая лунка содержала 2 кольца ТОК и 0,5 см среды. Плашки с ТОК помещали в инкубатор, содержащий 5% С02, и инкубировали при температуре 37С. Среду меняли через 48 ч, культуры наблюдали в течение 7-9 дней. Наблюдали изменения, вызываемые вирусами ИБК (13 штаммов), НБ, гриппа птиц, парамиксовирусом 2-го типа, вирусом ИЛТ, аденовирусами птиц 1-го и 2-го серотипов, реовирусом 3-го типа. В ТОК проводили скрининг полевых образцов. Из проб неемедленно готовили 10% гомогенат на MEM с добавлением гентамицина (200 иг/см3), затем его фильтровали через фильтр 0.22 мкм и хранили при температуре минус 70С или при температуре 4С до исследования на в ТОК. При обнаружении цилиостаза в ТОК образцы инокулировали в 9-дневные РКЭ. Поскольку цилиостаз вызывается целым рядом вирусов, для идентификации вируса ИБК использовали реакцию гемагглютинации (РГА), т. к. вирус ИБК вызывает гемагглютинацию куриных эритроцитов только после предварительной обработки трипсином. Также осуществляли серологическую, идентификацию в РН и специфической сывороткой.
Установлено, что цилиостаз в ТОК наступает через 60-108 ч после заражения вирусом ИБК, а вирус НБ вызывает цилиостаз в более ранние сроки, чем вирус ИБК в том же разведении. При исследовании патогенного действия вируса ИБК на ранних стадиях после заражения биение ресничек эпителия замедляется, а затем полностью останавливается. Часть ресничек слипаются, некоторые могут отторгаться. На более поздних стадиях движения ресничек не наблюдается, а четкая цилиарная линия внутри кольца трахеи становится неровной, истонченной и неправильной по форме. Чувствительность ТОК к вирусам НБ и ИБК выше соответственно в 1000 и 125 раз, чем у куриныных эмбрионов (82). На практике наиболее часто используют методики приготовления ТОК по J.K.A. Cook et al. (60): Р. В. Bhattacharjee & R. S Jones. (161); J. Ignjatovic et al. (107).
Материалы для анализа эпизоотической ситуации по ИБК в различных странах мира и Российской Федерации
Подтверждение идентичности выделенного в СПФ-КЭ и в ТОК вируса инфекционного бронхита проводили методом ПНР совместно с лабораторией молекулярной диагностики болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ».
Выделение РНК проводили согласно инструкции по применению тест-системы GenePak для обнаружения РНК возбудителей инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции компании «БИОКОМ».
Полимеразную цепную реакцию проводили в программируемом амплификаторе «Терцик» (Россия), согласно методике Бочкова Ю.А. и соавторов (2003). Программа амплификации состояла из 35 циклов, состоящих из трех этапов - денатурация ДНК - 20 с при 93С; отжига праймеров - 20 с при 50С; элонгации цепи - 40 с при 72С. При постановке «гнездовой» ПЦР проводили 25 циклов при тех же параметрах реакции. Секвенирование. ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе АВІ Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Для амплификации и секвенирования фрагмента гена S1 были использованы праймеры, указанные в таблице 2.
Определенную нуклеотидную последовательность фрагмента гена S1 выделенных штаммов сравнивали с последовательностями штаммов вируса инфекционного бронхита кур, полученными из международной базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Сравнительный анализ последовательностей проводили с помощью Таблица 2 Структура праймеров для амплификации и секвенирования вариабельной области гена S Праймер Последовательность 51-Ъ1 Длина Позицияна геномеИБК Применение
Титр сывороточных антител к вирусу ИБК определяли в непрямом твердофазном варианте ИФА с помощью набора фирмы Synbiotics. Определение оптической плотности и последующие расчеты проводили на совмещенном с компьютером спектрофотометре-ридере «STL», Австрия. За положительную реакцию принимали превышение минимального положительного значения в ИФА в 2 и более раза (1:162).
По 10 неиммунных цыплят в возрасте 10-20 суток заражали культуральной суспензией изолятов «Магнитогорский», «Красносулимский», «Красный колос» и штамма «R» в объеме 0,5 см . Материал содержал 500 CD5o микоплазм. Из общего объема заражающего материала 2 капли вносили на конъюнктиву глаз, 2 капли - интраназально, а оставшуюся часть выпаивали. Клинические наблюдения за зараженной птицей проводили в течение 20 суток. Через 7 и 14 суток по 2 птицы из каждой группы убивали, исследовали внутренние органы, определяли ЦА под световым микроскопом (увеличение хЮО). Для каждой птицы индивидуально и для каждой группы определяли среднюю ЦА трахеи в баллах согласно методике (2). Заболевшими считали цыплят, средняя ЦА трахеи которых составляла менее 2 баллов.
Для проведения общепринятых в биологии статистических расчетов использовали компьютерную программу «Statistical Basic Statistics and Tables» и Microsoft Excel. 2.3. Результаты собственных исследований
Как видно из данных, приведенных в таблицах, заболевание ИБК носит глобальный характер, и наибольшее число исследованных штаммов описано в странах с развитым промышленным птицеводством. При этом существуют и серотипы вируса ИБК, такие (как Массачусетс, Коннектикут, которые распространены практически повсеместно, и специфические для отдельных географических регионов группы штаммов, например, австралийские. Однако с течением времени штаммы, первоначально выделенные в определенном регионе, получают более широкое географическое распространение и регистрируются в местности, где ранее они не были отмечены. Так произошло с рядом родственных в генетическом отношении изолятов, выделенных в Китае, а затем во Франции, Нидерландах, России (6, 27).
Оценка иммунобиологических свойств отечественных изолятов вируса ИБК
Для исследования возможности культивирования в ТОК М. gallisepticum и М. synoviae модифицировали методику поддержания ТОК. Для определения оптимальных условий в работе использовали модифицированную среду Фрея, среду Игла, среду 199 и полусинтетический перевар (ПСП). Отсутствие контаминации исследуемого материала и поддерживающей среды посторонней микрофлорой проверяли посевом на МПА, МПБ, ТСБ и среду Сабуро.
Для исследования использовали референтные штаммы М. gallisepticum: «S6» и «R», а также изоляты, выделенные из патологического материала птицехозяйств РФ - изолят «Магнитогорский» (Челябинская область), изолят «Красный Колос» (Липецкая область) и изолят «Красносулимский» і (Ростовская область).
В работе использовали 19-21-суточные СПФ куриные эмбрионы фирмы "Lohman Tierzucht" (Германия) и неиммунных цыплят в возрасте 1-42 суток. ТОК готовили и поддерживали в жизнеспособном состоянии согласно методики, с некоторыми модификациями. Проводили титрование культур М. gallisepticum и М. synoviae в ТОК, приготовленной из СПФ эмбрионов кур сроком инкубации 21 сут. Титрование образцов проводили с десятикратным шагом. В з свежеприготовленные ТОК с объемом поддерживающей среды 0,9 см вносили по 0,1 см3 суспензии каждого из разведений возбудителя в среде Фрея не менее чем в 4 повторностях. В качестве контроля использовали не менее 5 образцов незараженных ТОК.
В качестве поддерживающей среды использовали среду ПСП без сыворотки. Специфическим действием М. gallisepticum и М. synoviae, по которому учитывали наличие в культуре патогенного микроорганизма, считали полный цилиостаз в кольце трахеи. Цилиостаз в ТОК наступивший ранее 48 часов после заражения считали неспецифическим.
Проведение исследований сопровождалось подбором оптимальных условий проведения опытов по изучению биологических свойств изолятов микоплазм в трахеальных органных культурах. При оценке различных сред для поддержания ТОК лучшая жизнеспособность эпителиальной ткани была отмечена в ПСП и ПСС. При внесении в выбранную среду до 50 % среды Фрея, необходимой для роста микоплазм, снижения цилиарной активности ТОК не наблюдалось. Безвредность ПСП для микоплазм была подтверждена реизолированием возбудителя из ТОК на 6-е сутки после заражения и однократной смены среды.
Для определения влияния возраста птицы на жизнеспособность эпителиальной ткани проводили сравнение образцов, приготовленных из трахей 19-21 суточных СПФ-эмбрионов и из трахей 1-, 14-, 28-суточных цыплят. Полученные результаты показали возможность использования для приготовления ТОК птиц всех вышеперечисленных возрастов. Максимальное время жизнеспособности ТОК без потери цилиарной активности составило 6 суток для всех исследованных образцов, с обязательной сменой среды на третий день в препаратах ТОК, приготовленных из трахей 14-28-суточных птиц.
Для оценки чувствительности ТОК к микоплазмам проводили титрование производственного штамма "S6" М. gallisepticum и производственного штамма М. synoviae в ТОК, приготовленной из СПФ эмбрионов кур сроком инкубации 21 сут. В качестве поддерживающей среды использовали среду ПСП без сыворотки. В данных условиях развитие микоплазм проходило в ассоциации с живыми клетками эксплантатов трахеи, что вызывало поражение цилиарного эпителия и выражалось в потере им цилиарной активности. Действием микоплазм, по которому учитывали наличие в культуре микроорганизма, считали полный цилиостаз в кольце трахеи.
Через 24-48 ч после внесения возбудителей во всех зараженных ТОК отмечали набухание тканей, децилиацию эпителия и его десквамацию. Явления дистрофии и некроза в тканях становились более выраженными, отмечали глубокие поражения подслизистого слоя, наличие большого количества клеточного дебриса. Цилиостаз в зараженных ТОК наступал не ранее 72 ч и гибель зараженных культур наблюдалась в течение 5 суток после инфицирования. В контрольной группе снижения цилиарной активности ТОК не наблюдалось в течение 6 суток (период наблюдения).
