Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Влияние на иммунные реакции различных препаратов, добавляемых к вакцинам 7
1.2. Роль микроэлементов в стимуляции иммунобиологической реактивности организма 14
1.3. Влияние селена на иммунобиологическую реактивность организма 18
2. Собственные исследования
2.1. Материал и методы исследований 24
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Содержание селена в кормах, органах, тканях и крови овец 27
2.2.2. Влияние селена на иммунобиологическую реактивность организма животных
2.2.2.1. Изменение некоторых показателей естественной резистентности организма морских свинок под влиянием селенита натрия 28
2.2.2.2. Влияние селенита натрия на иммунобиологическую реактивность организма овец 38
2.2.3. Реакции в организме животных, вакцинированных с одновременным применением селенита натрия 47
2.2.3.1. Влияние различных доз селенита натрия на иммунобиологическую реактивность организма овец, иммунизированных концентрированной поливалентной ГОА-вакциной 47
2.2.3.2. Влияние различных доз селенита натрия на иммунобиологическую реактивность организма овец, иммунизированных концентрированной поливалентной ГОА-вакциной 67
2.2.4. Зависимость адъювантного действия селена от времени его введения по отношению к антигену 112
2.2.5. Производственное испытание селениїа натрия ъ сочетании с поливалентным анатоксином при вакцинации овец против брадзота и инфекционной энтеротоксемии 120
Обсуждение полученных результатов 134
Выв оды 152
Список литературы 155
Приложение
- Роль микроэлементов в стимуляции иммунобиологической реактивности организма
- Реакции в организме животных, вакцинированных с одновременным применением селенита натрия
- Зависимость адъювантного действия селена от времени его введения по отношению к антигену
Введение к работе
Препятствием, сдерживающим развитие овцеводства, в определенной степени являются инфекционные болезни, которые наносят значи -тельный экономический ущерб и представляют потенциальную опасность, особенно при переводе овцеводства на промышленную основу.
Решение этой задачи предусматривает значительный рост производства продуктов животноводства, увеличение выхода животноводческой продукции, увеличение воспроизводства стада и сохранности поголовья.
Одной из важнейших проблем ветеринарной науки и практики является предупреждение инфекционных болезней овец. Особое место при этом уделяется борьбе с клостридиозами, на долю которых приходится значительный удельный вес в инфекционной патологии овец.
В промышленном животноводстве при интенсивной эксплуатации и высокой концентрации поголовья исключительную актуальность при -обретает сохранение здоровья животных. В связи с этим весьма важной становится и проблема повышения неспецифической (естественной) ус -тойчивости организма, имеющей значение в защите организма от инфекции и в процессе иммунологической перестройки при выработке активного иммунитета.
Формирование.и проявление механизмов естественной резистентности организма происходит под воздействием самых разнообразных факторов внешней среды, с которыми животные находятся в постоянном контакте. Однако наряду с подъёмом общей резистентности организма животных существует необходимость дальнейшего совершенствования специфической профилактики. В этом аспекте наряду с совершенствованием вакцин в последнее время много внимания уделяется применению различных препаратов, действующих как адъюванты.
АдъюЕантное действие некоторых веществ органической и неорганической природы было отмечено более 50 лет назад Г.Рамоном и его
учениками. С тех пор, как у нас в стране, так и за рубежом, изучению подвергнуто большое число адъювантов, относящихся к различным группам химических и биологических веществ,
В последние годы установлено, что неспецифическими стимуляторами иммунитета являются многие микроэлементы. Из них важную роль в формировании иммунитета играет селен.
В почвах и растениях Азербайджанской СОР установлено отсутствие или очень низкое содержание селена.
Учитывая то, что этот микроэлемент играет важную роль в биосинтезе белка и белковом обмене, мы решили изучить влияние его на реактивность организма овец и формирование иммунитета. Это послужило основанием для предпринятого исследования.
Цель работы - изучить влияние селена на иммунобиологическую реактивность организма овец, а также на формирование иммунитета при вакцинации их против клостридиозов.
Задачи исследования. I. Изучить влияние различных доз селена на иммунобиологические реакции.
Определить, как влияют различные дозы селена на формирование иммунитета против клостридиозов при вакцинации применяемыми в практике вакцинами против брадзота и анаэробной энтеротоксемии.
Разработать рациональную систему Еакцинации овец против клостри-диозое с применением препаратов селена.
Отработать рекомендации по применению препаратов селена при проведении вакцинации против клостридиозов и испытать их в производственных- ус л овита.
Научная новизна. При проведении вакцинации овец против клостридиозов, на фоне недостаточности селена в рационе, одновременно с вакцинацией, введение селенита натрия в дозе О,?, мг на кг массы животного способствует выработке более напряжённого иммунитета.
Практическая ценность и апробация работы. Отработана методика вакцинации овец против клостридиозов с одновременным введением
- 6 ~
селенита натрия.
Разработанный метод апробирован на 60 тыс.голов овец в производственных условиях. Предложение внедрено в производство Е Азерб.ССР решением НТС МСХ Азерб.ССР (протокол № з от 21 июня 1984 г.).
Содержание работы опубликовано в 5 статьях и доложено на 4 научных конференциях.
- 7 ~
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль микроэлементов в стимуляции иммунобиологической реактивности организма
Изыскание средств неспецифической стимуляции иммунитета имеет большое теоретическое и практическое значение.
Проблема изучения неспецифической иммунобиологической ре/ активности имеет важное значение в связи с тем, что в окружающей среде широко представлены факторы, которые оказывают как положительное, так и отрицательное влияние на иммунобиологическую реак тивность.
В настоящее время установлено, что биологически активные вещества - витамины, гормоны, микроэлементы оказывает активное воздействие на иммуногенез. Последнее, по-Еидимому, объясняется тем, что данные вещества являются естественными продуктами метаболизма и поэтому играют важную роль в белковом обмене, в том числе и в выработке антител.
Представляет теоретический и практический интерес выяснение возможности некоторых микроэлементов, применяемых по бЙтическому принципу, оказывать влияние на изменение некоторых иммунореактив-ных свойств организма.
Микроэлементы, как неспецифические стимуляторы иммунитета, применялись многими исследователями. Ряд работ посвящен изучению влияния таких микроэлементов, как медь, цинк, йод, кобальт, ртуть, на фагоцитарную активность лейкоцитов (Н.Г.Гончарова,1950; А.А.Не-песов,1955; Е.В.Черкасова, 1955; А.Г.Какурина,І9бІД9б4; Х.Ш.Каза ков и Н.З.Хазипов,1963; Ж.М.Сак,1965; Н.А.Макарова,1965; Л.Я.Фи-щенко,1969; и др.).
Усиление фагоцитарной активности лейкоцитов наблюдалось при добавлении к крови лягушки водного раствора двухлористой ртути в концентрациях 0,125 и 0,003 иг% (А.А.Непесов,1955) и при добавлении раствора молибдата натрия в этих же концентрациях к крови человека (Г.М.Каприелов,1957). Подобные данные получены Н.Ф.Герасимовой (I960) в отношении йодистого калия. Применение же больших концентраций этих солей (50-200 мг$) угнетало фагоцитоз.
Х.Ш.Казаков и Д.Н.Левшин (1963), изучая роль ионов металлов в развитии иммунологических СВОЙСТВ животного организма, установили, что введение кроликам per os хлористого кобальта и йодистого калия повышает количество гамма-глобулинов С з 12,9$ до 15,2$) и вызывает понижение бета-глобулинов (с 14,4$ до 9,5%),
Исследованиями многих учёных установлено, что применение малых количеств микроэлементов в сочетании с анатоксинами способствует усилению напряжённости иммунитета и повышает сопротивляемость организма к инфекциям.
В опытах А.Е.Непесова (1959) подкожное введение двухлористой ртути в количестве I мкг через каждые 2-3 часа (всего использовали 61 мкг соли) предохраняло от гибели морских свинок, заражённых дифтерийным токсином.
При изучении влияния солей меди, железа, кобальта и йодистого калия на продолжительность жизни морских свинок, получавших смертельную дозу дифтерийного токсина, оказалось, что йодистый ка-калий в дозах 0,0008; 0,032; 0,32 мг/кг в сутки вызывает уменьшение продолжительности жизни на I сутки. Соли остальных микроэлементов при дачерег os Удлиняли срок выживаемости по сравнению с контролем (Л.М.Алхутова,1963).
R.Katitch, B.Dimtch (1964) указывают, что при одновременном введении в организм овец столбнячного токсина и хлористого ко 16 бальта увеличивается концентрация антител в сыворотке крови.
R.Kafcitch, A.Batty (1965), изучая влияние кобальта на иммунитет у овец, привитых против энтеротоксемии, установили, что этот микроэлемент благоприятно действует на образование антитоксинов у привитых овец.
С.М.Прегер с соавт. (1966), изучая действие сернокислой меди на образование антитоксина при иммунизации животных дифтерийным анатоксином, наблюдали стимулирующее действие меди как в сочетании с антигеном, так и при раздельном их введении.
В защитных реакциях организма антитела играют основную роль, и повышение их концентрации является важным вопросом. Необходимо увеличение выработки антител во.зможно введение несрецифических раздражителей, применяя их до вакцинации, одновременно и после неё.
Повышение титра антител у кроликов при иммунизации их эри -троцитами барана наблюдали при введении хлористых солей марганца, кобальта, меди, железа, свинца, ртути и др. ( L.Waibum, S.Smidt , 1925).
С.П.Григорович, А.В.Натидзе (1927) установили, что марганец способствует выработке антитоксинов в период первичной иммунизации.
А.В.Игнатович, Н.Е.Короткова (I95G) ука&иназт на повышение образования антител под влиянием солей железа, магния, кобальта у иммунизированных кроликов. При внутривенном введении сульфата магния титр антител увеличивался почти в 10 раз, по сравнению с контролем.
Так, А.Н.Гордиенко (1958), c.Tokada и соавт.(1958), Г.А.Ба-бенко (1965) отмечают, что соли кобальта, марганца, цинка, кадмия, стронция и бария, меди, железа в микродозах стимулируют выработку агглютининов у кроликов при иммунизации их брюшнотифозными бактериями.
Интенсивное образование агглютининов и длительное сохранение их после прививки против паратифа получено при подкормке телят кобальтом и медью (В.ДребиЦ;кас,І962; А.А.Аскеров,Т.А.Мамедов, 1975).
В опытах 0.П.Кушнарев ой (1962) отмечено,что иммунизация кроликов тетравакциной с одновременным внутримышечным введением 1 -но-го раствора йодистого калия вызывает усиление образования агглютининов на введение всех антигенов: тифозного, паратифозного В, дизентерийного Флекснера и Зонне.
В.Дребицкас,М.Мишкиняне (1981), исследуя иммунобиологические реакции у кроликов и крыс в отношении Staph.aureus (шт.209), подкармливали в течение 3-4 месяцев солями йода и никеля после чего животных вакцинировали. Подкормка микроэлементами способствовала увеличению образования антител и усилению фагоцитарной активности в поствакцинальном периоде.
А.Т.Тер-Аветисян, А.А.Петросян (1981) показано влияние молибдена на некоторые звенья иммуногенеза у. различных животных.
Ф.хМ.Имбатуллина (1981), В.А.СерикоЕа (1981) констатируют, что при включений в рацион телок различных доз молибдена и марганца изменяется естественная резистентность организма животных.
В последнее время микроэлементы рассматривают не только как стимуляторы уровня т--:.— антител, но и как стимуляторы других факторов иммунитета. К числу важных, но мало изученных вопросов относится влияние биотических элементов на титр комплемента, про-пердина.
О значительном увеличении содержания пропердина в сыворотке крови мышей под влиянием кобальта и меди сообщают Х.Ф.Басс-Шадхан и соавт. (1966).
Л.М.Алхутова (1967) установила, что при введении морским свинкам компяекса таких солей микроэлементов, как сернокислая медь, хлорное железо, хлористый кобальт и йодистый калий, повышается титр комплемента. Согласно литературным данным (А.И.Венчиков,1962,1972), действие микроэлементов как биотических факторов проявляется при применении их в таких концентрациях, в которых они содержатся в организме в естественных условиях или близких к ним.
Реакции в организме животных, вакцинированных с одновременным применением селенита натрия
Во второй серии ОПЫТОЕ нами изучено влияние различных доз селенита натрия, применяемого в сочетании с концентрированной поливалентной ГОА-вакцкнои протиЕ брадзота, инфекционной энтеротоксе-мии, злокачественного отёка овец и дизентерии ягнят.
Опыты проводились на морских СЕИНКЭХ массой 300-350 г. Животные были разделены на группы и вакцинированы по следующей схеме: первой группе животных (20 гол.) селенит натрия применяли в Ї. дозе 0,05 мг на голову одновременно с первой дозой вакцины, второй группе (20 гол.) - в дозе 0,1 мг, третьей группе (20 гол.) - 0,2 мг, четвёртую группу животных вакцинировали без селенита натрия, пятая группа служила контролем.
О целью изучения иммунобиологической реактивности организма нами проведены исследования белка,и белковых фракций сыворотки крови, фагоцитарной активности лейкоцитов, превентивных свойств сыворотки крови. Через ДЕЗ месяца после исследования была проверена напряжённость иммунитета.
Общий белок и белковые фракции сыворотки крови
Изменение белкового зеркала сыворотки крови, и особенно белковых фракций, отражает Е сочетании с другими показателями изменение иммунобиологической реактивности организма. В частности, основная масса как нормальных, так и иммунных антител входит в состав гамма-глобулинов. Вакцинация, как известно, Е ТОЙ ИЛИ иной степени приводит к изменениям в протеинограмме сьшороточногоб белка.
В связи с этим мніпоставили перед собой задачу - изучить содержание общего белка и белковых фракций сыворотки крови морских свинок, иммунизированных концентрированной поливалентной ГОА-вакци-ной в сочетании с различными дозами селенита натрия , учитывая способность этого микроэлемента в небольших концентрациях активизировать процессы синтеза белка.
Результаты исследований по определению общего белка и фракционного состава протеинов сьгеоротки кроЕи представлены в табл.9, данные которой свидетельствуют о том, что у подопытных морских свинок при применении селенита натрия в дозе 0,05 мг уровень общего белка несколько повышается после первой вакцинации - 5,59+0,11 т% против 5,44+0,01 т% и достигает максимального значения на 20-й день после второй вакцинации - 6,64+0,07 г%. Во второй половине опытного периода содержание общего белка сыворотки кроЕи уменьшилось, но оставалось Еыше исходного - 6,25+0,08 т% (? .0,001) - на 60-й день.
Введение НИЕОТНЫМ селенита натрия в дозе 0,1 мг способствовало значительному увеличению количества общего белка сыворотки крови в первые дни после иммунизации (с 5,44+0,01 до 6,33+0,87 т%, Р С 0,001). Увеличение этого показателя продолжалось до 20-го дня, в это время его Ееличина превышала исходную и составляла 6,94+0,09г% (Р .0,001). К концу опыта содержание общего белка стало уменьшаться, оставаясь при этом выше исходного уровня (5,54+0,08 г#).
При введении селенита натрия в дозе 0,2 мг наблюдали уменьше ниє содержания общего белка сыворотки крови после первой Еакцина-пии с 5,51+0,23 до 5,4++0,01 т% и незначительное повышение на 5-й день после второй вакцинации - 5,59+0,13 т%. На 10-и день этот показатель уменьшился до Ф,98+0,4и г#. На втором месяце ис-ледования была устанэвлена тенденция к его увеличению - 6,26+0,12г$ В конце опыта содержание-общего белка снизилось до 6,12+0,12 т%. а группе животных, иммунизированных без селенита натрия, также оыла отмечена тенденция к увеличению содержания общего белка в сыворотке крови (см.табл.9).
Под влиянием селенита натрия, применяемого в дозе 0,05 мг, сдвиги в белковой формуле сыворотки кроЕИ животных после первой вакцинации происходили за счёт некоторого увеличения бета+гамма-глобулиноЕ - с 40,0+0,52 до-51,0+0,58 (Р 0,001) и снижения альбуминов - с 50,8+0,80 до 36,9+0,10. На 10-20-й день после второй вакцинации содержание альбуминов снизилось - до 28,7+0,21 и 24,9+ +0,25 за с чёт значительного увеличения бета+гамма-глобулинов. На 30-й день после Еторой вакцинации отмечено повышение альбуминов, но, несмотря на это, количество их к концу опыта находилось на уровне, ниже исходного.
.У морских свинок при введении селенита натрия в дозе 0,1 мг изменения в белковом спектре характеризовались снижением количества альбуминов с 50,8+0,80 до 18,9+0,10 на 5-й день после гторой вакцинации и увеличением глобулиновых фракций за счёт альфа-глобулинов (с П,0+р,44 до 15,1+0,09 , Р 0,001). Уровень бета+гамма-глобулинов увеличился до 66,2+0,21 (Р с 0,001).
Дальнейшие наблюдения показали, что на 10-її день ьлкцикации у животных отмечалась значительная гипоальбуминения, количество глобулинов оставалось на прежнем уровне (15,2+0,27). Увеличение бета+гамма-глобулиновых фракций в этот период происходило за счёт снижения альбуминов. Их содержание в крови подопытных животных возросло до 68,8+0,95 (Р 0,01).
Через 20 днеч после вакцина чий у животных этой группы количество альбуминов увеличилось до 18,7+0,15% за счёт некоторого снижения бета+гамма-глобулинов, содержание которых в зто время составляя обб,2+0,21% (Р 0,01). На 30-й день после вакцинации количество альбуминов продолжало увеличиваться (до 19,0+0,15%). Соответственно увеличилось содержание альфа-глобулинов, которое составляло 15,9+0,15%. Содержание бета+гамма-глобулинов вновь увеличилось и составляло 66,8+0,51%. К концу исследований, на 60-й день, количество альбуминов увеличилось до 20,0+0,34%, альфа-глобулинов - до 19,0+0,]М, а бета+гамма-глобулинов - до 61,0+0,13%.
При применении селенита натрия в доье 0,2 і,іг посла первой вакцинации регистрировали гипоаньбуминемию на фоне увеличения альфа глобулиноЕОй фракции. Сравнивая содержание альфа-глобулинов в сыворотке крови животных до опыта и после первой Еакцинации, можно отметить, что в группе животных выработка альфа-глобулинов происходила активнее, т.е. составляла 31,4+0,54% против 11,0+0,44. Количество бета+гамма-глобулинов уменьшилось до 36,4+0,10 против 49,0+0,52%, а на 10-й день вакцинального процесса снизилось до 32,6+0,40%.
В период с 30-го по 60-й день иммунизации содержание альфа-глобулинов в сыворотке крови экспериментальных животных было максимальным (36,0+0,26% , Рс0,001). Содержание бета+гамма-глобулинов снизилось до 30-;-0+0,70%.
Зависимость адъювантного действия селена от времени его введения по отношению к антигену
Приведённые выше результаты являются экспериментальным доказательством высокого стимулирующего действия исследуемого микроэлемента при иммунизации животных концентрированной поливалент -ной ГОА вакциной. Но стимулирующий эффект селена зависит от целого ряда факторов, в том числе и от времени его введения по от - из ношению к антигену.
Учитывая результаты проведённых исследований по изучению влияния различных доз селенита натрия в сочетании с концентрированной поливалентной ГОА-вакциной, представляло интерес выяснение , роли селена при введении его в организм в различные сроки вакцинации. С целью выяснения этой зависимости для исследуемого препарата опыты проводились на морских свинках, иммунизированных по следующей схеме: первой группе животных (20 гол.) селенит натрия вводили однократно в дозе 0,1 мг на голову за 48 часов до вакцинации; второй группе животных (20 гол.) - в этой ке дозе, но одновременно с вакциной; третья группа морских свинок (20 гол.) была контрольной - применяли только вакцину.
В этой серии опытов оценку состояния иммунитета проводили по содержанию общего белка и белковых фракций сыворотки крови, по фагоцитарной активности лейкоцитов, титру АЕ, была проверена напряжённость иммунитета.
Кровь исследовали перед вакцинацией, после первой вакцинации, через 20,30 и 60 дней после второй вакцинации.
Изменение общего белка и отдельных фракций его у иммунизированных морских свинок при введении селена в разные сроки вакцинации приведены в табл. 22.
Как видно из результатов, представленных в таблице, селенит натрия, введённый до вакцинации, вызвал незначительное увеличение содержания общего белка сиворотки крови подопытных животных (с 5,14+0,26 до 5,25+0,15 г# . на 2,1$, Р 0,5). После второй вакцинации на 10-й день процент общего белка увеличился на 8,8, по сравнению с исходным его числом. Через месяц после иммунизации со« держание общего белка сыворотки крови достигло своего максимума и превышало исходное на 14,8$ (5,90+0,07 против 5,І4чО,26 i#, Р -0,05). А через два месяца оно мало отличалось от первоначальной
величины» но всё же превосходил её.
Статистически достоверное увеличение процента общего белка произошло в группе животных, где селенит натрия применяли одновременно с вакциной, что более отчётливо проявлялось после второй вакцинации животных. Так, на 10-й день после неё процент общего белка составлял 6,12+0,13 против 5,44+0,08 г$ - увеличился на 12,5 (Р10,01). Максимального значения этот показатель достигает через месяц после иммунизации (6,94+0,18 против 5,44+0,08 г$ - увеличился на 27,6$, Р 0,001). Обращает на себя внимание и тот факт, что через два месяца процент общего белка сыворотки крови в 1,2 раза превышал первоначальный.
При введении селенита натрия до вакцинации, а также одновременно с ней, в обеих группах животных отмечалось понижение альбуминовой фракции и повышение глобулиновых, но изменения эти были выражены не в одинаковой степени. Селенит натрия, введённый одновременно с вакциной, оказал более выраженный стимулирующий эффект на продуцирование бета- и гамма-глобулинов, чем селенит натрия, введённый в довакцинальном периоде.
Анализ полученных результатов показал некоторые особенности в действии селена на фагоцитарную активность лейкоцитов в этой серии опытов. Так, обработка подопытных животных селенитом натрия до вакцинации привела к краткрвремеиному повышению поглотительной способности лейкоцитов. Процент фагоцитоза наросталдо 5-го дня со времени второй вакцинации (37,0+1,81 против 29,0+1,86$, P U,02 , на 27,6$). На 10«-й день отмечалась тенденция к его снижению, тем не менее процент фагоцитоза в этот период исследования превышал исходный в .1,24 раза (Р 0,01),В дальнейшем активность фагоцитоза вновь снизилась до 34,0+1,84$ и удерживалась на эхои урсвне на протяжении 20 дней. К концу исследования показатель этот колебался в пределах первоначального своего уровня, составляя 31,0+1,58 против
Стимулирующее и более длительное действие оказал селенит натрия, введённый до вакцинации, на показатель фагоцитоза. Так, после первой вакцинации он составлял 0,70+0,02 против 0,57+0,03 , т.е. в 1,2 раза (PZ.0,001) превышал исходный его уровень. Увеличение этого показателя наблюдалось на протяжении 20 дней после вторичного антигенного стимула. Так, в этот период исследования он превышал первоначальный уровень в 1,3 раза (0,76+0,04 против 0,57+0,03 , Р 0,01), а ещё через десять дней, т.е. на 30-й день, он несколько снизился, находясь на уровне, превышающем первоначальный, что наблюдалось до конца эксперимента. Следовательно, стиму лирующее влияния на фагоцитоз при раздельном введении микроэлемента и вакцины проявляется более в отношении показателя фагоцитоза, тогда как высокий уровень процента его сохраняется менее длительное время.
Как видно из данных табл.23, одновременное применение селенита натрия с вакциной оказалось более аффективным как в отношении процента фагоцитоза, так и его показателя.
Оценку эффективности влияния селенита натрия как до вакцинации, ттак и на её фоне проводили путём определения титров антитоксина в реакции нейтрализации.
