Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
1.ВВЕДЕНИЕ 8
1.1 АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ 8
1.2 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ 10
1.3 НАУЧНАЯ НОВИЗНА 11
1.4 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ 12
1.5 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ, ВЬШОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 12
1.6 АПРОБАЦИЯ и ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 13
1.7 Личный ВКЛАД 13
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ 14
2.1 БЛЮТАНГ: ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЕЗНИ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОНОМИЧЕСКИЙ УЩЕРБ 14
2.2 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА БЛЮТАНГА 18
2.3 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ В ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК 20
2.4 ИНАКТИВАНТЫ И АДЪЮВАНТЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ
ВАКЦИН 24
2.4.1 Инактиванты 24
2.4.2 Адъюванты 28
2.5 СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ БЛЮТАНГА 33
2.5.1 Живые вакцины 33
2.5.2 Инактивированные вакцины 35
2.5.3 Вакцины нового поколения 36
2.6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ по ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 39
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Оглавление З
3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
3.1.1 Вирус 41
3.1.2 Культуры клеток 42
3.1.3 Питательные среды, растворы и сыворотки 42
3.1.4 Реактивы 42
3.1.5 Оборудование 43
3.1.6 Животные 43
3.1.7 Выращивание перевиваемых линий клеток 43
3.1.8 Культивирование вируса блютанга в перевиваемых культурах клеток 44
3.1.9 Определение инфекционной активности вируса
3.1.10 Инактивация вируса блютанга 45
3.1.11 Определение полноты инактивации вируса 45
3.1.12 Приготовление масляного адъюванта 46
3.1.13 Приготовление образцов инактивированной вакцины 46
3.1.14 Постановка сэндвич метода ТФ ИФА на основе МА для обнаружения антигена 47
3.1.15 Оценка иммуногенности образцов вакцины 48
3.1.15.1 Постановка варианта двухфазного ингибирования ТФ ИФА на основе МА для обнаружения специфических антител 48
3.1.16 Выделение РНК и синтез кДНК 49
3.1.17 Постановка ПЦР 50
3.1.18 Статистическая обработка результатов исследований 50
3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 51
3.2.1 Обоснование выбора серотипов вируса блютанга при разработке средств специфической иммунопрофилактики этой болезни 51
3.2.2 Выбор технологически перспективной клеточной культуры для выращивания вируса блютанга 51
3.2.3 Разработка производственной технологии культивирования вируса Оглавление
3.23 Л Определение оптимальной множественности заражения 53
3.2.3.2 Влияние концентрации сыворотки крови КРС в поддерживающей среде на накопление вируса блютанга 55
3.2.3.3 Определение оптимального способа заражения культуры клеток 56
3.2.3.4 Накопление вируса в зависимости от величины концентрации водородных ионов (рН) 57
3.2.3.5 Сравнение эффективности питательных сред Игла (MEM) разных фирм-производителей по их влиянию на накопление вируса блютанга в культуре клеток 58
3.2.4 Методы культивирования вируса 59
3.2.5 Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины 67
3.2.5.1 Выбор инактиванта 67
3.2.5.2 Использование ПЦР для оценки полноты инактивации вируса блютанга 73
3.2.5.3 Выбор формы вакцинного препарата и изучение иммуногенности экспериментальных серий инактивированных вакцин 77
3.2.5.4 Оценка антигеной активности вирусного сырья и образцов инактивированных вакцин сэндвич методом ТФ ИФА 83
3.2.6 Динамика образования вируснейтрализующих антител и длительность иммунитета при иммунизации овец инактивированной вакциной 86
3.2.7 Определение иммуногенности образцов вакцины в процессе хранения88
3.2.8 Методы контроля антигенной активности вирусного сырья и инактивированных препаратов 90
3.2.9 Депонирование вируса блютанга 91
3.2.10 Испытания инактивированной вакцины против блютанга 92
3.2.11 Приготовление опытно-промышленной серии инактивированной вакцины против блютанга культуральной эмульгированной и ее испытания99
Оглавление
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 101
5. ВЫВОДЫ ПО
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 112
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 113
8. ПРИЛОЖЕНИЯ ОШИБКА! ЗАКЛАДКА НЕ ОПРЕДЕЛЕНА.
Введение к работе
Блютанг ("синий язык", катаральная лихорадка овец) - вирусная трансмиссивная болезнь парнокопытных, характеризующаяся лихорадкой, воспалительно-некротическими поражениями пищеварительного тракта, особенно языка, эпителия венчика и основы кожи копыт, а также изменениями в скелетных мышцах. Спектр восприимчивых животных - овцы, крупный рогатый скот, олени, ламы, горные газели, болыперогие бараны, белохвостые олени и некоторые другие виды жвачных.
В настоящее время известны 24 серотипа возбудителя блютанга, которые вызывают сходную клиническую картину у зараженных восприимчивых животных. Вирус блютанга входит в состав рода Orbivirus семейства Reoviridae, по определению МЭБ, отнесен к особо опасным болезням животных списка А. Согласно классификации Государственного Комитета по эпидемиологическому надзору, возбудитель блютанга относится ко 2-ой группе патогенности для человека [77].
В XX столетии блютанг нанес овцеводству многих стран мира огромный экономический ущерб, больше чем все другие инфекционные заболевания овец, вместе взятые. Так, в США ежегодные потери из-за ограничений на поставки домашнего скота в страны, свободные от блютанга, составляют 125 миллионов долларов [162]. Впервые блютанг был зарегистрирован в Южной Африке в 1876 г. и в начале века эту проблему считали актуальной только для стран Африканского континента. Однако в настоящее время болезнь зарегистрирована на всех континентах, где развито овцеводство [4].
По данным МЭБ в последние годы неблагополучными по этому заболеванию в Европе были Греция (1998, 2001 гг.), Франция (2000 и 2001 гг.), Болгария (1999 г.), Италия и Испания (2000 г.), Югославия (2001 г.) [84].
Пирбрайтская арбовирусная лаборатория (Англия) провела типирова-ние вируса блютанга, выделенного в Греции и Болгарии в 1998-99 гг. и
Введение отнесла его к 4-му и 9-му серотипам. Подозревают, что вирус мог быть вакцинным [4].
В 1970 г. специалистами ВНИИВВиМ И.А. Бакуловым, А.П. Песковац-ковым был сделан прогноз о возможности возникновения блютанга в Кавказском регионе СССР, что затем было подтверждено обнаружением этой болезни в Нахичевани (Азербайджан). В последующие годы в Молдавии, Украине, Средней Азии, Бурятской и Читинской областях в сыворотках крови овец было выявлено наличие антител к этому возбудителю [2].
Особенно проблема блютанга стала актуальной для России после эпизоотии болезни в Республике Бурятия в 1993 году. Заболевание было диагностировано специалистами ВНИИВВиМ и ликвидировано путем уничтожения всех заболевших овец с последующей вакцинацией оставшегося поголовья [25]. Выделенный от больных животных вирус был отнесен к 16 серотипу.
Тесные экономические и культурные связи России со странами, неблагополучными по блютангу, указывают на возможность заноса этого заболевания в нашу страну.
Отмечены случаи переноса инфицированных насекомых на большие расстояния с потоком воздуха и различными видами транспорта, в том числе и воздушным (самолетами) [4].
Для иммунизации овец против блютанга в Европе применяют живую поливакцину Александера состоящую из 4-х штаммов вируса, аттенуированных путем серийных пассажей в КЭ и при пониженной температуре. В последние годы в ЮАР изготовлена вакцина из 15-ти различных серотипов вируса, выращенных в культуре клеток почки ягнят и эмбрионов КРС [8].
Во ВНИИВВиМ В.А. Сергеевым, Н.З. Василенко и др. также проводились исследования по созданию средств специфической профилактики против этого заболевания. Были разработаны и испытаны моно- и поливалентные вакцины, полученные на основе живых аттенуированных штаммов этого возбудителя [78]. Однако в связи с высокой реактогенностью живых вакцин, возможной реверсией аттенуированных штаммов в организме пере Введение носчиков конструирование вирусвакцин было ограниченным. Поэтому основные исследования были направлены на разработку эффективных моно-и поливалентных инактивированных культуральных вакцин. Инактивиро-ванная ДЭИ сорбированная вакцина против блютанга овец была разработана в бывшем СССР во ВНИИВВиМ В.А. Сергеевым, Н.П. Ананьевой-Рященко, и Р.В. Кошелевой в 1980 г. [29, 33].
В 1996 г. в институте И.Ф.Вишняковым, В.И. Жестеревым, М.Б. Новиковой и др. была разработана инактивированная сорбированная вакцина, где в качестве инактиванта вируса блютанга использовали 0,1% раствор А-24 (ТУ № 9384-002-00008064-96). Однако, антигенная активность вирусного сырья, изготовленного из некоторых серотипов вируса блютанга, после инактивации значительно снижалась а вакцины, полученные на его основе, имели низкую иммуногенность. Это указывает на необходимость совершенствования технологии изготовления инактивированной вакцины против этой болезни.
Учитывая, что в последние годы в странах, имеющих тесные экономические контакты с Россией (Турция, Болгария, Югославия и др.) отмечали обширные эпизоотии, вызванные вирусом блютанга 4-го, 9-го и 16-го серотипов, является актуальной разработка моно- и бивалентной вакцин против блютанга на основании указанных серотипов вируса и совершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины с учетом новых достижений в области биотехнологии.
1.2 Цель и задачи исследований
Целью данной работы являлось усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Оценить существующие клеточные субстраты для культивирования вируса блютанга различных серотипов и выбрать технологически перепек Введение тивную перевиваемую культуру клеток, обеспечивающую максимальный уровень репродукции вируса.
2. Разработать технологию получения вирусного сырья с использованием перевиваемых клеточных систем и технических приемов выращивания вируса блютанга различных серотипов (стационарный, роллерный, на микроносителях, в суспензии).
3. Провести сравнительную оценку эффективности инактивантов (А-24, ДЭИ, C11SO4) и адъювантов (масляный и ГОА) по иммуногенности готовых вакцинных препаратов.
4. Изучить биологические свойства производственных штаммов вируса блютанга 4, 9 и 16 серотипов, используемых при изготовлении инактиви-рованной вакцины, с целью их депонирования в коллекции микроорганизмов ВГНКИ.
5. Разработать технологию изготовления бивалентной инактивирован-ной вакцины против блютанга 4 и 9 серотипов.
6. Изготовить и испытать на животных экспериментальные серии
инактивированной моно- и бивалентной вакцины против блютанга 4, 9, 16
серотипов.
1.3 Научная новизна
1. Экспериментально оценены культуральные, вирусрепродуци-рующие и технологические характеристики перевиваемых клеточных культур ПСГК-60, ПСГК-60С и ВНК-21 и научно обоснованы перспективы их использования для получения вируса блютанга с целью изготовления инактивированной вакцины.
2. Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против блютанга с использованием высокопродуктивных и эконо-мически перспективных методов выращивания вируса (6,5-7,5 lg ТЦД50/СМ ): в суспензии, на микроносителях и роллерного культивирования в клетках ПСГК-60, ПСГК-60С и ВНК-21.
Введение 3. Предложены новые технологичные режимы инактивации вируса и принципы конструирования инактивированных вакцин с масляным адъюван-том против блютанга в моно- и бивалентных вариантах (16, 4 и 9 серотипы соответственно).
4. Предложен метод иммунобиологической оценки инактивированной вакцины против блютанга по антигенной и иммуногенной активности в ТФ ИФА, РН и на морских свинках.
1.4 Практическая значимость работы
Усовершенствована технология изготовления инактивированной вакцины против блютанга, заключающаяся в выборе универсальных взаимозаменяемых перевиваемых культур клеток для выращивания вируса различных серотипов (ВНК-21, ПСГК-60, ПСГК-60С), использовании инактиванта А-24 в концентрации (0,05%) и применении нового масляного адъюванта.
Разработана безвредная и иммуногенная бивалентная инактивирован-ная вакцина против блютанга 4-го и 9-го серотипов, которая рекомендована для профилактики этой болезни у животных.
Депонированы в коллекции микроорганизмов ВГНКИ производственные штаммы вируса блютанга 4, 9 и 16 серотипов, используемые при производстве инактивированной вакцины.
Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против блютанга поливалентной инактивированной», которая одобрена ученым советом, утверждена директором ВНИИВВиМ.
1.5 Основные положения диссертационной работы, выносимые
на защиту
1. Высокоэффективная технология получения культурального вируса блютанга различных серотипов с использованием универсальных взаимозаменяемых перевиваемых клеточных культур и современных технических приемов культивирования (суспензионный, роллерный, на микроносителях).
Введение 2. Сравнительная оценка эффективности инактивантов (А-24, ДЭИ, CHS04) и адъювантов (масляный и ГОА) по иммуногенности готовых вакцинных препаратов.
3. Технология изготовления и методы контроля моно- и бивалентной инактивированной вакцины против блютанга 4 и 9 серотипов.
4. Результаты испытаний инактивированных моно- и бивалентных вакцин против блютанга.
1.6 Апробация и публикация результатов исследований
Основные материалы по теме диссертации доложены на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (2000, 2001, 2002 гг.), международной научно-практической конференции ВНИИВВиМ (г. Покров, 2002).
Результаты исследований в период с 2000 по 2002 гг. опубликованы в 9 научных статьях, в том числе одна - в журнале «Доклады РАСХН» и восемь -в материалах научно-практических конференций. Материалы работы включены в отчеты о НИР ВНИИВВиМ и в нормативно-технических документы.
1.7 Личный вклад
Работа выполнена в лаборатории «Биология и культивирование вирусов» ВНИИВВиМ. Раздел исследований «Использование ПЦР для оценки полноты инактивации вируса блютанга» выполнен совместно с д.б.н. Цыба-новым С.Ж. Постановку сэндвич метода ТФ ИФА на основе МА для обнаружения антигена вируса блютанга выполняли совместно с д.б.н. Стрижаковым А.А. и к.б.н. Новиковой М.Б. Остальные разделы работы были выполнены лично автором.
