Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Краткая характеристика возбудителя болезни Ауески 10
Биология вируса. Новые данные об антигенной структуре, полипептидном составе 13
Средства профилактики болезни Ауески 16
Методы изготовления инактивированных вакцин против болезни Ауески 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Материалы 40
Методы исследования... 43
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 47
Разработка технологии изготовления инактивированной вакцины против болезни Ауески 47
Выбор клеточной системы и штамма вируса болезни Ауески...
Изучение влияния ионизирующего излучения на антигенные и иммуногенные свойства вакцинного и вирулентного штаммов вируса болезни Ауески, 49
1. Определение порога радиочувствительности различных культур клеток, инфицированных вирусом болезни Ауески 49
2. Определение полноты инактивации радиооблученного вируса болезни Ауески 51
3. Определение серологической (антигенной) активности радиоинактивированного вируса 53
4. Определение безвредности радиоинактивированного вируса. .. 55
Изучение иммуногеннои активности вакцинного препарата в экспериментальных условиях 56
1. Отбор штаммов вируса болезни Ауески для конструирования инактивированной вакцины для поросят 56
1.1. Подбор качественного иммуностимулятора для повышения иммуногенности радиоинактивированной вакцины против болезни Ауески 58
2. Определение сроков наступления иммунитета после одно- и двукратной вакцинации. Контроль напряженности иммунитета в различные сроки после прививки 63
3. Оценка иммуногенности радиоинактивированной вакцины на овцах 69
Испытание иммуногеннои активности радиоинактивированной вакцины Таммавак - ВНИВИ"
против болезни Ауески в производственных условиях 74
1. Определение сроков наступления иммунитета после двукратной вакцинации свиней 74
Определение эффективности инактивированной вакцины 'Таммавак - ВНИВИ" против болезни Ауески 78
1. Контроль напряженности иммунитета после прививки свиней Изучение стабильности иммуногенных свойств вакцины в процессе хранения
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 83
ВЫВОДЫ 97
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
ПРИЛОЖЕНИЯ 135
- Краткая характеристика возбудителя болезни Ауески
- Материалы
- Определение безвредности радиоинактивированного вируса.
Введение к работе
1.1.Актуальность темы. Болезнь Ауески (псевдобешенство) Pseudorabies - является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний сельскохозяйственных и диких животных и наносит значительный экономический ущерб хозяйствам с развитым свиноводством (Сергеев В.А.,1993; Wittman G.etah, 1989; Gustafson P.D., 1970). Заболевание |. вызывается вирусом болезни Ауески (ВБА, Suid Herpesvirus 1, относящимся к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, род Varicellovirus (Мэрфи Ф.А., 1989). Летальный исход болезни наблюдается у поросят, у взрослых свиней сопроваждается установлением длительного или пожизненного носительства вируса. В определенных условиях латентный герпесвирус способен реактивироваться и животное вновь становится источником инфекции (Сергеев В.А., 1993; Моренков О.С., 2000; Wittman G.etal., 1989; Pietzarka G., 1991).
4j Отход молодняка свиней и пушных зверей при проявлении заболевания достигает 80-90% (Щелчков П.И., 1990; Сюрин В.Н. и др., 1991; Мищенко В.А. и др., 1995; Норе Н„ 1984; Barragry Т.В., 1991; Lipowsky A., Pejsak Z., 1996).
Создание иммунитета при болезни Ауески - очень сложный процесс (Лаптев Ю.В., Сергеев В.А., 1991). Гуморальный и клеточный иммунитет проявляется на 7-10 день после инфицирования или вакцинации животных, достигает пика через 30 дней и сохраняется в течение 5-6 месяцев '^ (Сергеев В.А.,1993). Вакцинированные свиньи оказываются только частичн защищенными и выделяют вирус при повторном инфицировании (Сергеев В.А., 1993; Thacker B.J. etal., 1992).
Следует отметить, что и спустя 40 лет после начала разработки и множества предложенных вакцинных препаратов, проблема создания эффективных защитных препаратов остается весьма актуальной. Это щ обусловлено особенностями патологии, эпизоотологии и иммунологии герпесвирусных инфекций, среди которых необходимо выделить следующие определяющие требования к современным вакцинам против БА: 1) способность герпесвирусов персистировать в макрофагах, лимфоцитах и нервных клетках, ингибировать их функции, повышать уровни IgE, простагландинов, стимулировать иммунопатологию, реакцию гиперчувствительности и оказывать на организм иммуносупрессивное действие; 2) латенция и персистенция ВБА в иммунном организме животного - экологическое свойство вируса, неразрывно связанное как с недостаточностью иммунной системы организма, обусловленное вирусом, так и экологическими факторами; 3) иммунопрофилактика снижает экономические потери от БА, но и порождает латентные формы и спорадическое течение, и распространение БА. Влияние вакцинации на персистенцию возбудителя инфекции, клиническую картину болезни и широкое ее распространение определяют ужесточение требований к эффективности вакцин против болезни Ауески.
Исходя из этого, вирус болезни Ауески занимает особое положение среди агентов латентной персистенции и проблема разработки и оценки новых профилактических средств защиты является первостепенной задачей.
1.2.Цели и задачи исследований. Целью исследования явилось экспериментальное изучение иммунобиологических свойств и научно-практическое обоснование эффективности применения радиоинактивированной вакцины "Гаммавак-ВНИВЙ" против болезни Ауески (в лабораторных и производственных условиях).
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: определить возможность конструирования инактивированной вакцины для свиней на основе отбора облученных у-лучами вирулентного или вакцинного штаммов вируса болезни Ауески; изучить иммуногенную активность радиоинактивированной вакцины против болезни Ауески на свиньях в лабораторных условиях; - установить условия применения радиоинактивированной вакцины с учетом сроков наступления иммунитета после одно- и двукратной вакцинации; - оценить эффективность радиоинактивированной вакцины против болезни Ауески на свиньях в производственных условиях; І.З.Научная новизна. Впервые разработана технология изготовления инактивированной гамма лучами культуральной вакцины "Гаммавак-ВНИВИ" против болезни Ауески. Получены экспериментальные данные об иммунобиологических свойствах инактивированной вакцины против болезни Ауески на свиньях различного возраста и на овцах. Установлена принципиальная возможность использования инактивированной вакцины против болезни Ауески для экстренной защиты сельскохозяйственных животных (свиньи и овцы) от болезни Ауески. Изучена продолжительность иммунитета у сельскохозяйственных животных при иммунизации инактивированной вакциной "Гаммавак-ВНИВИ" против болезни Ауески.
1.4.Практическая ценность. На основании результатов экспериментальных исследований в лабораторных и производственных условиях разработана НТД на применение инактивированной вакцины "Гаммавак-ВНИВИ", которая утверждена ГУВ Республики Татарстан в 2001г.
Эффективность вакцинопрофилактики с положительными результатами проверена в комиссионных испытаниях с участием районных ветспециалистов РТ.
Практическая реализация разработок определена следующими нормативно-техническими документами: - Методические рекомендации по изготовлению и применению радиоинактивированного антигена вируса болезни Ауески, утвержденные директором ВНИВИ 19 февраля 2002 года. - Временное наставление по применению инактивированной сухой культуральной вакцины "Гаммавак-ВНИВИ" против болезни Ауески, утвержденные начальником Главного управления ветеринарии Республики Татарстан 12 ноября 2001 года.
1.5.0сновные положения, выносимые на защиту:
Технология изготовления радиоинактивированной вакцины "Гаммавак-ВНИВИ" против болезни Ауески (псевдобешенства).
Иммунобиологические свойства инактивированной вакцины "Гаммавак-ВНИВИ" против болезни Ауески на различных видах животных.
Возможность использования инактивированной вакцины для экстренной защиты сельскохозяйственных животных (свиньи и овцы) от болезни Ауески.
Сроки наступления иммунитета и установление минимального уровня зашиты поголовья против болезни Ауески с целью определения стратегии вакцинопрофилактики болезни Ауески.
1.6. Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены и обсуждены на отчетных сессиях ВНИВИ (2001-2004), на международной научно-практической конференции посвященной 45-летию создания ВНИИЗЖ "Актуальные вопросы патологии животных" (Владимир,2003), на международной научно-практической конференции посвященной 80-летию ФГУП «Щелковский биокомбинат» "Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее" (Щелково,2004) и на объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург,2004) ІЛЛЇубликация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 6-ти печатных работах, в числе которых статья в журнале «Ветеринарная патология», "Временное наставление по применению сухой культуральной вакцины «Гаммавак-ВНИВИ» против болезни Ауески", "Методические рекомендации по изготовлению и применению радиоинактивированного антигена вируса болезни Ауески" и 2 работы сданы в редакцию журнала "Вопросы вирусологии".
1.8.0бъем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 18 таблицами. Указатель литературы содержит 210 отечественных и 120 иностранных источников.
Краткая характеристика возбудителя болезни Ауески
Болезнь Ауески (псевдобешенство, инфекционный бульварный паралич, зудящая чума, бешеная чесотка) - остро протекающее контагиозное вирусное заболевание животных, проявляющееся признаками поражения центральной нервной системы, органов дыхания, сопровождающееся сильным зудом и характерными расчесами на месте проникновения возбудителя (кроме свиней, норок и соболей). Слабовирулентные штаммы характеризуются вьфаженным пневмотропизмом при сравнительно слабом нейротропизме (Качанова СП., 1985; Куриленко А.Н., Крупальник В.Т., 1986; Сюрин В.Н. и др., 1998). Восприимчивы все виды сельскохозяйственных животных, пушные звери, грызуны и человек (Дроздов С.Г., Горин Н.С. и др., 1987; Конаржевский К.Е., 1991; Мищенко В.А. и др., 1994; Юсупов Р.Х., Угрюмова B.C. и др., 2003; Jentsch K.D., Apostoloff Е., 1970; Mravak S.et. al., 1987; Fleming В., 1990; Carol C.E., 1995; Takashima Y., Otsuka H., 2000). У свиней заболевание протекает без признаков зуда. Особенно тяжело болеют поросята-сосуны и отъемыши (Сюрин В.Н. и др., 1998). У поросят, зараженных внутриутробно или, в первые 10 дней после рождения, болезнь носит септический характер, такие поросята нежизнеспособны, не могут сосать, у них наблюдаются спазмы глотки, икота, слюнотечение (Камалова Н.Е. и др., 1995). Через 4-12 ч, а иногда через сутки после появления признаков болезни такие поросята обычно погибают. У новорожденных поросят бывает и апоплексическая форма болезни: внешне здоровый поросенок падает и в припадке судорог погибает (Братин Г.И., 1984). У поросят от 10 дней до 3-х месяцев первые признаки болезни - лихорадка (до 40-42 С) угнетение, слизистое истечение из носа. Затем появляются признаки поражения ЦНС: беспокойство, манежные движения. Больные поросята стремятся вперед, натыкаются на препятствия, упираются головой в стену или кормушку (Дудников А.И. и др., 1993).
Появляются судороги шейных и жевательных мышц, мышц позвоночника -прогибается спина. Нередко возникают припадки судорог (Юсупов Р.Х. и др., 2001). Поросенок падает и, лежа на боку, судорожно двигает конечностями, голова запрокинута, саливация усилена. У некоторых более выражено угнетение. Наступает паралич глотки, гортани, конечностей. Затем афония, из ротовой полости течет пенистая слюна, появляется одышка - следствие отека легких. Болезнь длится от нескольких часов до 3-х суток (Мищенко В.А. и др., 1995; Никитин М.Г., Базылев П.М., 1967; Gustafson P.D., 1970; Wittman G., 1991).
Переболевшие свиньи мало пригодны для откорма и непригодны на племя вследствие остаточных патологических явлений (Wittman G. et. al., 1989; Сергеев В.А„ 1993).
Инфицирование других восприимчивых животных - крупного рогатого скота, овец, кошек, собак, пушных зверей и др. практически всегда связано с заражением от больных свиней (Сергеев В.А., 1993; Камалова Н.Е. и др., 1995; Константинов А.В. и др., 2004; Gustafson P.D., 1970; Wittman G. et. al., 1989;
Wittman G., 1991). Лошади обычно не подвергаются естественному инфицированию, однако могут быть инфицированы экспериментально. Болезнь встречается во всех европейских странах, Южной и Северной Америке и Азии виде энзоотии и наносит значительный экономический ущерб, в особенности, при вспышке ее в свиноводческих и звероводческих хозяйствах (Уласов В., Ольшанская А., 1988; Моренков О.С. и др., 1994; Аминев АХ. и др., 1999; Зарипов М.М. и др., 2001; Cristensen L.S. et. al., 1990). Отход молодняка aсвиней и пушных зверей при проявлении заболевания достигает 80-90% (Щелчков П.И., 1990; Сюрин В.Н. и др., 1991; Мищенко В.А. и др., 1995; Норе Н., 1984; Barragry Т.В., 1991; Lipowsky A., Pejsak Z., 1996).
В организме животного вирус обычно внедряется посредством оранозального пути и первичная репликация вируса протекает в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей. После чего вирус распространяется по организму в свободной форме, либо посредством лимфоцитов, инфицированных вирусом (Юсупов Р.Х. и др., 1984; Gustafson P.D., 1970: Wittman G. et. al., 1989). Кроме этого, вирус проникает в нервные окончания тригеминальной и обонятельных систем и через них в ЦНС (Cowen P. et. al., 1990). Свиньи, переболевшие болезнью Ауески, становятся латентно инфицированными (Wittman G. et. al., 1983; Schoenbaum M.A. et. al., 1990), При этом животные остаются клинически здоровыми и не выделяют вирус. Инфекционный вирус также не выделяют из органов латентно инфицированных животных при исследовании (Лаптев Ю.В. и др., 1991).
Материалы
Выращивание вируса болезни Ауескн в культуре клеток. При выращивании вируса болезни Ауески, сформировавшийся монослой в стационарных сосудах заражали вирусом в разведении 1:30 к исходному объему хультуральной среды. Сосуды с зараженной культурой инкубировали при 37С в течение 1-1,5 часов, затем добавляли среду Игла с 2% сывороткой крови плодов коров или сывороткой крови кур и продолжали инкубировать при 37±0,5 С в течении 18-30 часов на культуре клеток НГУК-1 и 24-48 часов на культуре клеток ВНК-21, РК-15, ППЭО и СГГЭВ. Инфекционную активность вируса оценивали по методу Рида и Менча и выражали в культуральных инфекционных дозах lg ТЦ скмсыЗ.
Инактивация вируса БА. Инактивацию проводили в лаборатории радиационной патологии отдела радиобиологии ВНИВИ на гамма-установке «Исследователь», в которой источником ионизирующего излучения является радиоактивный изотоп мСо. Мощность экспозиционной дозы гамма-облучения в рабочей камере составляла в диапазоне от 10,04x10 2 Кл/(кг-с) до 2,87x10 2 Кл/(кг-с). Инактивацию проводили путем размещения материалов в рабочей камере установки с последующим переводом его в зону облучения на время, за которое облучаемый предмет получал заданную дозу по методу разработанному во ВНИВИ (Г.Х.Ильясова, Г.В.Конюхов, Р.Х.Юсупов др.,2002). Полноту инактивации вируса проверяли на чувствительной культуре клеток невриномы гассерова узла крысы (НГУК-1) при нанесении на монослой клеток инактивированного антигена в цельном виде и в разведениях от 1:2 до 1:16 по 0,1 мл, после чего во флаконы вносили питательную среду (без сыворотки). На каждое разведение использовали 8 флаконов и не менее 4 оставляли незараженными в качестве контроля. Инкубировали в термостате при 37С в течение 96 часов. Полное исключение размножения и цитопатогенного действия (ЦПД) вируса определяли путем трех последовательных пассажей инактивированного вируса.
Приготовление инактнвироваиной вакцины. К инактивированному вирусному сырью добавляли 30% кснмедона, тщательно перемешивали и подвергали лиофилизации.
Контроль на стерильность общей пробы вакцины проводили в соответствии с ГОСТом 280085-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности». Вакцину считали стерильной при отсутствии роста микрофлоры в посевах.
Определение безвредности вакцинного препарата испытывали на белых мышах, крысах, кроликах, овцах и поросятах. Дня этого инахтивированный и лиофилизированный вирус болезни Ауески ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе и вводили подопытным животным по 0,3-3,0 см3 в дозе 150 мг/кг, что составило не менее 3 прививочных доз. За животными вели клиническое наблюдение в течение 21 дня, наблюдали за местной реакцией в месте инокуляции вакцины с измерением температуры тела.
Оценка иммуногенности вакцины. Для оценки вакцины на иммуногенностъ использовали неиммунных серонегативных к вирусу болезни Ауески поросят и подсвинков массой 25-65 кг, овец массой 45-50 кг, которых прививали внутримышечно двукратно в объеме 3 см3 с интервалом 14 и 21 день. w За животными в течение всего периода опытов вели клиническое наблюдение с термометрией, определением динамики синтеза специфических вируснейтрализующих антител в РВН, а также исследованиями внутренних органов и головного мозга на вирусовыделение после контрольного заражения на чувствительных культурах клеток, иммуноферментным анализом (ИФА) и биопробой на кроликах.
Через 14, 21 сутки после вакцинации у всех иммунизированных животных индивидуально отбирали кровь и контролировали сыворотки на наличие антител к вирусу болезни Ауески в РВН, РНГА и ИФА. Обработку полученных результатов в ИФА и РНГА проводили согласно прилагаемым к тестам инструкциям. Вакцину считали иммуногенной, если титр антител не менее, чем у 80% вакцинированных животных через 14 и 21 сутки после вакцинации был не ниже, чем 3,5 log2 в РВН и РНГА и 7,5-9,0 log2 в ИФА.
Контрольное заражение вирулентным вирусом болезни Ауески проводили через 7, 14 суток, а также через 1, 3, 6 месяцев после повторно І иммунизации путем интрацеребрального или внутримышечного введения вируса в дозе 0,2x104 0 ЛД50 или 1,0x104 0 ЛДзо (штамм «Производственный» Арский) соответственно.
Определение безвредности радиоинактивированного вируса
В настоящее время представляет наибольший интерес использование ридостина-индуктора синтеза интерферона на основе натриевой соли дрожжевой двухцепочечной РНК (дцРНК), выделяемой из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, при его сочетанном использовании с инактивированными вакцинами (ИнВ) в качестве экстренной профилактики вирусных инфекций.
По данным Масычевой В.И. и др. (2003) ридостин применяется в клинике для профилактики и лечения таких инфекционных заболеваний, как рецидивирующий герпес, хламидиоз, грипп. Препарат обладает способностью усиливать синтез интерферонов разных типов, повышать функциональную активность макрофагов, нейтрофилов (Веревкина К.Н. и др., 1998). Исследованиями последних лет продемонстрированы противовирусный эффект, активация интерфероногенеза и макрофагов при местном применении ридостина (Масычева В.И. и др., 1997).
При псевдобешенстве (болезни Ауески) как и при других герпетических инфекциях с длительной персистенцией вируса, развиваются иммунодефицитные состояния, обусловленные недостаточностью отдельных звеньев иммунной системы (Цибулькин А.П., Ильясова Г.Ф. и др., 1998, 2002, 2004). Поэтому изучение препаратов, повышающих эффективность иммунной защиты при инфекции, вызываемой герпес вирусом болезни Ауески, является актуальной задачей.
Для повышения иммуногенной активности инактивированной вакцины против болезни Ауески и оценки влияния различных иммунотропных препаратов (ИМП) на организм прививаемого при их сочетанием применении с инактивированной вакциной использовали средства различного класса:
- ксимедон - (1,2 - дигидро — 4,6 - диметил - N - (р - оксоэтил) пиримидон - 2), синтезированный в институте органической и физической химии (ИОФХ) КНЦ РАН РФ и регистрированный в «Реестре лекарственных средств», 1999;
- полный адъювант Фрейнда (ПАФ), содержащий 0,85 см3 минерального масла, 0,15 см естественных восков, 1 мг/см убитых М. Tuberculosis;
- ридостин, индуктор интерферона на основе натриевой соли дрожжевой двуспиральный РНК (дс РНК), производства «Вектор - Фарм» (Новосибирск);
- вакцинное масло - марки ПЭС ЗМ, ТУ-6-02-4-5-98.
В опытах использовали 115 белых крыс, живой массой 180-200 г, 19 кроликов живой массой 2,5 кг, разделенных на группы по видам изучаемых стимуляторов иммуногенеза, и 10 белых крыс и 3 кролика оставались интактными. В качестве иммуногена применяли радиоинактивированную вакцину в дозе 50 мг/кг, введение которой проводили совместно с иммунотропными препаратами в определенной дозе: ксимедон - 30 мг/кг, ПАФ - белым крысам по 0,25 мл на голову, кроликам - 1,5 мл, ридостин - 10 мг/кг, вакцинное масло смешивали с прививочной дозой вакцины в соотношении 1:1 для всех испытуемых животных. Определение титров специфических антител проводили в РНГА и ИФА через 2 недели после I иммунизации животных и через 2 недели после И иммунизации опытных животных.
Как видно из представленных в таблицах данных, специфические антитела к вирусу болезни Ауески были выявлены у белых крыс, иммунизированных инактивированным вакцинным препаратом с адъювантами в титрах, превышающих контрольные данные в РНГА - 1,4-1,8 раза, в ИФА 2,8-2,9 раза. Такая же закономерность наблюдалась и у кроликов. Так, при однократной их вакцинации с иммунотропными препаратами титры специфических антител у опытных животных превышали в РНГА - в 2 раза, в ИФА - в 2,9 раза.
Повторное введение антигена с адъювантами стимулировало более высокую иммуногенность антигена. Так, через 2 недели после иммунизации, титр антител у кроликов, иммунизированных вакциной с адъювантами, превышал таковые у контрольных животных в РНГА — 2,9 раза и в ИФА - 4,4 раза,
В опытах отмечено существенное различие адъювантных свойств ксимедона, ПАФ и ридостина по сравнению с вакцинным маслом. При этом титр антител в сыворотке крови кроликов, регистрированных в иммуноферментном анализе, превышал в 2,5 раза таковые, полученные при введении вакцины с вакцинным маслом. На белых крысах существенных различий не было выявлено.
