Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Биология пятнистого оленя 7
1.2 Историческая справка 14
1.3 Эпизоотология туберкулеза пятнистых уссурийских оленей 16
1.4 Источники возбудителя инфекции 16
1.5 Механизм передачи возбудителя туберкулеза 20
1.6 Факторы влияющие на восприимчивость 23
1.7 Характеристика возбудителей туберкулеза и других микобактерий 25
1.7.1 Характеристика М. bovis 26
1.7.2 Характеристика М. tuberculosis 28
1.7.3 Атипичные микобактерий, их роль в природе 28
1.8 Методы диагностики' 31
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы исследований 35
2.2 Ретроспективный анализ по туберкулезу животных в Калининградской области 38
2.3 Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу животных в Багратионовском районе 42
2.4 Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу оленей в ОАО "Новосёловское" 44
2.5 Постановка диагноза на туберкулёз у пятнистого оленя в условиях ОАО "Новосёловское"
2.5.1 Постановка первичного диагноза 49
2.5.2 Клинический метод диагностики 54
2.5.3 Аллергический метод диагностики 55
2.5.4 Результаты патологоанатомического метода диагностики 62
Результаты ветеринарно-санитарной экспертизы и вскрытия 68
вынужденно убитых и павших рогачей в период 2005-2006 года
Результаты гистологических исследований на туберкулез 70
Результаты бактериологических исследований на туберкулез 72
1 Морфологические свойства возбудителя 74
2 Культурально-биохимические свойства возбудителя 74
3 Результат биопробы 80
4 Результат ПЦР 82
5 Система мероприятий при туберкулезе пятнистых уссурийских оленей на ферме ОАО «Новоселовское» Багратионовского района Калининградской области. 84
ВЫВОДЫ 99
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 101
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 102
ПРИЛОЖЕНИЕ 125
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на проводимые мероприятия эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в большинстве субъектов РФ по-прежнему остается напряженной. Это связано с увеличением заболеваемости туберкулезом взрослого населения, имеющего контакты с животными; повышением лекарственной устойчивости микобактерий; их способностью передаваться через животных других видов, в том числе диких экзотических животных являющихся носителями возбудителя туберкулеза; с изменчивостью патогенных свойств возбудителя, приводящей к вспышкам туберкулеза среди животных считающихся устойчивыми к туберкулезу (барсуков, опоссумов, оленей) (Урбан В.П., Шишков В.П., 1986 г, Овдиенко Н.П. 2004 г., Демкин Г.П., 2004, 2005; Луницын В.Г., 2000, 2006; Молев А.И., 2007 Schlisser Т., Bachmair К. 1957 и др.; Thoen и др., 1977; Collins Des. mond. М., 2003; Coley Peter, 2005; Trcka I., 2006; Delahay R.J., 2007).
Поэтому актуальным является изучение биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного от пятнистых уссурийских оленей, которые с целью сохранения как редкого и исчезающего вида были внесены в Красную Книгу (1974). Этому способствовала организация оленепарков в разных республиках СССР, в том числе и в Калининградской области. Мягкий климат, не слишком суровая зима, не очень широкие среднегодовые колебания температур положительно отразились на их разведении. Однако постоянные антропогенные воздействия на пятнистых оленей при доместикации повлекло за собой негативные явления. Содержание животных длительный промежуток времени в неволе, несменяемые пастбища, повышенная концентрация большого количества животных на ограниченных площадях, обрезание пант и другие факторы отрицательно влияют на иммунную систему, способствуют возникновению и распространению инфекционных и инвазионных болезней.
Поэтому не случайно в условиях Калининградской области несколько лет назад, впервые был зарегистрирован туберкулез пятнистых уссурийских
оленей.
Изучением проблем туберкулеза пятнистых оленей и маралов занимались как отечественные ученые С.Я. Любашенко, Е.П. Данилов, 1949 год; В.А. Новиков, 1950 год; О.В.Кроневальд, 2004 год; В.М. Шевнин, 2005 год; В.Г.Луницын, 1994, 2006 год; А.И.Молев, 2007 год; так и зарубежные исследователи С. David 1982; F. С. Griffmg 1986; M.V.Palmer, W.R. Waters 2001, 2002, 2004.
Так как туберкулез пятнистых оленей в условиях Северо-Запада был подтвержден впервые, то возникла научно-производственная необходимость детального изучения данной патологии.
Учитывая вышеизложенное, целью работы явилось изучение туберкулеза пятнистых уссурийских оленей в условиях Северо-Запада РФ. Задачи исследований:
Изучить особенности эпизоотологии туберкулеза пятнистых уссурийских оленей в условиях Северо-Запада РФ на примере Калининградской области.
Определить диагностическую ценность различных методов диагностики-эпизоотологического, клинического, патологоанатомического и бактериологического.
Установить характер течения инфекционного и эпизоотического процесса при туберкулезе пятнистых уссурийских оленей.
Разработать мероприятия по повышению эффективности диагностики и профилактики туберкулеза с учетом биологических особенностей оленей. Научная новизна. Изучены особенности эпизоотологии и установлен характер течения инфекционного процесса при туберкулезе пятнистых уссурийских оленей в условиях Калининградской области. Определена диагностическая ценность эпизоотологического, клинического, патологоанатомического и бактериологического методов исследования. Изучены морфологические и культурально-биохимические свойства выделенных микобактерий; их патогенность. Определены факторы, способствующие активному развитию инфекционного процесса. Дана оценка
влияния туберкулеза уссурийских пятнистых оленей на эпизоотическую ситуацию в Калининградской области.
Практическая значимость. Установленные особенности туберкулезной инфекции пятнистых уссурийских оленей в условиях Калининградской области позволили разработать схему диагностических исследований и комплекс мероприятий, направленных на повышение эффективности диагностики и профилактики туберкулеза.
Разработаны и утверждены на методическом заседании Научно-Координационного совета по животноводству и ветеринарии Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии (протокол № 2 от 10.09.2008г.) «Рекомендации по диагностике и профилактике туберкулеза пятнистых уссурийских оленей». Основные положения, выносимые на защиту:
1.Особенности инфекционного процесса при туберкулезе пятнистых уссурийских оленей.
2.Сравнительная оценка методов диагностики - эпизоотологического, клинического, патологоанатомического и бактериологического.
3. Научное обоснование комплекса мероприятий по повышению эффективности диагностики и профилактики туберкулеза пятнистых уссурийских оленей с учетом их биологических особенностей. Апробация работы. Основные положения и результаты исследований заслушаны и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007, 2008), конференции молодых ученых и студентов, посвященной 200-летию высшего ветеринарного образования в России и 200-летию СПбГАВМ (2008), международном научно-практическом конгрессе: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (СПб, 2006), в конкурсе на лучшую научную работу аспирантов и молодых ученых в номинации «Зоотехния и ветеринария» в Северо-Западном федеральном округе (СПб, 2008).
Личный вклад автора. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы. Автор провел мониторинг заболеваемости пятнистых уссурийских оленей в разных районах Калининградской области, выполнил комплексные научные исследования, произвел статистическую обработку результатов и проанализировал полученные данные.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи из списка журналов рекомендуемых ВАК Минобразования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация излагается на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов и результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 3 рисунками. Библиография включает 237 источников, в том числе 170 отечественных и 67 иностранных.
Биология пятнистого оленя
Пятнистый олень красивое дикое животное достигает высоты ПО см. Его летняя шерсть - светлая красновато-каштановая, на спине и боках испещрена красновато-желтыми пятнами. Зимняя шерсть одноцветная: темно-бурая на туловище, значительно светлее на голове, шее и плечах. Изредка на зимней шерсти видны следы пятен (1, 10, 45).
Для русских пределов первым этого оленя описал профессор Т. Ноак в (Брауншвейге) в 1891 году. Но еще раньше на его обитание в Южно-Уссурийском крае указал знаменитый исследователь средней Азии Н.М Пржевальский. В своей книге «Путешествие в Уссурийском крае» он говорит следующее: «По рассказам трех охотников и инородцев в месте обитания Аксиса в Южно-Уссурийском крае живет другой вид пятнистого оленя по величине занимающий положение между вышеописанным видом и изюбром».
Его летняя шкура ничем не отличается от шкуры аксиса, но зимой он имеет темно-бурую, на спине почти совершенно черную, шерсть с едва заметными белыми пятнами. Благодаря проведенным исследованиям Н.М. Пржевальского и Т. Ноака ученые делают вывод, что существует три разновидности пятнистых оленей. Т. Ноак пишет: « По-китайски - пятнистый олень называется «хва-лу», изюбр - «ма-лу», помесь, получаемая от скрещивания изюбра и пятнистого оленя, носит название у китайцев «Чин-да Гуйза». Это случайный гибрид оленя и изюбра действительно встречается в природе и Т. Ноак и Н.М. Пржевальский описывают его как отдельный вид.
С 1903 по 1918 годы Ю.М. Янковский проводил интересные опыты по скрещиванию самок-изюбров с самцами пятнистого оленя. Цель опытов -получение пантов больших размеров. Однако несмотря на незначительное увеличение животных в весе, размер пант остается без изменений. Ученый прекращает опыты и говорит о том, что метизация оленя методом поглощения крови изюбра кровью пятнистого оленя не целесообразна.
В дикой природе метизация происходит обратным путем. Гон изюбров, как и пятнистых оленей, совпадает по времени. Отмечаются случаи, когда самец изюбр, как более сильный, отбивает самок у пятнистого оленя.
Удачные эксперименты провел оленевод С. Я. Поносов. Однако он прекратил эту работу в силу того, что Библией запрещено производить смешение крови (2, 47).
Несмотря на появление гибридов, в Приморском крае в основном живет и размножается один вид пятнистого оленя - уссурийский. Это красивое и грациозное животное: высота - 100-110 см., обхват груди- 106-107 см., длина тела от затылка до хвоста- 114-133 см., длина туловища от плечелопаточного сустава до основания хвоста- 109-115 см., длина морды-31 см., длина ушей- 17 см., длина хвоста- 20 см., живой вес- 80-140 кг (121, 122).
Пятнистые олени, как самцы так и самки, имеют одинаковый окрас шерсти, который в зависимости от времени года очень резко меняется. С 15 мая олени принимают летний окрас шерсти, которая бывает кирпично-красная на верху шеи, на спине, на боках туловища, на передней лопатке. Брюхо, внутренние стороны ног светло-желтые, почти белые. Шея сбоку светло-серая с желтым оттенком, особенно по низу шеи. Лоб ржаво-красный, конец морды серый с желтоватым оттенком, покрыт тонкими волосами, напоминающими бархат. Такого же цвета наружные стороны ушей. Внутри уши белые, покрыты редким, длинным, белым волосом. На шее, начиная с затылка и вдоль хребта, идет черная полоса, переходящая на хвост. Хвост с внутренней стороны покрыт красной шерстью. По середине его черная полоса, переходящая на метелку хвоста. С внутренней стороны он голый, покрыт белой кожей. По всему туловищу рассеяны белые пятна, расположенные неправильными рядами. Летняя шерсть очень редкая, без всякого подшерстка. Длина волоса 2,5-3,0 см. Самцы имеют несколько более темный и более блестящий окрас по сравнению с самками (17, 36).
В конце августа в начале сентября олени меняют свой летний окрас на осенний. К этому времени летняя шерсть начинает выпадать и появляется густой подшерсток темно-серого цвета (стального). Смена происходит очень быстро. Олени из красно-пестрого вдруг делаются сизо-стального цвета, -который скоро начинает светлеть и переходит в зимний наряд. В зимнее время они имеют очень густую и длинную шерсть, особенно на шее и брюхе, размером от 50 до 70 мм. У самцов на шее отрастает грива. Глаза и копыта черные. Копыто самца больше, чем копыто самки. На спине у них шерсть темнее. По мере приближения к весне шерсть начинает приобретать желтый оттенок (18, 19,20).
Скелет оленя состоит из 7 шейный, 13 грудных, 6 поясничных, 5 крестцовых и 8 хвостовых позвонков и 13 пар ребер. Кости запястья имеются на передней конечности длина 7-8 см. При рождении олененок имеет 22 зуба. С возрастом их количество увеличивается до 34-х. У пятнистого оленя самки безрогие. На лобных костях черепа имеются костные выступы, представляющие собой основание, на котором впоследствии будут находиться рога, которые начинают расти в конце первого года жизни молодого самца-оленя.
Историческая справка
Туберкулез (tuberculosis) - хроническая инфекционная болезнь сельскохозяйственных, диких животных, птиц и человека, характеризуется развитием в различных органах и системах специфических узелков -туберкулов, склонных к творожистому распаду или обызвествлению, вызываемая микроорганизмами из рода микобактерий.
Самым первым возбудителем туберкулеза млекопитающих по всей вероятности был M.bovis. Эти микобактерий циркулировали исключительно среди теплокровных животных. Их широкому распространению способствовало приручение и разведение крупного рогатого скота, которое началось приблизительно 8000-10000 лет до н.э. (217).
Тесный контакт с домашними животными, использование в пищу продуктов животноводства, способствовало адаптации агента к организму человека и появлению M.tuberculosis, что по результатам археологических раскопок произошло приблизительно 5000 лет до н.э. После 1000 г. до н.э. происходит резкий рост легочной формы туберкулеза. Миграция индоевропейцев стала причиной заноса инфекции в Западную Европу и охватила весь Старый Свет.
В книге законов Ману (1400 лет до н.э.) приводятся неоспоримые доказательства, что болезнь передается от больного здоровому. Но экспериментальное подтверждение этому получили в XIX веке, когда Кленке и Виллемин (235) сумели воспроизвести на кроликах посредством впрыскивания патологического материала.
Решающим моментом в определении этиологии туберкулеза стало открытие Р. Кохом в 1882 году возбудителя (192). Им же была разработана техника окраски микобактерий. Возбудитель был выделен не только от человека, но и от разных видов животных (крупный рогатый скот, мелкий рогатый скот, лошади, обезьяны). Ученый считал их одним видом бактерий. Однако в последующем трудами Н.Ф. Гамалеи было установлено отличие возбудителя туберкулеза млекопитающих от возбудителей туберкулеза птиц. В 1901 году на Лондонском Конгрессе по изучению туберкулеза было заявлено о существовании трех типов микобактерий туберкулеза теплокровных животных: -человеческого, бычьего и птичьего.
В последующие годы от людей и животных из объектов внешней среды, воды, продуктов питания стали выделять микобактерий отличающиеся от возбудителя туберкулеза; на сегодняшний день их насчитывается более 80 видов, разделенных на потенциально-патогенных, сапрофитов, скотохромогенных и фотохромогенных, медленнорастущих и быстрорастущих.
Атипичные микобактерий нередко выделяются от клинически здоровых и больных туберкулезом людей (72). Инфекционные заболевания вызываемые у человека микобактериями, отличающихся от микобактерий туберкулеза и лепры, объединены под общим названием микобактериозы. Для установления диагноза микобактериоза необходимо многократное выделение одних и тех же микобактерий, отсутствие в посевном материале возбудителя туберкулеза и наличие выраженных симптомов заболевания (188). Диагностика микобактериозов исключительно бактериологическая и основана на повторном выделении колоний одного и того же вида атипичных микобактерии.
В последнее время как в отечественной, так и в зарубежной литературе появилось много сообщений о выделении от реагирующих на туберкулин сельскохозяйственных и диких животных атипичных микобактерии и кислотоустойчивых сапрофитов. У животных при патологоанатомическом и гистологическом исследованиях не находили специфических изменений в 18,6-30,8% случаев (43, 71, 99, 211). Часто находили не туберкулезные микобактерии в молоке, масле, злаках, овощах, фруктах (203), которые, по мнению авторов, могут попадать в организм больного вместе с пищей.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в период с 2005 по 2008 год на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».
Для изучения туберкулеза пятнистых уссурийских оленей был использован комплексный метод, включающий эпизоотологический, аллергический, клинический метод, патологоанатомический, и бактериологический методы диагностики.
Изучали первичную отчетную ветеринарную документацию и анализировали и полученные результаты собственных исследований.
Аллергическую диагностическую пробу с целью выявления зараженных туберкулезом животных на разных стадиях инфекционного и эпизоотического процессов. В ходе проведения аллергических исследований нами было установлено, что механически переносить методику исследований с крупного рогатого скота на пятнистых оленей не возможно, поэтому приходилось ее совершенствовать и корректировать. Для проведения таких исследований животных прогоняли через раскол, боксы и панторезный станок при дневном свете. Процедура эта трудоемкая и опасная, так как животные агрессивны и могут наносить увечья обслуживающему персоналу. С целью изучения характера аллергических реакций и определения наиболее благоприятного времени года для их проведения, выявления максимального количества зараженных туберкулезом животных исследования проводили весной, летом, осенью и зимой. Для внутрикожной туберкулиновой пробы использовали сухой очищенный ППД для млекопитающих. Туберкулин вводили внутрикожно в дозе 0,2 мл безыгольным инъектором в область шеи. На месте введения образовывалась горошина. Шерсть выстригали непосредственно перед введением, обрабатывали 70% спиртом. Туберкулин вводили однократно, реакцию учитывали через 72 часа, прогоняя животных повторно через панторезный станок. Реакции учитывали по утолщению кожной складки, отечности и болезненности. Животных считали реагирующими при утолщении кожной складки на 3 мм и более. Аллергические исследования проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза» утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 2002 году. Всего исследовано 572 рогача первично и 176 повторно. Специфичность внутрикожной туберкулиновой пробы подтверждалась результатами патологоанатомических и бактериологических исследований с использованием ПЦР -диагностики.
Патологоанатомические исследования проводили в условиях оленефермы на убойном пункте. Вскрытию подвергали выбракованных уссурийских пятнистых оленей по клиническим признакам, по возрастным показателям, при снижении продуктивности, положительно прореагировавших на внутрикожное введение туберкулина, а также павших рогачей за весь период исследования. Всего было подвергнуто диагностическому убою - 50 реагирующих на туберкулин, 68 рогачей по причине санитарного брака, 56 - павших рогачей.
По результатам вскрытия проводили ветеринарно-санитарную экспертизу рогачей, определяли и изучали характер патологоанатомических изменений, определяли возможные пути заражения и выделения возбудителя туберкулеза. Определяли особенности проявления туберкулезной инфекции у пятнистых уссурийских оленей в условиях Калининградской области.
Гистологические исследования проводили по общепринятой методике. Изучено 153 гистосреза от 34 рогачей. Исследуемый патологический материал (кусочки лимфоузлов, паренхиматозных органов) помещали в 10% раствор формалина и выдерживали при комнатной температуре 3-5 суток. Из фиксированного патологического материала готовили гистосрезы. Для этого их промывали в течение 2-3 часов в проточной воде, подвергали целлоидиновой или парафиновой проводке, окрашивали гематоксилин-эозином или по Циль-Нильсену.
Бактериологическим исследованиям подвергли пробы патологического материала отобранного от 34 рогачей реагировавших на аллергические диагностические пробы, 5 проб от выбракованных по причине санитарного брака и подвергнутых диагностическому убою, 4 от трупов павших рогачей. Всего исследовано 43 пробы.
