Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы. Наиболее патогенным и значимым видом микоплазм у крупного рогатого скота является возбудитель контагиозной плевропневмонии КРС (mycoides subsp. mycoides Mmm-SC тип), который входит в кластер Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. В антигенном отношении они имеют сродство с микоплазмами М. mycoides subsp. mycoides (Mmm-LC тип), которые вызывают пневмонию у коз, а также М. sp. группы 7, вызывающие маститы и урогенитальные инфекции у коров. Отличить их в серологических реакциях невозможно (DaMassa A.J. и соавт.,1992).
Актуальность вопроса возрастает в связи с продолжающимся расширением современного ареала болезни. В Португалии после длительного благополучия (с 1956 года) в 1983 году было зарегистрировано сразу 1507 случаев заболевания крупного рогатого скота. Возникновение КПП в Италии (1990-1991 гг.) произошло после почти 100-летного перерыва. В условиях наличия и дальнейшего расширения обширных торгово-экономических связей России с зарубежными государствами существует постоянная угроза заноса возбудителя и возникновения болезни в нашей стране.
Непосредственное выделение микоплазм от больных животных при естественных и экспериментальных инфекциях удается осуществить с большим трудом и в основном в остром периоде заболевания. Однако, используемые для выделения микоплазм методы, обладая рядом определенных преимуществ (специфичность, воспроизводимость), не лишены и существенных недостатков (низкая чувствительность и производительность, трудоемкость и длительность). Поэтому совершенствование средств и методов диагностики и дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС с целью выяснения возможного источника
заноса инфекции остается актуальной проблемой. Данные литературы свидетельствуют также о том, что фенотипические признаки бактерий могут широко варьировать в зависимости как от условий культивирования, так и от аллельного состояния ответственных за экспрессию генов (Altwegg М., 1995; Kempf I., 1997). Поэтому наиболее консервативной структурой, характеризующей вид микроорганизма остается его геном. В этой связи основанная на характеристике генома возбудителя диагностика представляется наиболее перспективной.
Определение геномного полиморфизма полевых изолятов и других микоплазм из кластера М. mycoides subsp. mycoides на основе использования метода RAPD-fingerprint позволил дифференцировать патогенные микоплазмы (Kobayashi Н.и соавт.,1996; Geary S.J. и соавт.,1996). Кроме того, в научной литературе имеются сообщения, свидетельствующие о том, что различия, обнаруженные в вариабельных участках 16 S рРНК, могут быть использованы для дифференциации различных штаммов возбудителя КПП КРС (Ros Barcunana С. И., 1994). Указанные обстоятельства послужили основной предпосылкой для разработки более чувствительных и специфичных средств и методов диагностики КПП КРС.
Поэтому нами были проведены исследования по оценке возможности дифференциации различных штаммов возбудителя КПП КРС от других представителей рода Mycoplasma с помощью метода ПЦР.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований явилось проведение сравнительного анализа генома различных штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии на основе полимеразной цепной реакции.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи;
- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной
цепной реакции для идентификации возбудителя КПП КРС;
- провести генотипирование вакцинных и эпизоотических штаммов
возбудителя КПП КРС на основе анализа гипервариабельных
последовательностей хромосомной ДНК;
-провести сравнительный анализ генома с помощью метода рибо-типирования с целью дифференциации штаммов возбудителя КПП КРС;
- разработать тест-систему на основе полимеразной цепной реакции для
выявления микоплазменной контаминации клеточных культур, сывороток
и вакцин.
1.3. Научная новизна работы. Впервые изучен геномный полиморфизм вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота на основе анализа вариабельных участков хромосомной ДНК. Определены праймеры и разработаны условия постановки ПЦР, позволяющие дифференцировать возбудитель контапіозной плевропневмонии крупного рогатого схота от других видов микоплазм.
Показана возможность дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом риботипирования .
1.4. Практическая значимость. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработаны методы идентификации и дифференциации возбудителя КПП КРС на основе анализа генома , которые могут быть рекомендованы для включения в схему и порядок лабораторных исследований с целью диагностики и выяснения возможного источника возникновения инфекции. Предложенные методы RAPD-fingerprint и риботипирования генома возбудителя разных штаммов КПП КРС могут быть использованы
для дифференциации штаммов и изолятов и паспортизации
производственных штаммов, а также для контроля за изменениями вакцинных вариантов в процессе их хранения и культивирования. 1.5. На защиту выносятся следующие положения:
результаты изучения геномного полиморфизма хромосомной ДНК эпизоотических и вакцинных штаммов возбудителя КПП КРС методами риботипирования и RAPD-fingerprint;
результаты разработок полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителя КПП КРС с использованием праймеров, комплементарных вариабельным областям рРНК возбудителя КПП КРС;
- результаты исследований по выявлению ДНК микоплазм в биопрепаратах методом ПЦР.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-1997 г.г. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями.
1.6. Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на научных конференциях: ВНИиТИБП, Щелково 1996, МГАВМиБ имени К.И.Скрябина 1996, а также на заседании Ученого совета ВНИИВВиМ 1996 г.
1.7. Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в материалах научных конференций.
1.8. Объем и структура работы.
Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 212 отечественных и зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 18 рисунками.
